Summary
हम यहाँ एक तकनीक है कि अब नियमित stably बाध्य ribosome नवजात श्रृंखला परिसरों (RNCs) के अलग किया वर्णन. इस तकनीक को खोज की है कि एक 17 एमिनो एसिड लंबे समय SECM गिरफ्तारी "अनुक्रम" एक prokaryotic में में अनुवाद बढ़ाव को रोकने सकता है का लाभ लेता है (
Abstract
व्यापक अनुसंधान पर्याप्त सुझाव है कि सेल में प्रोटीन तह एक सह translational 1-5 प्रक्रिया के सबूत प्रदान की गई है. हालांकि, सही मार्ग है कि पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला सह translational तह करने के लिए अपने कार्य रूप को प्राप्त करने के दौरान इस प्रकार है अभी भी एक पहेली है. आदेश में इस प्रक्रिया को समझने के लिए और सह translational तह मध्यवर्ती के सटीक रचना का निर्धारण, यह आवश्यक है तकनीक है कि पूर्व निर्धारित आकार के नवजात श्रृंखला ले जाने के लिए उनके आगे संरचनात्मक विश्लेषण की अनुमति RNCs के अलगाव की अनुमति विकसित.
SECM (स्राव मॉनिटर) एक 170 एमिनो एसिड ई. कोलाई प्रोटीन है कि SECM - Seca 6 operon में बहाव Seca ATPase (स्राव ड्राइविंग) की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है. Nakatogawa और यह मूल रूप में पाया गया कि सी टर्मिनल SECM प्रोटीन के क्षेत्र में एक 17 एमिनो एसिड लंबे समय अनुक्रम (150-FSTPVWISQA QGIRA जी पी 166) पर्याप्त और करने के लिए आवश्यक हैSECM बढ़ाव की Gly165 पर रोकने, जिससे उत्पादन peptidyl - glycyl-tRNA stably पी साइट ribosomal 7-9 करने के लिए बाध्य हो. इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह पाया गया कि इस 17 अमीनो एसिड अनुक्रम लगभग किसी भी पूरी लंबाई और / या छोटा इस प्रकार पूर्व निर्धारित 7 आकार के नवजात चेन ले जाने RNCs के उत्पादन की अनुमति प्रोटीन की सी टर्मिनस से इनकार किया जा सकता है. इस प्रकार, जब जुड़े हुए या लक्ष्य प्रोटीन में डाला, SECM रोकने अनुक्रम पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला बढ़ाव की गिरफ्तारी का उत्पादन और दोनों vivo में और स्थिर RNCs ई. में उत्पन्न कोलाई कोशिकाओं और सेल मुक्त प्रणाली में इन विट्रो में. Sucrose ढाल centrifugation आगे RNCs अलग उपयोग किया जाता है.
पृथक RNCs सह translational तह मध्यवर्ती के संरचनात्मक और कार्यात्मक सुविधाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हाल ही में, इस तकनीक को सफलतापूर्वक किया गया है कई ribosome बाध्य नवजात 10,11 श्रृंखला की संरचना में अंतर्दृष्टि लाभ के लिए इस्तेमाल किया. यहाँ हम गोजातीय गामा बी crystallin के अलगाव का वर्णन SECM के लिए जुड़े हुए RNCs और इन विट्रो अनुवाद प्रणाली में एक में उत्पन्न.
Protocol
1. डीएनए खाका और इन विट्रो प्रतिलेखन में तैयार
- ब्याज की जीन किसी भी T7 और / या जैसे SP6 प्लाज्मिड आधारित प्रमोटर में क्लोन है. ब्याज की RNCs प्राप्त पॉलीपेप्टाइड लक्ष्य के सी - टर्मिनस SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7 की गिरफ्तारी उत्प्रेरण अनुक्रम जोड़कर बढ़ाया है. सुनिश्चित करने के लिए कि ब्याज की पॉलीपेप्टाइड टुकड़ा ribosomal सुरंग के बाहर निकालना होगा, सी टर्मिनल लक्ष्य प्रोटीन का हिस्सा कम से कम 30 अमीनो एसिड 12-14 करके बढ़ाया जा. Glycine - सेरीन लचीला अमीर linker प्रोटीन और SECM गिरफ्तारी के अनुक्रम के बीच पेश किया जा सकता है किसी भी संभव गठनात्मक की कमी से बचने के लिए.
- के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में, टेम्पलेट डीएनए प्रतिबंध एंजाइम काटने ओआरएफ के बहाव के साथ linearized किया जाना चाहिए. एक agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पर प्रतिबंध पाचन उत्पाद चलाकर प्लास्मिड डीएनए की पूरी linearization को सत्यापित करने की जरूरत है.
- linearized प्लाज्मआईडी इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में आगे के लिए इस्तेमाल किया जाता है. टेम्पलेट डीएनए के विभिन्न एकाग्रता के इष्टतम डीएनए के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में एकाग्रता की आवश्यकता की पहचान के लिए परीक्षण किया जा सकता है. आम तौर पर Ambion MEGAscript उच्च उपज ट्रांसक्रिप्शन किट (Ambion / जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY) के साथ, 1 μg linearized डीएनए विट्रो प्रतिलेखन में पैदावार 40-60 μg mRNA के निर्माता के अनुदेश (Ambion / जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY) के बाद किया जाता है. .
- विट्रो प्रतिलेखन के बाद, mRNA के निर्माता के अनुदेश (Ambion MEGAscript उच्च उपज ट्रांसक्रिप्शन किट, Ambion / जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY) के अनुसार लिथियम क्लोराइड तेज़ी द्वारा शुद्ध होता है.
- mRNA के अखंडता और acrylamide का उपयोग कर या agarose जैल वैद्युतकणसंचलन द्वारा सत्यापित है.
2. इन विट्रो अनुवाद
के लिए इन विट्रो अनुवाद का उपयोग RTS 100 ई. कोलाई हरियाणा किट (5 प्रधानमंत्री, Gaither मेंsburg, एमडी) नीचे दिए गए चरणों का पालन करें:
- में इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रिया निम्नलिखित निर्माता के अनुदेश के 100 μl तैयार. संक्षेप में, nuclease मुफ्त पानी में 24 μl एमिनो एसिड मिश्रण ऋण methionine (1 मिमी), Ribonuclease एफडीए की 10 इकाइयों (Invitrogen / जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY), 20 रेडियोधर्मी की μCi [35 एस] (Methionine सांसद Biomedicals जोड़ने के लिए, सोलोन,), 20 μl रिएक्शन मिश्रण, 24 μl पुनर्गठन बफर और ई. के 24 μl कोलाई lysate.
- 30 ° C पर गर्म अनुवाद प्रतिक्रिया पूर्व 5 मिनट के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं. अनुवाद प्रतिक्रिया और 10-15 मिनट के लिए 30 ° सी में सेते हैं mRNA की 1-2 μg जोड़ें.
- बर्फ पर प्रतिक्रिया अनुवाद रखकर प्रतिक्रिया बंद करो.
3. नवजात polypeptide के इन विट्रो अनुवाद रिएक्शन में से अलगाव
- RNCs अलग हैं, अनुवाद 5-30% sucrose के ढाल के 4.5 मिलीग्राम के शीर्ष पर प्रतिक्रिया 20 मिमी HEPES के KOH 7 पीएच में स्तरित है0.5, 15 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 1 मिमी डीटीटी और 41,000 rpm के SW55 - तिवारी के Beckman कल्टर रोटर का उपयोग करते हुए, 4 ° C 2 बजे के लिए Centrifuged.
- Centrifugation के बाद, sucrose के ढाल करने के लिए अलग ribosomal आबादी और संबद्ध नवजात चेन को अलग fractionated है. जुदाई सतत रिकॉर्डिंग के साथ 254 एनएम पर एक ISCO UA-6 absorbance के डिटेक्टर का उपयोग ISCO निर्देशयोग्य घनत्व ढाल प्रणाली का उपयोग कर रखी है.
- अंश (ओं) को 70 ribosomes युक्त एकत्र कर रहे हैं और प्रयोग करने के उद्देश्य के आधार पर विश्लेषण.
4. प्रोटीन का अवलोकन करने के लिए Tris tricine एसडीएस पृष्ठ के साथ ribosome बन्धे
करने के लिए जाँच, चाहे SECM विस्तारित प्रोटीन ribosome 70 से जुड़े रहता है, ढाल भिन्न एकत्र किया गया और के रूप में इलाज किया:
- प्रत्येक अंश में प्रोटीन 10% के अंतिम एकाग्रता trichloroacetic एसिड (TCA) जोड़ने से उपजी गया था और 4 ° सी overni में incubated रहेght.
- रात भर ऊष्मायन के बाद, नमूने +१४,००० एक्स जी 15 गोली मिनट प्रोटीन के लिए Centrifuged गया. निम्नलिखित centrifugation सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया था और गोली के एसीटोन युक्त समाधान के साथ दो बार धोया: 1 मिमी Tris - एचसीएल पीएच 7.6 (4:01). गोली था आगे हवा सूखे और एसडीएस पेज लोड हो रहा है बफर में भंग.
- इलाज नमूना हल और Tris tricine एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया था.
- , जैल वैद्युतकणसंचलन के बाद तय किया गया, निर्वात जेल डायर का उपयोग और autoradiography के अधीन सूखे. नवजात polypeptides का वितरण phosphoimaging का उपयोग कर मनाया गया.
5. प्रतिनिधि परिणाम
यहाँ हम एक पूर्ण लंबाई गोजातीय गामा बी stably ribosome 70 के लिए बाध्य crystallin के अलगाव का वर्णन प्रयोग चित्रा 1 मौजूद है. गोजातीय गामा बी crystallin RNCs के अलगाव में शामिल कदम दर्शाया गया है. Crystallin गामा बी सी टर्मिनस कुल 32 अमीनो एसिड टी द्वारा बढ़ा दी गईओ कि ribosomal सुरंग के पूर्ण लंबाई प्रोटीन बाहर extrudes सुनिश्चित, यह भी SECM रोकने पॉलीपेप्टाइड संलयन की बहुत सी टर्मिनस पर रखा अनुक्रम में शामिल हैं. इन विट्रो में अनुवाद में निम्नलिखित, 70 ribosomes sucrose के ढाल centrifugation (2.1 चित्रा) द्वारा अलग किए गए. आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रोटीन stably ribosome के लिए बाध्य रहता है, भिन्न युक्त 70 जमा किया गया, desalted बफर, विमर्श और sucrose के ढाल centrifugation की एक अतिरिक्त दौर (2.2 चित्रा) के अधीन है. चित्रा 2 में प्रस्तुत परिणाम स्पष्ट रूप से पता चलता है कि SECM कुशलतापूर्वक गामा बी crystallin RNCs translational गिरफ्तारी पैदा कर सकते हैं.
आकृति 1. RNCs के अलगाव में शामिल कदम की योजनाबद्ध विवरण गोजातीय गामा बी crystallin के सी टर्मिनस 32 अमीनो एसिड अनुक्रम के द्वारा बढ़ाया गया था. इस विस्तारितसी टर्मिनल क्षेत्रों भी SECM गिरफ्तारी अनुक्रम में शामिल हैं. SECM अनुक्रम के साथ गामा - बी crystallin के 2.3 pIVEX (T7 आधारित) प्लाज्मिड में क्लोन किया गया था. के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में टेम्पलेट डीएनए XbaI से में linearized किया गया था. Linearized टेम्पलेट आगे के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में इस्तेमाल किया गया था. डीएनए टेम्पलेट में T7 T7 शाही सेना पोलीमरेज़ कि T7 प्रमोटर गामा बी crystallin जीन नीचे की ओर स्थित transcribes द्वारा मान्यता प्राप्त है. mRNA के लिथियम क्लोराइड तेज़ी विधि का उपयोग कर शुद्ध किया गया था. शुद्ध mRNA के लिए इन विट्रो में अनुवाद में इस्तेमाल किया गया था. निम्नलिखित ऊष्मायन, अनुवाद प्रतिक्रिया 5-30% sucrose के ढाल के शीर्ष पर स्तरित किया गया था और 2 घंटे के लिए 41,000 rpm के, 4 डिग्री सेल्सियस पर Beckman कल्टर SW55 - तिवारी रोटर में Centrifuged.
चित्रा 2. गोजातीय गामा बी crystallin के अलगाव stably 70 ribosome के लिए बाध्य RNCs. 1 μg mRNA के 100 ई. μl प्रतिक्रिया में मिलाया गया था कोलाई S30 निकालें सिस्टम के रूप में 20 μCi [35 एस] के साथ प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख Methionine और 30 ° सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए incubated रहे. निम्नलिखित ऊष्मायन, अनुवाद प्रतिक्रिया 5-30% sucrose के ढाल के शीर्ष पर 20 मिमी HEPES - KOH 7.5 पीएच, 15 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 1 मिमी डीटीटी में स्तरित किया गया था और 41,000 के Beckman कल्टर SW55 - तिवारी रोटर में Centrifuged rpm, 4 ° C 2 घंटे के लिए. वेग अवसादन के बाद, ढाल उतार दिया गया था और ribosome समर्थक ले प्राप्त हुई थी. डेटा PeakTrak कार्यक्रम (ISCO ढाल घनत्व ढाल fractionation प्रणाली) द्वारा दर्ज किए गए. Fractions एकत्र किए गए थे, प्रोटीन TCA उपजी और हल टी पर 16.5%, 6% सी Tris-टीricine पृष्ठ 15 जेल. जेल सूखे और autoradiography के लिए उजागर किया गया था. जोखिम के बाद जेल आंधी 9410 इमेजिंग स्कैनर का उपयोग कर स्कैन किया गया 2.1 चित्रा से पता चलता है कि पूरी लंबाई गामा बी crystallin ribosome भिन्न 70 में मौजूद है. इस प्रकार, SECM रोकने अनुक्रम स्थिर गोजातीय गामा बी crystallin RNCs के अलगाव की अनुमति देता है. 2.2 चित्रा में डेटा स्पष्ट रूप से संकेत मिलता है कि पृथक RNCs को वास्तव में स्थिर कर रहे हैं. वर्तमान प्रयोग में सूक्रोज ढाल centrifugation की पहले दौर के बाद 70 भिन्न जमा थे और sucrose के अल्ट्रा-4 केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट (Millipore) Amicon, 20 मिमी युक्त HEPES - KOH 7.5 पीएच, 15 मिमी समाधान में बफर विनिमय के बाद हटा दिया गया था 2 MgCl, 100 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 1 मिमी डीटीटी. यह नमूना आगे 5-30% sucrose के ढाल और fractionated के माध्यम से एक centrifugation के अतिरिक्त दौर के अधीन था. प्रत्येक अंश का इलाज किया गया था और जैसे 2.1 चित्रा में विश्लेषण किया.
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Discussion
प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम है, और इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए इस्तेमाल किया घटकों की गुणवत्ता एकाग्रता के लिए महत्वपूर्ण हैं. हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद के अर्क में इस्तेमाल किया है और वे कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देते हैं, अगर ध्यान से संभाला. MRNA की गुणवत्ता अनुवाद को प्रभावित कर सकते हैं, तो यह अत्यंत महत्व का है यह इन विट्रो में अनुवाद के लिए उपयोग करने से पहले mRNA की अखंडता का परीक्षण है. इन विट्रो में अनुवाद के लिए ऊष्मायन समय प्रोटीन की लंबाई के साथ बदलता रहता है. इसके अलावा, समय / centrifugation की गति के अनुसार समायोजित किया जा सकता है, के मामले में, 70 ribosomal अंश अच्छी तरह से हल नहीं है और 50 के दशक से अलग है. इसके अलावा, ribosome बाध्य प्रोटीन परिसरों ध्यान से संभाला जाना चाहिए RNase संक्रमण से बचने. इसके अलावा, बफर स्थितियों को ध्यान से निगरानी की जानी चाहिए और chelating एजेंट है कि 2 मिलीग्राम कीलेट + बचा जाना चाहिए.
SECM गिरफ्तारीअनुक्रम, पर इसके अनुवाद के L4 ribosomal प्रोटीन और L22 ribosomal 7,8 सुरंग में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 23S rRNA के साथ interacts. महत्वपूर्ण अवशेष, SECM गिरफ्तारी आकृति के गठन की एक संख्या, एफ XXXX WI XXXX GIRAGP 7 (बोल्ड प्रकार में) बहुत महत्व के हैं, translational गिरफ्तारी की दक्षता सुनिश्चित करने. परिवर्तन, या इन महत्वपूर्ण अवशेषों का विलोपन अनुवाद बढ़ाव 7,8 गिरफ्तारी की राहत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस प्रकार, SECM गिरफ्तारी के मूल भाव के अनुक्रम को बनाए रखने एफ XXXX के का WI XXXX GIRAGP 7 बरकरार पूरी तरह से सुनिश्चित करें कि अध्ययन के तहत प्रोटीन रहेगा stably ribosome के लिए बाध्य करने के लिए महत्वपूर्ण है.
इस तकनीक सह translational मध्यवर्ती और सह translational विभिन्न प्रोटीन की तह की संरचना के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह हाल ही में किया गया है सफलतापूर्वक करने के लिए सही संरचना का निर्धारण कियाच 10-11 एनएमआर की मदद से कई ribosome बाध्य नवजात चेन. इसके अतिरिक्त, इस तकनीक को भी गौण प्रोटीन, cofactors या ligands के साथ अपने तृतीयक बातचीत के के विश्लेषण के लिए पूर्व निर्धारित आकार के नवजात पेप्टाइड्स उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
RNCs परिसरों का निर्माण करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण छोटा स्टाप codon कमी mRNAs का उपयोग शामिल होगा. इस दृष्टिकोण को व्यापक रूप से कई शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है अध्ययन करने के लिए सह translational प्रोटीन तह 12,16 जैसे देखना. हालांकि, यह कमियों के एक नंबर है. इस दृष्टिकोण में vivo में नियोजित नहीं कर सकते हैं और भी ई. के साथ इन विट्रो में उपयोग के लिए समस्याग्रस्त ई. में उपस्थिति के कारण कोलाई निकालने SsrA प्रणाली की कोलाई कि mediates सी टर्मिनल पेप्टाइड टैग (AANDENYALAA) के फ्रेम रोक codons बिना mRNAs से अनुवाद, उनके 17 गिरावट के लिए अग्रणी प्रोटीन के अलावा. इसलिए, बाद में मामले में, एक के लिए एक पूरी तरह से उपयोग reconstiप्रणाली tuted और / या एक प्रणाली है, कमी / दबा मशीनरी SsrA टैगिंग. SECM निर्देश रोकने कुशल और अद्वितीय है के रूप में यह लगभग इसी तरह 18 दक्षता के साथ और इन विट्रो में vivo में रुक ribosome परिसरों का उत्पादन सिद्ध किया गया है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम RGP0024 अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
