Summary
Se describe aquí una técnica que ahora se utilizan habitualmente para aislar de forma estable consolidados complejos ribosoma cadena naciente (RNC). Esta técnica aprovecha el descubrimiento de que un joven de 17 aminoácidos de longitud SecM "secuencia de la detención" puede detener la elongación de la traducción en un procariota (
Abstract
Una amplia investigación ha proporcionado evidencias que sugieren que la proteína de amplios plegado en la célula es un proceso de co-traduccional 1-5. Sin embargo, el camino exacto que sigue la cadena polipeptídica durante la co-translacional de plegado para alcanzar su forma funcional es todavía un enigma. A fin de comprender este proceso y para determinar la conformación exacta de los compuestos intermedios plegables co-traduccionales, es esencial para desarrollar técnicas que permiten el aislamiento de RNC que transportan las cadenas nacientes de tamaños predeterminados para permitir su análisis estructural adicional.
SecM (monitor de secreción) es una E. 170 aminoácidos E. proteína que regula la expresión de la corriente abajo Seca (secreción de conducción) ATPasa en el operón SECM-seca 6. Nakatogawa e Ito originalmente encontrado que una secuencia de 17 aminoácidos de largo (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) en la región C-terminal de la proteína SecM es suficiente y necesaria paraoriginar la detención de la elongación en el SecM Gly165, produciendo de esta manera peptidil-tRNA-glicil estable vinculado a la P-ribosomal sitio de 7-9. Más importante aún, se encontró que esta secuencia de 17 amino ácido larga se pueden fusionar a la C-terminal de virtualmente cualquier proteína de longitud completa y / o truncado permitiendo así la producción de RNC llevan cadenas nacientes de tamaños predeterminados 7. Así, cuando se fusiona o se inserta en la proteína diana, la secuencia SecM estancamiento produce detención de la elongación de la cadena polipeptídica y genera RNC estables tanto in vivo en E. células de E. e in vitro en un sistema libre de células. Centrifugación en gradiente de sacarosa se utiliza además para aislar RNC.
Los RNC aisladas pueden ser utilizados para analizar las características estructurales y funcionales de los compuestos intermedios plegables co-traduccionales. Recientemente, esta técnica se ha utilizado con éxito para obtener información sobre la estructura de los ribosomas varias cadenas unidas nacientes 10,11. Aquí se describe el aislamiento de las especies bovina Gamma-B Cristalina RNC fusionado a SecM y generada en un sistema de traducción in vitro.
Protocol
1. Preparación del ADN de plantilla y la transcripción in vitro
- El gen de interés se clona en cualquier T7 y / o, por ejemplo promotor SP6 basado plásmido. Para obtener RNC de interés, C-terminal de la meta de polipéptido se extiende mediante la adición de secuencia detención inductor de SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. Con el fin de asegurar que el fragmento de polipéptido de interés fluirá hacia fuera del túnel ribosómico, la parte C-terminal de la proteína diana tiene que extenderse por lo menos 30 aminoácidos 12-14. Un flexible glicina-serina enlazador rica puede introducirse entre la proteína y la secuencia de detención SecM para evitar cualquier restricciones conformacionales posibles.
- Para la transcripción in vitro, el ADN plantilla debería ser linealizado con la enzima de restricción de corte aguas abajo de la ORF. Uno tiene que verificar linealización completa del ADN de plásmido mediante la ejecución del producto de digestión de restricción en la electroforesis en gel de agarosa.
- El plasma linealizadoIdentificación se utiliza además para reacción de transcripción in vitro. Diferentes concentraciones de ADN molde se puede analizar para determinar las concentraciones de ADN óptima requerida para la transcripción in vitro. Por lo general, con Megascript Kit de alta Ambion de transcripción rendimiento (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 mg de ADN linearizado produce ARNm 40-60 g. En la transcripción in vitro se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) .
- Tras la transcripción in vitro, el ARNm se purifica por precipitación de cloruro de litio de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Megascript Kit de alta Ambion de transcripción rendimiento, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
- integridad ARNm se ve verificada por electroforesis utilizando acrilamida o geles de agarosa.
2. Traducción in vitro
Para la traducción in vitro utilizando la estrategia en tiempo real de E. coli 100 HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD), siga los siguientes pasos:
- Preparar 100 l de instrucción de la traducción in vitro fabricante de la reacción siguiente. En pocas palabras, en agua libre de nucleasa añadir 24 l mezcla de aminoácidos menos metionina (1 mM), 10 unidades de inhibidor de la ribonucleasa (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 Ci de los desechos radiactivos [35 S] MP Biomedicals-metionina (, Solon, OH), 20 l mezcla de reacción, 24 tampón Reconstitución l y 24 l de E. E. lisado.
- Incubar la reacción a 30 ° C durante 5 min para pre tibia la reacción de traducción. Añadir 1-2 g de ARNm para la reacción de traducción y se incuba a 30 ° C durante 10-15 minutos.
- Se detiene la reacción mediante la colocación de la reacción de traducción en hielo.
3. Aislamiento de polipéptido naciente de reacción de traducción in vitro
- Para aislar RNC, la reacción de traducción se coloca sobre la parte superior de 4,5 ml de gradiente 5-30% de sacarosa en 20 mM de HEPES-KOH pH 70,5, 15 mM de MgCl 2, 100 mM de acetato de potasio, DTT 1 mM y se centrifugó utilizando Beckman Coulter SW55-Ti rotor a 41.000 rpm, 4 ° C durante 2 horas.
- Tras la centrifugación, el gradiente de sacarosa se fracciona para aislar diferentes poblaciones ribosomal y asociados cadenas nacientes. La separación se controla mediante el sistema de la CIUO programable, con gradiente de densidad de grabación continua a 254 nm utilizando un detector de la CIUO UA-6 absorbancia.
- La fracción (s) que contiene 70 ribosomas se recogen y analizan más dependiendo de la finalidad del experimento.
4. La observación de proteína unida a ribosoma con Tris-tricina SDS-PAGE
Para comprobar, si la proteína extendida SecM permanece unida al ribosoma 70S, las fracciones del gradiente se recogieron y se trataron como sigue:
- La proteína en cada fracción se precipita por adición de ácido tricloroacético (TCA) a una concentración final de 10% y se incubaron a 4 ° C overniGHT.
- Después de la incubación durante la noche, las muestras se centrifugaron a 14.000 X g durante 15 minutos para sedimentar la proteína. Después de la centrifugación el sobrenadante se eliminó y el sedimento se lavó dos veces con acetona solución que contiene: 1 mM Tris-HCl pH 7,6 (04:01). Pellet era aire más seca y se disuelve en tampón de carga de SDS-PAGE.
- La muestra tratada se resolvió y se analizaron por Tris-tricina SDS-PAGE.
- Después de la electroforesis, los geles se fijaron, se secó al vacío utilizando gel de tintorero y se sometió a autorradiografía. La distribución de los polipéptidos nacientes se observaron utilizando phosphoimaging.
5. Los resultados representativos
Aquí presentamos un experimento que describe el aislamiento de la longitud completa de bovino gamma-B Cristalina establemente unido a ribosoma 70S. La Figura 1 muestra los pasos implicados en el aislamiento de las especies bovina B gamma-RNC cristalinas. El C-terminal de la Cristalina gamma-B se extiende en general por 32 aminoácidos to asegurar que las extrusiones proteína de longitud completa fuera del túnel ribosomal, lo que también incluye la secuencia SecM estancamiento colocado en la misma C-terminal del polipéptido de fusión. Después de la traducción in vitro, los ribosomas 70S se aislaron por centrifugación en gradiente de sacarosa (Figura 2.1). Con el fin de asegurar que la proteína se mantiene establemente unido al ribosoma, 70S que contienen fracciones se agruparon, tampón desalado, intercambio y se sometió a una ronda adicional de centrifugación en gradiente de sacarosa (Figura 2.2). El resultado presentado en la figura 2 indica claramente que SecM de manera eficiente puede inducir la detención de traslación de las RNC B Gamma-cristalina.
Figura 1. Explicación esquemática de los pasos implicados en el aislamiento de RNC. C-terminal de bovino gamma-B Cristalina se extendió por 32 secuencia de aminoácidos. Esto se extendíaC-terminal de las regiones también incluye la secuencia de detención SecM. Gamma-B Cristalina con la secuencia se clonó en SecM Pivex 2,3 (T7 basado) plásmido. Para la transcripción in vitro del ADN molde se linealizó por digestión con XbaI. Plantilla linealizado fue utilizado además para la transcripción in vitro. El T7 en la plantilla de ADN es reconocida por la RNA polimerasa T7 que transcribe las aguas abajo gamma-B de genes localizados Cristalina del promotor T7. ARNm se purificó utilizando cloruro de litio método de precipitación. El mRNA purificado se utiliza entonces para la traducción in vitro. Después de la incubación, la reacción de traducción se estratificó en la parte superior del gradiente de 5-30% de sacarosa y se centrifuga en Beckman Coulter SW55-Ti rotor a 41.000 rpm, 4 ° C durante 2 horas.
Figura 2. El aislamiento de las especies bovina Gamma-B Cristalina RNC establemente unido al ribosoma 70S. 1 mRNA g se mezcló en la reacción de 100 l E. E. Sistema de extracto S30 tal como se menciona en la sección de protocolo con 20 Ci [35 S]-metionina y se incubaron a 30 ° C durante 15 min. Después de la incubación, la reacción de traducción se estratificó en la parte superior del gradiente de 5-30% de sacarosa en 20 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 15 mM de MgCl 2, 100 mM de acetato de potasio, DTT 1 mM y se centrifugó en Beckman Coulter SW55-Ti rotor a 41.000 rpm, 4 ° C durante 2 horas. Tras la sedimentación velocidad, el gradiente se descargó y el ribosoma Le Pro se obtuvo. Los datos fueron registrados por el programa PeakTrak (gradiente CIUO gradiente de densidad sistema de fraccionamiento). Se recogieron las fracciones, la proteína fue TCA precipitó y se resolvieron en T 16,5%, 6% de C Tris-Tricina PAGE gel 15. El gel se seca y se expone a autorradiografía. Tras la exposición del gel fue escaneada con Typhoon 9410 escáner de imágenes. La figura 2.1 muestra que la longitud completa de Gamma-B Cristalina está presente en las fracciones 70S del ribosoma. Por lo tanto, la secuencia SecM estancamiento permite el aislamiento de las especies bovina estables B Gamma-RNC cristalinas. Los datos de la Figura 2.2 indican claramente que los RNC aislados son de hecho estable. En el presente experimento las fracciones 70S después de la primera ronda de centrifugación en gradiente de sacarosa se agruparon y la sacarosa se eliminó utilizando Amicon Ultra-4 Unidad centrífuga filtro (Millipore), seguido por tampón de cambio en solución que contenía 20 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM de acetato de potasio, 1 mM DTT. Esta muestra fue sometida además a una ronda adicional de centrifugación a través de gradiente 5-30% de sacarosa y se fraccionó. Cada fracción fue tratada y analizada como en la Figura 2.1.
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Discussion
Para obtener resultados reproducibles, la calidad y la concentración de los componentes utilizados para la transcripción y traducción in vitro son críticos. Hemos utilizado comercialmente disponible la transcripción in vitro y los extractos de traducción y que dan resultados eficaces y reproducibles, si se maneja con cuidado. Calidad de ARNm pueden afectar a la traducción, por lo que es de suma importancia para probar la integridad del ARNm antes de usarla para traducción in vitro. El tiempo de incubación para la traducción in vitro varía con la longitud de la proteína. Además, el tiempo / velocidad de centrifugación se puede ajustar en consecuencia, en el caso, la fracción 70S ribosomal no se resuelve bien y separados de los años 50. Además, el ribosoma complejos de proteínas unidas deben ser manejados cuidadosamente para evitar la contaminación de RNasa. Además, las condiciones de amortiguación debe controlarse cuidadosamente y agentes quelantes que pueden quelan Mg 2 + debe ser evitado.
SecM arrestosecuencia, en su traducción interactúa con las proteínas ribosómicas L4 y L22, así como ARNr 23S en el túnel ribosómica 7,8. Un número de residuos críticos, que constituyen el motivo del arresto SecM, F XXXX XXXX WI GIRAGP 7 (en negrita) son de gran importancia, lo que garantiza la eficiencia de la detención de la traducción. Las mutaciones o deleciones de estos residuos críticos pueden producir un alivio de la detención de elongación de la traducción 7,8. Por lo tanto, el mantenimiento de la secuencia del motivo detención SecM F XXXX XXXX WI GIRAGP 7 intacta es absolutamente crítica para asegurar que la proteína en estudio se mantendría establemente unido al ribosoma.
Esta técnica puede ser utilizada para el análisis de la estructura de co-traduccionales intermedios y co-traduccional plegables de diversas proteínas. Recientemente se ha utilizado con éxito para determinar la exacta estructura of varios ribosoma cadenas enlazadas naciente con la ayuda de RMN 10-11. Además, esta técnica también puede utilizarse para generar péptidos nacientes de tamaños predeterminados para el análisis de sus interacciones con proteínas accesorias terciarias, cofactores o ligandos.
Un enfoque alternativo para producir complejos de RNCs implicaría el uso de ARNm truncadas que carecen de codón de parada. Este enfoque ha sido ampliamente utilizado por muchos investigadores para estudiar el plegamiento de proteínas co-traduccional véase, por ejemplo 12,16. Sin embargo, tiene una serie de inconvenientes. Este enfoque no puede ser empleado en vivo y también problemático para el uso in vitro con E. E. extraer debido a la presencia en E. E. del sistema de SsrA que media la adición de la etiqueta C-terminal del péptido (AANDENYALAA) a las proteínas traducidas del ARNm, sin codones de terminación en-marco, que conduce a su degradación 17. Por lo tanto, en este último caso, uno tiene que usar una reconstitución completamentetuido sistema y / o un sistema, sin / supresión de SsrA el etiquetado de máquinas. SecM dirigida estancamiento es eficiente y única como se ha demostrado para producir estancadas complejos ribosoma in vivo e in vitro con eficiencia casi similar 18.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Programa de Ciencias Humanas de subvención RGP0024 Frontera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
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