Summary
Vi beskriver her en teknikk som nå rutinemessig brukt til å isolere stabilt innbundne ribosomet begynnende kjeden komplekser (RNCs). Denne teknikken utnytter oppdagelsen av at en 17 aminosyre lang SecM "arrest sekvens" kan stanse oversettelse tøyelighet i en prokaryot (
Abstract
Omfattende forskning har gitt rikelig med bevis som tyder på at protein folding i cellen er en co-translasjonell prosess 1-5. Imidlertid er den nøyaktige bane som polypeptid kjeden følger under co-translasjonell folding å oppnå sin funksjonelle form fortsatt en gåte. For å forstå denne prosessen og for å fastslå den eksakte konformasjon av co-translasjonelle folding mellomprodukter, er det viktig å utvikle teknikker som tillater isolering av RNCs bærer begynnende kjeder av forhåndsbestemte størrelser å tillate deres videre strukturell analyse.
SecM (sekret monitor) er en 170 aminosyre E. coli protein som regulerer uttrykket av nedstrøms Seca (sekret kjøring) ATPasen i secM-seca operon 6. Nakatogawa og Ito opprinnelig fant at en 17 aminosyre lang sekvens (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) i C-terminal regionen av SecM protein er tilstrekkelig og nødvendig for åforårsake blokkering av SecM forlengelse ved Gly165, og dermed produsere peptidyl-glycyl-tRNA stabilt bundet til ribosomalt P-området 7-9. Enda viktigere, ble det funnet at denne 17 aminosyre lang sekvens kan smeltet til C-terminus av praktisk talt alle full-lengde og / eller avkortet protein og dermed gir produksjon av RNCs bærer begynnende kjeder av forhåndsbestemte størrelser 7. Så når smeltet eller settes inn i målet protein, produserer SecM drøye sekvens arrestasjonen av polypeptid kjedeforlengelse og genererer stabile RNCs både in vivo i E. coli-celler og in vitro i en celle uten system. Sukrose gradient sentrifugering er videre utnyttes for å isolere RNCs.
De isolerte RNCs kan brukes til å analysere strukturelle og funksjonelle trekk ved co-translasjonelle folding mellomprodukter. Nylig har denne teknikken vært brukt til å få innsikt i strukturen i flere ribosome innbundne begynnende kjedene 10,11. Her beskriver vi isolering av storfe Gamma-B Crystallin RNCs smeltet SecM og generert i en in vitro oversettelse system.
Protocol
1. DNA Mal Forberedelse og in vitro Transkripsjon
- Genet av interesse er klonet i alle T7 og / eller f.eks SP6 promoter basert plasmid. For å oppnå RNCs av interesse, er C-terminus av målet polypeptid utvides ved å legge arrest induserende sekvens av SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. For å sikre at polypeptid fragment av interesse vil extrude ut av ribosomal tunnelen, har C-terminalen del av målet proteinet skal forlenges med minst 30 aminosyrer 12-14. En fleksibel Glycine-Serine rik linker kan innføres mellom protein og SecM arrestasjonen sekvensen for å unngå eventuelle bygningsmessige begrensninger.
- For in vitro transkripsjon, bør mal DNA være lineært med restriksjonsenzym kutte nedstrøms ORF. Man trenger å verifisere fullstendig linearisering av plasmid DNA ved å kjøre begrensning fordøyelse produktet på agarose gel elektroforese.
- Den lineær plasmid er videre brukt til in vitro transkripsjon reaksjon. Ulik konsentrasjon av mal DNA kan bli testet for å identifisere optimal DNA konsentrasjon er nødvendig for in vitro transkripsjon. Vanligvis med Ambion sin MEGAscript høy kapasitet Transcription Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), gir en mikrogram lineært DNA 40-60 mikrogram mRNA. In vitro transkripsjon er gjort etter produsentens anvisninger (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) .
- Etter in vitro transkripsjon, er mRNA renset av lithium klorid ventet ifølge produsentens instruksjon (Ambion sin MEGAscript høy kapasitet Transcription Kit, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
- mRNA integritet blir ytterligere bekreftet ved elektroforese å bruke akrylamid eller agarose gels.
2. In vitro Translation
For in vitro oversettelse ved hjelp av RTS 100 E. coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD) følger du trinnene nedenfor:
- Forbered 100 mL av in vitro oversettelse reaksjon følgende produsentens instruksjoner. Kort, i nuklease fritt vann legge 24 mL aminosyre blanding minus metionin (1 mm), 10 enheter av Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 μCi av radioaktivt [35 S]-metionin (MP Biomedicals, Solon, OH), 20 mL Reaction mix, 24 mL Rekonstituering buffer og 24 mL av E. coli lysate.
- Inkuber reaksjonen ved 30 ° C i 5 min til pre varm oversettelsen reaksjonen. Legg 1-2 mikrogram av mRNA til oversettelse reaksjon og Inkuber ved 30 ° C i 10-15 min.
- Stopp reaksjonen ved å plassere oversettelse reaksjon på is.
3. Isolering av begynnende polypeptid fra in vitro Translation Reaction
- For å isolere RNCs, er oversettelsen reaksjonen lagvis oppå 4,5 ml 5-30% sukrose stigning i 20 mm HEPES-KOH pH 70,5, 15 mm 2 MgCl, 100 mm kaliumacetat, 1 mm DTT og sentrifugeres bruker Beckman Coulter SW55-Ti rotoren på 41 000 rpm, 4 ° C i 2 timer.
- Etter sentrifugering, er sukrose gradient fraksjonert å isolere forskjellige ribosomale populasjoner og tilhørende gryende kjeder. Separasjon overvåkes ved hjelp av ISCO programmerbare Density Gradient System med kontinuerlig opptak ved 254 nm med en ISCO UA-6 absorbans detektor.
- Fraksjonen (e) inneholder 70 ribosomer samles og analyseres videre avhengig av målet med eksperimentet.
4. Observasjon av proteinbundet til ribosomet med Tris-tricine SDS PAGE
For å sjekke, om SecM utvidede proteinet forblir festet til 70S ribosomet, ble gradient fraksjoner samlet inn og behandlet som følger:
- Protein i hver fraksjon ble fremskyndet ved å legge trikloreddiksyre (TCA) til en endelig konsentrasjon på 10% og inkubert ved 4 ° C overniGHT.
- Etter natten inkubasjon ble prøvene sentrifugeres ved 14000 X g for 15 min til pellet protein. Etter sentrifugering supernatanten ble fjernet og pellet vasket to ganger med løsning som inneholder aceton: 1 mM Tris-HCl pH 7,6 (4:1). Pellet ble ytterligere lufttørkes og oppløst i SDS-PAGE loading buffer.
- Den behandlet prøven ble løst, og analysert av Tris-tricine SDS-PAGE.
- Etter elektroforese, geleer ble fikset, tørket ved hjelp av vakuum gel Dyer og utsatt for autoradiografi. Fordelingen av begynnende polypeptider ble observert ved hjelp phosphoimaging.
5. Representative Resultater
Her presenterer vi et eksperiment som beskriver isolering av full-lengde bovin Gamma-B Crystallin stabilt bundet til 70S ribosom. Figur 1 viser trinn er involvert i isolering av storfe Gamma-B Crystallin RNCs. C-endestasjonen på Gamma-B Crystallin ble forlenget samlet av 32 aminosyrer to sikre at full lengde protein extrudes ut av ribosomal tunnelen, dette inkluderer også SecM drøye sekvensen plassert helt C-endestasjonen på fusjon polypeptid. Etter in vitro oversettelse, ble 70-ribosomer isolert av sukrose gradient sentrifugering (figur 2.1). For å sikre at proteinet forblir stabilt bundet til ribosomet, ble 70S inneholder fraksjonene samlet, utvannet, buffer utvekslet og utsatt for en ekstra runde med sukrose gradient sentrifugering (figur 2.2). Resultatet presenteres i figur 2 antyder klart at SecM effektivt kan indusere translasjonell arrestasjonen av Gamma-B Crystallin RNCs.
Figur 1. Skjematisk forklaring av trinnene involvert i isolasjon RNCs. C-terminus av storfe Gamma-B Crystallin ble forlenget med 32 aminosyresekvens. Denne utvidedeC-terminal regioner inngår også SecM arrest sekvens. Gamma-B Crystallin med SecM sekvens ble klonet i pIVEX 2,3 (T7 basert) plasmid. For in vitro transkripsjon malen DNA ble lineært av XbaI. Lineært malen ble ytterligere brukt til in vitro transkripsjon. Den T7 i DNA malen er anerkjent av T7 RNA polymerase som transcribes de Gamma-B Crystallin genet ligger nedstrøms av T7 promoter. mRNA ble renset ved hjelp av lithium klorid nedbør metode. Den rensede mRNA ble deretter brukt til in vitro oversettelse. Etter inkubasjon ble oversettelsen reaksjonen lagvis oppå 5-30% sukrose gradient og sentrifugeres i Beckman Coulter SW55-Ti rotoren på 41 000 rpm, 4 ° C i 2 timer.
Figur 2. Isolering av storfe Gamma-B Crystallin RNCs stabilt bundet til 70S ribosomet. 1 mikrogram mRNA ble blandet i 100 mL reaksjon E. coli S30 Extract System som nevnt i protokollen seksjon med 20 μCi [35 S]-metionin og inkubert ved 30 ° C i 15 min. Etter inkubasjon ble oversettelsen reaksjonen lagvis oppå 5-30% sukrose stigning i 20 mm HEPES-KOH 7,5 pH, 15 mM MgCl 2, 100 mm kaliumacetat, 1 mm DTT og sentrifugeres i Beckman Coulter SW55-Ti rotoren på 41 000 rpm, 4 ° C i 2 timer. Etter hastighet sedimentering ble gradient losset og ribosomet pro le ble innhentet. Dataene ble registrert av PeakTrak programmet (ISCO gradient tettshetsgradient fraksjonering system). Fraksjoner ble samlet, var protein TCA fremskyndet og vedtok 16.5% t, 6% C Tris-Tricine SIDE gel 15. Gelen ble tørket og utsatt for autoradiografi. Etter eksponering gelen ble skannet ved hjelp av Typhoon 9410 bildebehandling skanner. Figur 2.1 viser at full-lengde Gamma-B Crystallin er til stede i 70S ribosom fraksjoner. Dermed lar SecM stalling sekvens isolering av de stabile storfe Gamma-B Crystallin RNCs. Data i Figur 2.2 tydelig viser at de isolerte RNCs er faktisk stabil. I dagens eksperimentet på 70-tallet fraksjonene etter første runde av sukrose gradient sentrifugering ble samlet og sukrose ble fjernet ved hjelp Amicon Ultra-4 sentrifugalfilter Unit (Millipore), etterfulgt av buffer utveksling i løsningen inneholder 20 mM HEPES-KOH 7,5 pH, 15 mm 2 MgCl, 100 mm kaliumacetat, 1 mm DTT. Denne prøven ble ytterligere utsatt for en ekstra runde med sentrifugering gjennom 5-30% sukrose gradient og fraksjonert. Hver fraksjon ble behandlet og analysert som i figur 2.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For reproduserbare resultater, kvalitet og konsentrasjon av komponentene som brukes for in vitro transkripsjon og oversettelse er kritisk. Vi har brukt kommersielt tilgjengelige in vitro transkripsjon og oversettelse ekstrakter og de gir effektive og reproduserbare resultater, hvis håndteres forsiktig. Kvalitet av mRNA kan påvirke oversettelsen, så det er av største betydning for å teste integriteten til mRNA før du bruker den for in vitro oversettelse. Inkubasjonstiden for in vitro oversettelse varierer med lengden av proteinet. Dessuten kan tid / hastighet sentrifugering bli justert tilsvarende, i tilfellet blir 70S ribosomalt fraksjonen ikke godt løst og atskilt fra 50S. Videre bør ribosomet innbundne protein komplekser håndteres forsiktig for å unngå RNase forurensning. Videre bør buffer tilstander overvåkes nøye og chelaterande agenter som kan chelate Mg 2 + bør unngås.
SecM arrestsekvens, på sin oversettelse kommuniserer med ribosomale proteiner L4 og L22 samt 23S rRNA i ribosomalt tunnel 7,8. En rekke kritiske rester, som utgjør SecM arrestasjonen motivet, F XXXX WI XXXX GIRAGP 7 (i fet skrift) er av enorm betydning, sikre effektiviteten av translasjonsforskning arrestasjonen. Mutasjoner, eller slettinger av disse kritiske rester kan føre til lindring av oversettelsen tøyelighet arrestasjonen 7,8. Dermed opprettholde sekvens av SecM arrestasjonen motivet F XXXX WI XXXX GIRAGP 7 intakt er helt avgjørende for å sikre at proteinet som studeres ville forbli stabilt bundet til ribosomet.
Denne teknikken kan brukes for analyse av strukturen i co-translasjonelle mellomprodukter og co-translasjonell folding av ulike proteiner. Det har nylig blitt brukt til å fastslå den eksakte strukturen of flere ribosom innbundne begynnende kjeder med hjelp av NMR 10-11. I tillegg kan denne teknikken også brukes til å generere begynnende peptider av forhåndsbestemte størrelser for analyse av deres tertiære interaksjon med tilbehør proteiner, kofaktorer eller ligander.
En alternativ tilnærming til å produsere RNCs komplekser ville innebære bruk av avkortede mRNAs mangler stopp kodon. Denne tilnærmingen har blitt mye brukt av mange forskere å studere co-translasjonell proteinfolding se f.eks 12,16. Det har imidlertid en rekke ulemper. Denne tilnærmingen kan ikke være ansatt i vivo og også problematisk for bruk in vitro med E. coli pakke på grunn av tilstedeværelsen i E. coli i SsrA system som medierer tillegg av C-terminal peptid tag (AANDENYALAA) til proteiner oversatt fra mRNA uten i-frame stopp kodon, som fører til deres degradering 17. Derfor, i den senere tilfelle, må man bruke en helt reconstituted system og / eller et system, mangler / undertrykke SsrA-merking maskiner. SecM-rettet stalling er effektiv og unik som det har vist seg å produsere fastlåste ribosomet komplekser in vivo og in vitro med nesten lik effektivitet 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Human Frontier Science Program stipend RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
