Summary
Descriviamo qui una tecnica che viene ora utilizzato di routine per isolare complessi ribosoma stabilmente legati a catena nascente (RNC). Questa tecnica sfrutta la scoperta che un 17 aminoacidi lungo "sequenza di arresto" SECM può fermare l'allungamento traduzione in un procariota (
Abstract
Numerose ricerche hanno fornito ampie evidenze che suggeriscono che le proteine ripiegare nella cellula è un processo di co-traslazionale 1-5. Tuttavia, il percorso esatto che segue catena polipeptidica durante la co-traslazionale pieghevole per raggiungere la sua forma funzionale è ancora un enigma. Per comprendere questo processo e di determinare l'esatta conformazione degli intermedi pieghevoli co-traslazionale, è necessario sviluppare tecniche che consentono l'isolamento di RNC trasportano nascenti catene di dimensioni predeterminate per consentire loro ulteriori analisi strutturale.
SECM (monitor secrezione) è un aminoacido 170 E. coli proteina che regola l'espressione della valle Seca (guida secrezione) ATPasi nel SECM-seca operone 6. Nakatogawa e Ito originariamente scoperto che una sequenza amminoacidica 17 lungo (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) nella regione C-terminale della proteina SECM è sufficiente e necessariocausare lo stallo di allungamento SECM a Gly165, producendo così peptidil-glicil-tRNA stabilmente legata alla ribosomiale P-site 7-9. Ancora più importante, è stato trovato che questa sequenza amminoacidica 17 lungo può essere fusa al C-terminale di qualsiasi proteina a lunghezza intera e / o troncato permettendo la produzione di RNC trasportano nascenti catene di dimensioni predeterminate 7. Così, quando fuse o inserito nella proteina bersaglio, la sequenza SECM stallo produce arresto del l'allungamento della catena polipeptidica e genera RNC stabili in vivo sia in E. coli e in vitro in un sistema acellulare. Centrifugazione in gradiente di saccarosio è inoltre utilizzata per isolare RNC.
I RNC isolati possono essere utilizzati per analizzare le caratteristiche strutturali e funzionali degli intermedi pieghevoli co-traslazionale. Recentemente, questa tecnica è stata utilizzata con successo per acquisire conoscenze nella struttura di alcune catene di ribosoma legati nascenti 10,11. Qui si descrive l'isolamento di bovino Gamma-B sonoro superiore cristallino RNC fusa SECM e generato in un sistema di traduzione in vitro.
Protocol
1. Preparazione del DNA template e trascrizione in vitro
- Il gene di interesse viene clonato in qualsiasi T7 e / o ad esempio promotore SP6 base plasmide. Per ottenere RNC di interesse, C-terminale del polipeptide bersaglio viene esteso aggiungendo inducendo sequenza di arresto SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. Al fine di garantire che il frammento del polipeptide di interesse sarà estrudere fuori del tunnel ribosomiale, il C-terminale della proteina bersaglio deve essere ampliato di almeno 30 amminoacidi 12-14. Una glicina-serina linker flessibile ricco può essere introdotto tra la proteina e la sequenza arresto SECM evitare vincoli possibili conformazionali.
- Per la trascrizione in vitro, DNA stampo deve essere linearizzato con l'enzima di restrizione taglio a valle della ORF. Si deve verificare linearizzazione completa del DNA plasmide eseguendo il prodotto della digestione di restrizione elettroforesi su gel di agarosio.
- Il plasma linearizzatoid è ulteriormente utilizzato per la reazione di trascrizione in vitro. Diversa concentrazione di DNA stampo può essere testato per identificare concentrazione ottimale di DNA necessarie per la trascrizione in vitro. Generalmente con Kit MEGAscript Ambion Trascrizione di alto rendimento (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 mg DNA linearizzato produce mRNA 40-60 mg. Trascrizione in vitro viene effettuata seguendo le istruzioni del fabbricante (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) .
- Dopo la trascrizione in vitro, mRNA viene purificato mediante precipitazione litio cloruro secondo le istruzioni del produttore (Ambion di MEGAscript alta Kit Trascrizione resa, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
- integrità mRNA è ulteriormente verificato mediante elettroforesi utilizzando acrilammide o gel di agarosio.
2. Traduzione in vitro
Per la traduzione in vitro utilizzando l'RTS 100 E. coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD), attenersi alla seguente procedura:
- Preparare 100 pl di istruzione in produttore traduzione in vitro la reazione successivo. In breve, in acqua priva di nucleasi aggiungere 24 microlitri miscela di aminoacidi meno metionina (1 mM), 10 unità di inibitore della ribonucleasi (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 uCi di sostanze radioattive [35 S] Biomedicals-metionina (MP, Solon, OH), 20 pl miscela di reazione, 24 microlitri tampone di ricostituzione e 24 pl di E. coli lisato.
- Incubare la reazione a 30 ° C per 5 min a caldo pre la reazione di traduzione. Aggiungere 1-2 pg di mRNA alla reazione di traduzione e incubare a 30 ° C per 10-15 min.
- Arrestare la reazione ponendo la reazione di traduzione in ghiaccio.
3. Isolamento del polipeptide nascente dalla reazione di traduzione in vitro
- Per isolare RNC, la reazione di traduzione è sovrapposto di 4,5 ml di saccarosio gradiente 5-30% in 20 mM HEPES pH 7-KOH0,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM acetato di potassio, 1 mM DTT e centrifugati utilizzando Beckman Coulter SW55-Ti rotore a 41.000 rpm, 4 ° C per 2 ore.
- Dopo centrifugazione, gradiente di saccarosio è frazionato per isolare diverse popolazioni ribosomali e le relative catene nascenti. La separazione viene monitorata utilizzando il sistema programmabile ISCO gradiente di densità con registrazione continua a 254 nm, utilizzando un rivelatore ISCO UA-6 assorbanza.
- La frazione (s) contenente ribosomi 70S vengono raccolti e analizzati ulteriormente a seconda dello scopo dell'esperimento.
4. Osservazione delle proteine al ribosoma con Tris-tricina SDS PAGE
Per verificare, se la proteina SECM estesa rimane attaccato agli anni '70 ribosoma, frazioni del gradiente sono stati raccolti e trattati come segue:
- Proteine in ciascuna frazione è stata precipitato per aggiunta di acido tricloroacetico (TCA) ad una concentrazione finale del 10% e incubate a 4 ° C overniGHT.
- Dopo incubazione per una notte, i campioni sono stati centrifugati a 14.000 g per 15 minuti per precipitare la proteina. Dopo la centrifugazione supernatante è stato rimosso e il pellet lavata due volte con acetone soluzione contenente: 1 mM Tris-HCl pH 7,6 (4:1). Pellet è stato ulteriormente essiccati all'aria e disciolto in SDS-PAGE tampone di caricamento.
- Il campione trattato è stato risolto e analizzato mediante Tris-tricina SDS-PAGE.
- Dopo l'elettroforesi, gel sono stati fissati, essiccati sotto vuoto usando gel Dyer e sottoposto ad autoradiografia. La distribuzione dei polipeptidi nascenti stati osservati usando phosphoimaging.
5. Risultati rappresentativi
Qui vi presentiamo un esperimento che descrive l'isolamento del full-length bovina Gamma-B sonoro superiore cristallino stabilmente legata alle 70S dei ribosomi. La figura 1 illustra passaggi necessari per l'isolamento di bovini Gamma-B cristallina RNC. Il C-terminale della Gamma-B sonoro superiore cristallino è stata estesa complessiva da 32 t aminoacidiO Assicurarsi che full-length estrude proteina fuori del tunnel ribosomale, questo include anche la sequenza SECM stallo posto al molto C-terminale del polipeptide di fusione. Seguendo traduzione in vitro, i ribosomi 70S sono stati isolati mediante centrifugazione gradiente di saccarosio (Figura 2.1). Al fine di garantire che la proteina rimane stabilmente legato al ribosoma, i 70S contenenti frazioni sono state riunite, dissalato, tampone scambiate e sottoposto ad una serie supplementare di centrifugazione gradiente di saccarosio (Figura 2.2). Il risultato illustrato nella figura 2 indica chiaramente che SECM può efficacemente indurre arresto traslazionale dei Gamma-B RNC cristallina.
Figura 1. Spiegazione schematica i passi necessari per l'isolamento di RNC. C-terminale di bovini Gamma-B sonoro superiore cristallino è stata prorogata dal 32 sequenza aminoacidica. Questa estesaC-terminale regioni comprende anche la sequenza SECM arresto. Gamma-B sonoro superiore cristallino con la sequenza SECM è stato clonato nel Pivex 2.3 (T7 based) plasmide. Per la trascrizione in vitro del DNA stampo è stato linearizzato con XbaI. Modello linearizzato è stato ulteriormente utilizzato per la trascrizione in vitro. Il T7 nel modello DNA è riconosciuto da RNA polimerasi T7 che trascrive le Gamma-B gene sonoro superiore cristallino a valle del promotore T7. mRNA è stato purificato usando cloruro di litio metodo di precipitazione. Il mRNA purificato è stato poi usato per traduzione in vitro. Dopo l'incubazione, la reazione di traduzione è stato stratificato sopra del gradiente 5-30% di saccarosio e centrifugato in Beckman Coulter SW55-Ti rotore a 41.000 rpm, 4 ° C per 2 ore.
Figura 2. Isolamento dei bovini Gamma-B sonoro superiore cristallino RNC stabilmente legato al ribosoma 70S. 1 mRNA pg è stato miscelato in 100 microlitri di reazione E. coli sistema S30 estratto come descritto nella sezione protocollo con 20 uCi [35 S]-metionina e incubate a 30 ° C per 15 min. Dopo l'incubazione, la reazione di traduzione è stato stratificato sopra del gradiente di saccarosio 5-30% in 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM di acetato di potassio, 1 mM DTT e centrifugato in Beckman Coulter SW55-Ti rotore a 41.000 rpm, 4 ° C per 2 ore. A seguito di velocità di sedimentazione, il gradiente è stato scaricato e il ribosoma Pro Tools LE è stato ottenuto. I dati sono stati registrati dal programma PeakTrak (gradiente di densità ISCO sistema gradiente di frazionamento). Le frazioni sono state raccolte, la proteina è stata TCA precipitata e ha deliberato 16,5% T, C 6% Tris-Tricine PAGE gel 15. Il gel è stato essiccato ed esposto per autoradiografia. Dopo l'esposizione il gel è stato analizzato utilizzando Typhoon 9410 scanner imaging. La figura 2.1 mostra che il full-length Gamma-B sonoro superiore cristallino è presente in frazioni 70S dei ribosomi. Così, la sequenza SECM stallo consente l'isolamento della stalla bovina Gamma-B cristallina RNC. I dati in Figura 2,2 indicano chiaramente che i RNC isolate sono infatti stabili. Nell'esperimento corrente delle frazioni 70S dopo primo ciclo di centrifugazione gradiente di saccarosio sono state riunite e il saccarosio è stato rimosso usando Amicon Ultra-4 Unità di filtro centrifugo (Millipore), seguita da tampone scambio in soluzione contenente 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl 2, acetato di potassio 100 mM, DTT 1 mM. Questo campione è stato inoltre sottoposto ad una serie supplementare di centrifugazione attraverso gradiente 5-30% di saccarosio e frazionato. Ogni frazione è stata trattati ed analizzati come in Figura 2.1.
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Discussion
Per risultati riproducibili, la qualità e la concentrazione dei componenti utilizzati per la trascrizione e traduzione in vitro sono critiche. Abbiamo usato commercialmente disponibile la trascrizione in vitro ed estratti di traduzione e danno risultati efficaci e riproducibili, se maneggiato con cura. Qualità di mRNA può influenzare la traduzione, quindi è della massima importanza per testare l'integrità di mRNA prima di utilizzarlo per traduzione in vitro. Il tempo di incubazione di traduzione in vitro varia con la lunghezza della proteina. Inoltre, il tempo / velocità di centrifugazione può essere regolata di conseguenza, nel caso, la frazione ribosomiale 70S non è ben risolto e separata dalle 50S. Inoltre, ribosoma complessi proteici associati devono essere maneggiati con cura per evitare la contaminazione RNasi. Inoltre, le condizioni di rispetto dovrebbero essere monitorati attentamente e agenti chelanti che possono chelare Mg 2 + dovrebbe essere evitato.
SECM arrestosequenza, sulla sua traduzione interagisce con le proteine ribosomali L4 e L22 nonché rRNA 23S nel tunnel ribosomale 7,8. Un certo numero di residui di critiche, che costituiscono il motivo SECM arresto, F WI XXXX XXXX GIRAGP 7 (in grassetto) sono di enorme importanza, garantire l'efficienza dell'arresto traslazionale. Mutazioni o eliminazioni di questi residui critici può portare ad alleviare l'arresto allungamento traduzione 7,8. Quindi, mantenendo la sequenza del motivo dell'arresto SECM F XXXX WI XXXX GIRAGP 7 intatto è assolutamente critico per assicurare che la proteina studiata rimarrebbe stabilmente legato al ribosoma.
Questa tecnica può essere utilizzata per l'analisi della struttura di co-traslazionale intermedi e co-traslazionale piegatura di varie proteine. Recentemente è stato usato con successo per determinare l'esatta struttura of diversi ribosoma nascenti catene rilegati con l'aiuto di NMR 10-11. Inoltre, questa tecnica può anche essere utilizzato per generare nascenti peptidi di dimensioni predeterminate per l'analisi delle loro interazioni terziarie con proteine accessorie, cofattori o ligandi.
Un approccio alternativo per produrre complessi RNC comporterebbe l'impiego di mRNA troncati privi codone di stop. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato da molti ricercatori per studiare la co-traslazionale ripiegamento proteico si veda ad esempio 12,16. Tuttavia, esso presenta una serie di inconvenienti. Questo approccio non può essere impiegato in vivo e anche problematico per l'uso in vitro con E. coli estratto a causa della presenza in E. coli di sistema SsrA che media addizione del peptide C-terminale tag (AANDENYALAA) alle proteine tradotte da mRNA senza in-frame codoni di stop, che porta alla loro degradazione 17. Pertanto, in quest'ultimo caso, si deve utilizzare completamente ricoSistema tuita e / o un sistema, privo / sopprimendo SsrA codifica macchine. SECM-diretto stallo è efficiente ed unico come è stato dimostrato di produrre complessi stallo ribosoma in vivo e in vitro con efficienza quasi simile 18.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal programma Human Frontier Science concessione RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
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