Summary
Здесь мы опишем технику, которая в настоящее время обычно используется для изоляции стабильно связанного рибосомы зарождающейся цепных комплексов (КРС). Эта техника использует открытие, что 17 аминокислот долго МЭСМ "арест последовательность" может остановить элонгации трансляции в прокариотических (
Abstract
Обширное исследование предоставило достаточно доказательств предположить, что сворачивание белков в клетке является одним из поступательного процесса 1-5. Тем не менее, точный путь, который полипептидной цепи следует во время совместного поступательного складные для достижения функциональной форме, остается загадкой. Для того чтобы понять этот процесс и определить точную конформацию совместного поступательного складной промежуточные, важно разработать методы, которые позволяют изоляции КРС проведение зарождающейся цепи заданные размеры, чтобы их дальнейшего структурного анализа.
МЭСМ (секреция монитор) составляет 170 аминокислот E. палочки белок, который регулирует экспрессию вниз Seca (секреция езды) АТФазы в МЭСМ-Сека оперона 6. Nakatogawa и Ито первоначально установлено, что 17 аминокислот длинной последовательности (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) в C-концевой области белка МЭСМ является достаточным и необходимымвызвать срыв удлинения МЭСМ в Gly165, таким образом производя пептидил-глицил-тРНК стабильно связан с рибосомных Р-сайт 7-9. Более того, выяснилось, что это 17 аминокислот длинной последовательности могут быть слиты с С-конца практически любого полнометражных и / или усеченный белок позволяя производство КРС проведение зарождающейся цепи заданные размеры 7. Таким образом, когда сливаются или вставляется в целевой белок, МЭСМ срыва последовательность производит арест полипептид удлинение цепи и генерирует стабильный КРС как в естественных условиях в E. кишечной клетки в пробирке и в бесклеточной системе. Центрифугирование градиента сахарозы в дальнейшем используются для изоляции RNC.
Изолированной КРС может быть использована для анализа структурных и функциональных особенностей совместного поступательного складной промежуточных продуктов. В последнее время эта методика была успешно использована для получения взглянуть на структуру рибосомы несколько связанных зарождающейся цепи 10,11. Здесь мы описываем изоляции бычьего гамма-B кристаллина КРС слит с МЭСМ и сформированных в системе перевода в пробирке.
Protocol
1. Подготовка шаблона ДНК и транскрипции в пробирке
- Гена, клонируют в любом T7 и / или, например, SP6 промоутер основана плазмиды. Для получения КРС интерес, С-конца полипептидной целевой расширенной арест вызывающие последовательности МЭСМ FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. Для того, чтобы убедиться, что полипептид фрагмент интерес будет выдавливать из рибосомного туннеля, С-концевой части белка-мишени должен быть расширен, по крайней мере 30 аминокислот 12-14. Гибкий глицин-серин богатые компоновщик может быть введена между белком и МЭСМ последовательность арест, чтобы избежать любых возможных конформационных ограничений.
- Ибо в пробирке транскрипции, ДНК-матрицы следует линеаризовать с ограничением фермента резки на выходе из ORF. Надо проверить полную линеаризации плазмиды ДНК, запустив продукт рестрикцией на геле агарозы.
- Линеаризованной плазмыидентификатор в дальнейшем используется для реакции в пробирке транскрипции. Различные концентрации ДНК-матрицы могут быть проверены, чтобы определить оптимальную концентрацию ДНК, необходимые для транскрипции в пробирке. Вообще с MEGAscript высокой Ambion в транскрипции выход Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 мкг линеаризованной ДНК дает 40-60 мкг мРНК. В пробирке транскрипции осуществляется после инструкции производителя (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) .
- После транскрипции в пробирке, мРНК очищают осаждения лития хлорид в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (MEGAscript высокой Ambion в транскрипции выход Kit, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
- мРНК целостность далее проверяется электрофореза с использованием акриламида или агарозном геле.
2. В пробирке перевода
Для перевода в пробирке использованием RTS 100 кишечная палочка HY Kit (5 премьер, Gaithersburg, MD) выполните следующие действия:
- Подготовить 100 мкл обучения в пробирке перевод реакции следующих производителей. Короче говоря, в нуклеазы свободной воды добавить 24 мкл смеси аминокислот минус метионин (1 мм), 10 единиц ингибитора рибонуклеазы (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 мкКи радиоактивных [35 S]-метионина (MP Biomedicals, Солон, Огайо), 20 мкл реакции, 24 мкл буфера для разведения и 24 мкл E. палочки лизата.
- Инкубируйте реакции при 30 ° С в течение 5 минут предварительно теплой перевод реакции. Добавьте 1-2 мкг мРНК реакции переводе и инкубировать при 30 ° С в течение 10-15 мин.
- Остановить реакцию путем размещения перевод реакции на льду.
3. Выделение рождающегося полипептида от реакции в пробирке перевода
- Чтобы изолировать КРС, перевод реакции на верхнем уровне 4,5 мл 5-30% градиент сахарозы в 20 мМ HEPES-КОН рН 70,5, 15 мМ MgCl 2, 100 мМ ацетат калия, 1 мМ DTT и центрифугировали использовании Beckman Coulter SW55-Ti ротора при 41 000 оборотов в минуту, 4 ° С в течение 2 часов.
- После центрифугирования, сахароза градиент фракционированный для изоляции различных рибосомных населения и связанных с зарождающейся цепи. Разделение осуществляется с использованием ISCO Программируемая система градиента плотности с непрерывной записи при 254 нм, используя ISCO UA-6 абсорбции детектора.
- Доля (ы) с 70S рибосомы собраны и проанализированы далее в зависимости от цели эксперимента.
4. Наблюдение связывается с белками на рибосомы с Трис-tricine SDS PAGE
Чтобы проверить, является ли МЭСМ расширенной белка остается прикрепленной к 70S рибосомы, градиент фракции собирали и обрабатывали следующим образом:
- Белок в каждой фракции осаждают добавлением трихлоруксусной кислоты (TCA) до конечной концентрации 10% и инкубировали при 4 ° C overniнравом.
- После инкубации в течение ночи пробы центрифугировали при 14000 х г в течение 15 мин для осаждения белков. После центрифугирования супернатант удаляли, а осадок дважды промывали раствором, содержащим ацетон: 1 мМ Трис-HCl, рН 7,6 (4:1). Осадок далее сушат на воздухе и растворяются в SDS-PAGE загрузки буфера.
- Обработанный образец был решен и проанализированы Трис-tricine SDS-PAGE.
- После электрофореза гель фиксировали, сушат вакуум гель красильщика и подвергали авторадиографии. Распределение зарождающейся полипептидов наблюдались с помощью phosphoimaging.
5. Представитель Результаты
Здесь мы приводим описания эксперимента изоляции полнометражный бычьего гамма-B кристаллина стабильно связан с 70S рибосомы. На рисунке 1 показаны этапы выделения крупного рогатого скота Гамма-B КРС кристаллина. С-конец Гамма-B кристаллина был продлен на 32 общих аминокислот т кислотыo Убедитесь, что полная длина белка выдавливает из рибосомного туннеля, это также включает в себя МЭСМ срыва последовательность помещается в самом С-конца слияния полипептида. После перевода в пробирке, 70S рибосомы были изолированы от сахарозы центрифугирования в градиенте (рис. 2.1). Для того, чтобы убедиться, что белок остается стабильно связан с рибосомы, содержащие 70S фракции объединяют, обессоленной, буфер обмена и подвергается дополнительной раунд центрифугирования в градиенте сахарозы (рис. 2.2). Результат представлен на рисунке 2 наглядно показывает, что МЭСМ может эффективно стимулировать поступательное арест Гамма-B КРС кристаллина.
Рисунок 1. Схематическое объяснение шагов в отрыве от RNC. С-конце бычьего гамма-B кристаллина был продлен на 32 аминокислотной последовательности. Эта расширеннаяС-концевой области также включает в себя последовательность МЭСМ ареста. Гамма-B кристаллина с последовательностью МЭСМ была клонирована в pIVEX 2.3 (T7 основе) плазмиды. Ибо в пробирке транскрипции шаблона ДНК линеаризуется XbaI. Линеаризованные шаблон в дальнейшем использованы в пробирке транскрипции. T7 в ДНК шаблон признается Т7 РНК-полимеразы, что транскрипция Гамма-B кристаллина генов, расположенных ниже промотора Т7. РНК очищали с использованием хлорида лития осадков методом. Очищенная мРНК затем используется для перевода в пробирке. После инкубации перевод реакции на верхнем уровне 5-30% градиент сахарозы и центрифугировали в Beckman Coulter SW55-Ti ротора при 41000 оборотах в минуту, 4 ° С в течение 2 часов.
Рисунок 2. Выделение бычьего гамма-B кристаллина КРС стабильно связан с рибосомы 70S. 1 мкг мРНК смешиваются в 100 мкл реакции E. палочки S30 экстракт системы, как указано в протоколе раздел с 20 мкКи [35 S]-метионина и инкубировали при 30 ° С в течение 15 мин. После инкубации перевод реакции на верхнем уровне 5-30% градиент сахарозы в 20 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 15 мМ MgCl 2, 100 мМ ацетат калия, 1 мМ DTT и центрифугировали в Beckman Coulter SW55-Ti ротора на 41 000 оборотов в минуту, 4 ° С в течение 2 часов. По скорости оседания, градиент был выгружен и рибосомы про ле было получено. Эти данные были записаны в программе PeakTrak (ISCO градиент градиент плотности фракционирования системы). Фракции были собраны, белка TCA осаждается и решен на 16,5%, T, C 6% Трис-Тricine геле 15. Гель сушили и подвергаются за авторадиографии. После воздействия геля проверены с использованием Тайфун 9410 изображений сканера. Рисунок 2.1 показывает, что полный текст Гамма-B кристаллина присутствует в 70S рибосоме фракций. Таким образом, МЭСМ срыва последовательность позволяет изолировать стабильного бычьего гамма-B КРС кристаллина. Данные на рисунке 2.2 ясно показывают, что изолированные КРС действительно стабильным. В нынешнем эксперименте 70-х фракций после первого тура центрифугирования в градиенте сахарозы были объединены и сахарозы удалить с помощью Amicon Ультра-4 центробежного фильтра блока (Millipore), затем буфер обмена в растворе, содержащем 20 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 15 мМ MgCl 2, 100 мМ ацетат калия, 1 мМ DTT. Этот пример был также подвергнут дополнительной раунд центрифугирования через 5-30 градиент сахарозы% и фракционированных. Каждая фракция обработаны и проанализированы как на рисунке 2.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для воспроизводимости результатов, качества и концентрации компонентов, используемых для транскрипции в пробирке и перевод являются критическими. Мы использовали коммерчески доступные в пробирке транскрипции и трансляции выдержки, и они дают эффективные и воспроизводимые результаты, если осторожно. Качество мРНК может повлиять на перевод, так что имеет огромное значение для проверки целостности РНК, прежде чем использовать его для перевода в пробирке. Инкубационный время в пробирке перевод варьируется в зависимости от длины белка. Кроме того, время / скорость центрифугирования может быть скорректирована в случае 70S рибосомной фракции не очень хорошо решены, и отделен от 50S. Кроме того, рибосомы связанных белковых комплексов следует обращаться осторожно, чтобы избежать загрязнения РНКазы. Кроме того, буфер условия должны быть проверены тщательно и хелатирующие агенты, которые могут хелатной Mg 2 + следует избегать.
МЭСМ арестПоследовательность, по его перевод взаимодействует с рибосомных белков L4 и L22, а также 23S рРНК в рибосомного туннеля 7,8. Ряд критических остатков, составляющих МЭСМ мотив ареста, F XXXX XXXX GIRAGP WI 7 (жирным шрифтом) имеют огромное значение, обеспечивая эффективность поступательного ареста. Мутации или делеции этих критических остатков может привести к облегчению арест перевод удлинение 7,8. Таким образом, сохраняя последовательность МЭСМ мотив ареста F XXXX XXXX GIRAGP WI 7 нетронутыми жизненно важно для того, чтобы белок при исследовании будет оставаться стабильно связан с рибосомой.
Этот метод может быть использован для анализа структуры совместного поступательного промежуточных и ко-поступательные складывания различных белков. Он был недавно успешно используется для точного определения структуры ое несколько рибосом связанных зарождающейся цепей с помощью ЯМР 10-11. Кроме того, этот метод также может быть использован для создания зарождающейся пептиды заданные размеры для анализа их третичные взаимодействия с аксессуаром белков, кофакторов или лигандами.
Альтернативный подход для создания комплексов КРС предусматривает использование усеченных мРНК отсутствие стоп-кодон. Такой подход широко используется многими исследователями для изучения совместного поступательного сворачивания белка, см., например, 12,16. Однако он имеет ряд недостатков. Такой подход не может быть использован в естественных условиях, а также проблематичны для использования в пробирке с Е. палочки извлечь в связи с наличием в E. кишечной системы ССРА, что посредником добавлением С-концевой пептид тег (AANDENYALAA) с белками, в переводе с мРНК, не в рамке кодона стоп, что приводит к их деградации 17. Таким образом, в последнем случае, необходимо использовать совершенно восстановления имtuted системы и / или системы, не хватает / подавления ССРА пометки техники. МЭСМ направленных срыва является эффективным и уникальным, как было доказано, чтобы произвести тупик рибосомы комплексов в естественных условиях и в пробирке с почти аналогичной эффективностью 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась по программе по науке пограничной грант RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
