Summary
우리는 지금 여기 정기적으로 안정적으로 바운드 ribosome 초기 체인 단지 (RNCs)를 분리하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 이 기술은 17 아미노산 긴 SecM "체포 시퀀스는"prokaryotic에서 번역 신장을 중지할 수있는 발견의 활용 (
Abstract
광범위한 연구는 세포에 개고 단백질이 공동 translational 절차 1-5는 것을 제안 충분한 증거를 제공했습니다. 다만, 폴리펩티드 사슬는 기능적인 양식을 달성하기위한 공동 translational 접는 동안 다음과 정확한 경로는 여전히 수수께끼입니다. 이 과정을 이해하고 공동 translational 접힘 중간체의 정확한 형태를 결정하기 위해서는, 그들의 자세한 구조 분석을 허용하도록 미리 정해진 크기의 초기 체인을 들고 RNCs의 절연을 허용 기법을 개발하는 것이 필수적입니다.
SecM (분비 모니터)는 170 아미노산 E.입니다 secM-secA 오페론 6 하류 SecA (분비 운전) ATPase의 표현을 규제 대장균 단백질. Nakatogawa와 이토 원래 SecM 단백질의 C-말단 지역에서 17 아미노산 긴 시퀀스 (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166)에 충분하고 필요한 것을 발견따라서 peptidyl-glycyl-tRNA가 안정적으로 7-9 P 사이트 ribosomal에 바인딩 생산, Gly165에서 SecM 신장의 연기자 거든. 더 중요한 건, 그것이 17 아미노산 긴 시퀀스 따라서 미리 결정된 사이즈 7의 초기 체인을 들고 RNCs의 생산을 허용하는 거의 모든 전신 및 / 또는 잘린 단백질의 C-말단에 융합 수있는 사실을 발견했습니다. 따라서 대상 단백질에 융합하거나 삽입할 때 SecM 끄는 순서는 폴리펩티드 사슬의 신장의 체포를 생산하고 E.에서 생체내에 모두 안정적인 RNCs를 생성 대장균 세포와 세포없는 시스템에서 체외 인치 자당의 기울기 원심 분리는 더욱 RNCs을 분리하기 위해 사용된다.
격리된 RNCs는 공동 translational 접힘 중간체의 구조 및 기능적 특징을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 최근에는이 기술이 성공적으로 여러 개의 ribosome 바운드 초기 체인 10,11의 구조에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다. 다음은 소 감마-B Crystallin의 고립을 설명하는 것은 SecM에 융합 및 체외 번역 시스템에서 발생 RNCs.
Protocol
1. DNA를 템플릿 준비 및 시험 관내 스크립트 작성에
- 관심있는 유전자는 어떤 T7 및 / 또는 예 : 플라스미드 기반 SP6 발기인에 복제됩니다. 관심 RNCs를 얻으려면 폴리펩티드 대상의 C-말단은 SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7 구속 유도 시퀀스를 추가하여 연장됩니다. 관심 폴리펩티드 조각은 ribosomal 터널 밖으로 압출 성형 것을 보장하기 위해서, 대상 단백질의 C-말단 부분은 12-14 최소한 30 아미노산에 의해 확장되어야한다. 유연한 글리신 - 세린 풍부 링커는 모든 가능한 conformational 제약을 피하기 위해 단백질과 SecM 체포 시퀀스 사이에 도입 할 수 있습니다.
- 시험 관내 전사의 경우, 템플릿 DNA가 ORF의 하류를 절단 제한 효소로 선형되어야합니다. 하나는 아가로 오스 겔 전기 영동에 제한 소화 제품을 실행하여 플라스미드 DNA의 완전한 선형화를 확인해야합니다.
- 선형 혈장id는 추가 시험 관내 전사 반응에 사용됩니다. 템플릿 DNA의 서로 다른 농도는 시험 관내 전사에 필요한 최적의 DNA 농도를 확인하는 테스트를 할 수 있습니다. 일반적으로 Ambion의 MEGAscript 높은 항복 전사 키트 (Ambion / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, NY)로, 1 μg 선형 DNA는 40-60 μg의 mRNA를 얻을. 시험 관내 전사에는 제조 업체의 지침 (Ambion / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, NY)에 따라 이루어집니다 .
- 시험 관내 전사에 따라 mRNA는 제조 업체의 지침 (Ambion의 MEGAscript 높은 항복 전사 키트, Ambion / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, NY)에 따라 염화 리튬의 석출에 의해 정화된다.
- mRNA 무결성이 더욱 아크릴 아미드 또는 아가로 오스의 젤을 사용하여 전기 영동으로 확인됩니다.
2.에서 체외 번역
RTS 100 E. 대장균 HY 키트 (5 프라임, Gaither 이용한 체외 번역에 들어sburg, MD)는 다음 단계를 따르십시오 :
- 의 체외 번역 반응이 다음과 같은 제조 업체의 지침을 100 μl를 준비합니다. 간단히, nuclease 무료로 물속에 24 μl 아미노산 혼합물 마이너스 메티오닌 (1 ㎜), Ribonuclease 억제제의 10 단위 (Invitrogen / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, 뉴욕), 방사성의 20 μCi [35 S] (-메티오닌 MP의 Biomedicals를 추가 솔론, OH), 20 μl 반응 믹스, 24 μl Reconstitution 버퍼와 E의 24 μl 대장균은 Lysate.
- 따뜻한 번역 반응을 미리하는 5 분 동안 30 ° C에서 반응을 품어. 10-15 분 30 ° C에서 번역 반응과 부화 mRNA 1-2 μg을 추가합니다.
- 얼음 번역 반응을 배치하여 반응을 중지합니다.
3. 체외 번역 반응의 초기 폴리펩티드의 분리
- RNCs를 분리하려면 번역 반응 20 MM HEPES-코이의 산도 7 5-30%의 자당 기울기 4.5 ML 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가있다0.5, 15 밀리미터 MgCl 2, 100 MM 칼륨 아세테이트, 1 밀리미터 DTT와, 41,000 rpm으로 4 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 SW55-티 로터를 사용 ° C를 2 시간 동안 centrifuged.
- 원심 분리 후, 자당 기울기 다른 ribosomal 인구 및 관련 초기 체인을 분리 fractionated입니다. 분리는 ISCO UA-6 흡광 검출기를 사용하여 254 nm의에서 연속 녹화로 ISCO 프로그램 밀도 구배 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있습니다.
- 70 년대의 변이를 포함하는 분획 (들) 수집 및 추가 실험 목적에 따라 분석하고 있습니다.
4. 단백질의 관찰 트리스 - tricine SDS 페이지와 Ribosome뿐 이잖아
SecM 확장 단백질은 ribosome 70 년대에 붙어 남아 있는지, 확인하려면 그라데이션 분수를 모으고 다음과 같이 취급되었다 :
- 각 분획의 단백질은 10 %의 최종 농도로 Trichloroacetic 산 (TCA)를 추가하여 시켰던 4 ° C overni에서 incubated되었다ght.
- 하룻밤 배양 후 시료 펠렛 ~ 15 분 단백질을 위해 14,000 X g에서 centrifuged되었다. 다음 원심 분리의 표면에 뜨는이 제거하고 펠릿는 솔루션이 포함된 아세톤으로 두번 씻었습니다 : 1 ㎜ 트리스-HCL의 산도 7.6 (4시 1분). 펠렛은 더 이상 공기가 건조하고 SDS-PAGE 로딩 버퍼에 해산했습니다.
- 처리 시료가 해결 및 트리스 - tricine SDS-PAGE에 의해 분석되었다.
- 전기 영동 후, 젤류가 수정되었습니다, 진공 젤 다이어를 사용하고 autoradiography를 받게 건조. 어렸을때 polypeptides의 분포는 phosphoimaging을 사용하여 관찰되었다.
5. 대표 결과
여기에서 우리는 안정적으로 ribosome 70에 바인딩 장편 소 감마-B Crystallin의 고립을 설명하는 실험을 제시한다. 그림 1은 소 감마-B Crystallin의 RNCs의 격리에 관련된 단계를 묘사. 감마-B Crystallin의 C-말단는 32 아미노산의 t으로 전체적인 확대되었다ribosomal 터널의 전체 길이 단백질 extrudes 아웃을 보장 해줬, 이것은 또한 폴리펩티드 융합의 C-말단 매우 배치 SecM 끄는 순서를 포함합니다. 체외 번역에 이어 70 년대의 리보솜은 자당의 기울기 원심 분리 (그림 2.1)에 의해 분리되었다. 단백질이 안정적으로 ribosome에 바인딩 상태를 유지하기 위해, 분수를 포함하는 70가 풀링되었다 desalted, 버퍼 교환 및 자당의 기울기 원심 분리의 추가 라운드 (그림 2.2)에 노출. 그림 2에 제시된 결과는 명확하게 그 SecM 효율적으로 감마-B Crystallin의 RNCs의 translational 체포를 유도 수 있습니다 제안합니다.
1 그림. RNCs의 분리에 관여 단계 도식 설명. 소 감마-B Crystallin의 C-말단는 32 아미노산 서열에 의해 확대되었다. 이 확장C-말단 영역은 또한 SecM 체포 시퀀스를 포함합니다. SecM 순서와 감마-B Crystallin은 pIVEX 2.3 (T7 기준) 플라스미드에 복제되었습니다. 시험 관내 전사의 내용은 템플릿 DNA가 XbaI으로 선형되었다. 선형화된 템플릿은 추가 시험 관내 전사에 사용되었습니다. DNA를 템플릿에서 T7은 T7 프로 모터의 감마-B Crystallin 유전자 위치 하류를 transcribes T7 RNA 중합 효소에 의해 인정되고 있습니다. mRNA는 염화 리튬의 석출 방법을 사용하여 정화되었다. 정화 mRNA 그러면 체외 변환에 사용되었다. 다음과 부화는 번역 반응은 5-30%의 자당 기울기 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가, 2 시간 동안 41,000 RPM, 4 ° C에서 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 SW55-티 로터에 centrifuged되었다.
그림 2. 소 감마-B Crystallin의 분리가 안정적으로 70 년대의 ribosome에 바인딩 RNCs. 1 μg의 mRNA는 100 μl 반응 E.에 혼합되었다 대장균 S30 추출 시스템 20 μCi [35 S]와 프로토콜 절에서 설명한대로-메티오닌과 15 분 동안 30 ° C에서 incubated. 다음과 부화는 번역 반응 20 MM HEPES-코이 산도 7.5, 15 밀리미터 MgCl 2, 100 MM 칼륨 아세테이트, 1 ㎜ DTT에 5-30%의 자당 기울기 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가와 41,000에서 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 SW55-티 로터에 centrifuged되었다 RPM, 2 시간 4 ° C에서. 속도 침강에 따라 그라데이션이 언로 드되었으며 ribosome 프로 르가 얻은 것입니다. 데이터 PeakTrak 프로그램 (ISCO 구배 밀도 기울기 분획화 시스템)에 의해 기록되었다. 분수가 수집되었다 단백질은 TCA는 시켰던와 해결 16.5 %의 T에 6퍼센트 C 트리스-T였다ricine 페이지 겔 15. 겔은 건조하고 autoradiography에 대해 접했습니다. 아래 노출이 젤은 태풍 9,410 이미징 스캐너를 사용하여 스캔했습니다. 그림 2.1 전체 길이 감마-B Crystallin은 70 ribosome 분수에 있는지 보여줍니다. 따라서 SecM 끄는 순서는 안정 소 감마-B Crystallin의 RNCs의 절연을 허용합니다. 그림 2.2에서 데이터가 명확하게 고립된 RNCs 실제로 안정을 나타냅니다. 현재 실험에서 자당의 기울기 원심 분리의 첫 라운드 이후 70 년대의 분수는 풀링된으며 자당은 HEPES-코이 산도 7.5, 15 MM 20 밀리미터를 포함하는 용액에 버퍼 교환 뒤에 Amicon 울트라-4 원심 필터 유닛 (Millipore)을 사용하여 삭제되었습니다 MgCl 2, 100 밀리미터 칼륨 아세테이트, 1 밀리미터 DTT. 이 샘플은 더욱 5-30%의 자당 기울기와 fractionated 통해 원심 분리의 추가 라운드를 받게되었다. 각 분획은 취급 그림 2.1에서처럼 분석되었다.
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Discussion
시험 관내 전사와 번역에 사용된 부품의 재현성 결과, 품질과 집중이 중요하십시오. 우리는 시험 관내 전사 및 번역 추출물에서 시판 사용하고 신중하게 처리한다면 그들은 효과적이고 재현성 결과를 제공합니다. mRNA의 품질이 번역에 영향을 미칠 수 있으므로, 그것은 체외의 번역을 위해 사용하기 전에 mRNA의 무결성을 테스트하기 위해 가장 중요합니다. 체외 번역에 대한 배양 시간은 단백질의 길이에 따라 다릅니다. 또한, 원심 분리의 시간 / 속도, 그에 따라 조정할 수 있습니다 경우, 70 ribosomal 분수가 잘 해결되지 않고 50에서 분리. 또한, ribosome 바운드 단백질 단지는 RNase 오염을 피하기 위해 신중하게 다루어 져야합니다. 또한, 버퍼 조건 주의깊게 모니터링해야하며 MG 2 킬레이트 수 chelating 요원은 + 피해야한다.
SecM 연금시퀀스, 그 번역 ribosomal 터널 7,8의 ribosomal 단백질 L4와 L22뿐만 아니라 23S rRNA의 상호 작용에 따라. SecM 체포 모티브를 구성 중요한 잔류물의 수, F XXXX XXXX 위스콘신 GIRAGP 7 (굵은 글씨)을 translational 체포의 효율성을 보장 거대한 중요하다. 변이, 또는 이러한 중요한 잔류물의 삭제는 번역 연신율 연금 7,8의 완화로 이어질 수 있습니다. 따라서 SecM 체포 모티브의 순서를 유지하는 것이 F XXXX XXXX 위스콘신 GIRAGP 그대로 7 공부 이하 단백질이 안정적으로 ribosome에 바인딩 남아있는 것이 유지를 위해 절대적으로 중요합니다.
이 기술은 공동 translational 중간체 및 다양한 단백질의 공동 translational 접는 구조의 분석에 사용될 수 있습니다. 그것은 최근에 성공적으로 정확한 구조 o를 결정하는 데 사용되었습니다F NMR 10-11의 도움으로 여러 개의 ribosome 바운드 초기 체인. 또한,이 기법은 또한 액세서리 단백질, cofactors 또는 리간드와의 차 상호 작용 분석을 위해 미리 결정된 사이즈의 초기 펩티드를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
RNCs 단지를 생산하기위한 대안적인 접근은 정지 코돈이 부족한 잘립니다 mRNAs의 사용을 포함합니다. 이 접근법은 광범위하게 공동 translational 단백질 접힘이 예 : 12,16보고 공부하고 많은 연구자가 사용되었습니다. 그러나, 단점을 가지고 있습니다. 이 접근법은 생체내에 채용된와 E와 체외에서의 사용에도 문제가되지 않습니다 대장균은 E.의 존재로 인해 추출 SsrA 시스템의 대장균 그 mediates들의 열화 17 선도에서 프레임 정지 codons없이 mRNAs에서 번역된 단백질의 C-펩타이드 터미널 태그 (AANDENYALAA)의 추가. 따라서 나중에 경우에, 하나는 완전히 reconsti를 사용한다tuted 시스템 및 / 또는 시스템, 부족 / 억제 SsrA 태그 추가 기계. 그것은 거의 유사한 효율을 18으로 생체내 및 시험 관내에서 멈춘 ribosome 단지를 생성하기 위해 입증된로 SecM - 감독이 연기자는 효율적이고 유일하다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 인간 프론티어 과학 프로그램 보조금 RGP0024에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
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