Summary
Vi beskriver här en teknik som nu används rutinmässigt för att isolera stabilt bunden ribosom framväxande kedjan komplex (RNC). Denna teknik drar fördel av upptäckten att en 17 aminosyror lång SecM "gripande sekvens" kan stoppa översättning töjning i en prokaryot (
Abstract
Omfattande forskning har gett gott om bevis som tyder på att protein vika i cellen är ett samarbete translationell process 1-5. Men är den exakta väg som polypeptidkedja följer vid samtidig translationell vikning för att uppnå funktionell form fortfarande en gåta. För att förstå denna process och att bestämma den exakta utformningen av de sam-translationella hopfällbara intermediärer, är det viktigt att utveckla tekniker som gör det möjligt isolering av RNC bär begynnande kedjor av förutbestämda storlek att de kan ytterligare strukturella analys.
SecM (utsöndring monitor) är en 170 aminosyror E. coli protein som reglerar uttrycket av nedströms SecA (sekretion körning) ATPas i secM-seca operon 6. Nakatogawa och Ito funnit ursprungligen som en 17 aminosyror lång sekvens (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) i den C-terminala regionen av SecM proteinet kunna räcka för attorsaka blockering av SecM töjning vid Gly165, varigenom peptidyl-glycyl-tRNA stabilt bunden till den ribosomala P-platsen 7-9. Ännu viktigare, fann man att denna 17 aminosyror långa sekvensen kan vara sammansmält med C-terminalen av praktiskt taget vilken full längd och / eller trunkerade proteinet vilket möjliggör framställning av RNC transporterar begynnande kedjor av förutbestämda storlekar 7. Således, när smält eller sättas in i mål-proteinet, producerar SecM tjuvstopp sekvens gripande av polypeptiden kedjeförlängningen och genererar en stabil RNC både in vivo i E. coli-celler och in vitro i ett cellfritt system. Sackarosgradientcentrifugering vidare användas för att isolera RNC.
De isolerade RNC kan användas för att analysera strukturella och funktionella egenskaper hos de samtidigt translationella fällbara intermediärer. Nyligen har denna teknik använts framgångsrikt för att få insikt i strukturen av ett flertal ribosom bundna begynnande kedjor 10,11,. Här beskriver vi isoleringen av bovint gamma-B-kristallin RNC smält till SecM och genereras i en in vitro-translationssystem.
Protocol
1. DNA-mall Framställning och in vitro transkription
- Genen av intresse klonas i någon T7 och / eller t.ex. SP6-promotorn baserad plasmid. För att erhålla RNC av intresse, är C-terminalen av målpolypeptiden förlängas genom att lägga till sekvensen gripande inducerande av SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. För att säkerställa att polypeptiden fragmentet av intresse kommer extrudera ut ur ribosomala tunneln har den C-terminala delen av mål-proteinet som skall förlängas med minst 30 aminosyror 12-14. En flexibel Glycin-Serin rik linkern kan införas mellan proteinet och den SecM gripande sekvensen för att undvika eventuella konformationsbegränsningar.
- För in vitro transkription bör mall-DNA lineariserades med restriktionsenzym skärning nedströms ORF. Man måste verifiera fullständig linearisering av plasmid-DNA genom att köra den produkt restriktionsdigerering på agarosgelelektrofores.
- Den linjäriserade plasmid vidare användas för in vitro transkriptionsreaktion. Olika koncentrationer av mall-DNA kan testas för att identifiera optimala DNA-koncentration som erfordras för transkription in vitro. Allmänhet med Ambion s MEGAscript Hög avkastning Transkription Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), ger 1 ng linjär DNA 40-60 ug mRNA. In vitro transkription sker efter tillverkarens instruktioner (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) .
- Efter in vitro transkription, mRNA renas genom litiumklorid fällning enligt tillverkarens instruktioner (Ambion s MEGAscript Hög avkastning Transcription Kit, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
- mRNA integritet verifierades ytterligare genom elektrofores med användning av akrylamid eller agaros-geler.
2. In vitro translation
För in vitro translation med RTS 100 E. coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD) följer du stegen nedan:
- Framställ 100 | il av in vitro-translationsreaktionen följande tillverkarens instruktioner. Kortfattat, i nukleasfritt vatten tillsätt 24 | il aminosyrablandning minus metionin (1 mM), 10 enheter ribonukleasinhibitor (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 | iCi radioaktivt [35S]-metionin (MP Biomedicals, Solon, OH), 20 pl-reaktionsblandning, 24 | il Rekonstitution buffert och 24 pl av E. coli-lysat.
- Inkubera reaktionen vid 30 ° C under 5 min för att i förväg värmdes translationsreaktion. Tillsätt 1-2 pg mRNA till translationsreaktionen och inkubera vid 30 ° C under 10-15 min.
- Stoppa reaktionen genom att placera translationsreaktionen på is.
3. Isolering av Nascent polypeptid från in vitro-translationsreaktionen
- Att isolera RNC är translationsreaktionen skiktades på toppen av 4,5 ml av 5-30% sackarosgradient i 20 mM HEPES-KOH pH 70,5, 15 mM MgCl2, 100 mM kaliumacetat, 1 mM DTT och centrifugerades vid 41 tusen varv per minut med användning av Beckman Coulter SW55-Ti-rotor, 4 ° C under 2 timmar.
- Efter centrifugering är sukrosgradient fraktioneras för att isolera olika ribosomala populationer och tillhörande framväxande kedjor. Separation övervakas med hjälp av ISCO programmerbara systemet Density gradient med kontinuerlig inspelning vid 254 nm med hjälp av en ISCO UA-6 absorbans detektor.
- Den fraktion (er) innehållande 70S-ribosomer uppsamlas och analyseras vidare beroende på syftet av experimentet.
4. Observation av protein bundet till ribosomen med Tris-tricin SDS-PAGE
För att kontrollera om det SecM förlängda proteinet förblir fäst till 70-talet ribosomen, var gradientfraktionerna samlas in och behandlas enligt följande:
- Protein i varje fraktion fälldes ut genom tillsats av triklorättiksyra (TCA) till en slutlig koncentration av 10% och inkuberades vid 4 ° C overniGHT.
- Efter inkubation över natten, togs prover centrifugerades vid 14.000 X g under 15 minuter för att pelletera proteinet. Efter centrifugering avlägsnades supernatanten och pelleten tvättades två gånger med lösningen innehållande Aceton: 1 mM Tris-HCl, pH 7,6 (04:01). Pelleten ytterligare lufttorkades och löstes i SDS-PAGE-laddningsbuffert.
- Det behandlade provet löstes och analyserades genom Tris-tricin SDS-PAGE.
- Efter elektrofores fixerades gelerna, torkades med användning av vakuum-gel Dyer och utsattes för autoradiografi. Fördelningen av begynnande polypeptider observerades med användning av phosphoimaging.
5. Representativa resultat
Här presenterar vi ett experiment som beskriver isolering av fullängds-bovint gamma-B-kristallin stabilt bunden till den 70S ribosomer. Figur 1 visar stegen som är involverade vid isolering av bovint gamma-B-kristallin RNC. C-terminalen av den gamma-B-kristallin förlängdes totalt med 32 aminosyror to säkerställa att fullängdsproteinet extruderar ut ur ribosomala tunneln, vilket också innefattar SecM tjuvstopp sekvensen placerad vid mycket C-terminalen av fusionspolypeptiden. Efter translation in vitro, de 70S-ribosomer isolerades genom sackaros-gradientcentrifugering (figur 2,1). För att säkerställa att proteinet förblir stabilt bunden till ribosomen, de 70S innehållande fraktionerna poolades, avsaltades bufferten byttes och utsattes för en ytterligare runda av sackarosgradientcentrifugering (figur 2,2). Resultatet presenteras i figur 2 visar tydligt att SecM effektivt kan framkalla translationell gripandet av gamma-B kristallin RNC.
Figur 1. Schematisk beskrivning av stegen som är involverade vid isolering av RNC. C-terminalen av bovint gamma-B-kristallin förlängdes med 32 aminosyrasekvensen. Denna utökadeC-terminala regionerna innefattar även SecM gripande sekvens. Gamma-B-kristallin med SecM sekvensen klonades i pIVEX 2,3 (T7-baserade) plasmiden. För in vitro transkription av mall-DNA lineariserades genom Xbal. Linjäriserad mall används vidare för in vitro transkription. T7 i DNA-mallen känns igen av T7-RNA-polymeras transkriberar den gamma-B-kristallin-genen belägen nedströms om T7-promotorn. mRNA renades med litium-metoden klorid nederbörd. Den renade mRNA användes sedan för in vitro-translation. Följande inkubering translationsreaktionen skiktades på toppen av 5-30% sackarosgradient och centrifugerades i Beckman Coulter SW55-Ti-rotor vid 41 tusen varv per minut, 4 ° C under 2 timmar.
Figur 2. Isolering av nötkreatur Gamma-B kristallin RNC stabilt bunden till 70S ribosomen. 1 ug mRNA blandades i 100 pl reaktion E. coli S30-extrakt System såsom nämns i det protokoll med sektionen 20 pCi [35S]-metionin och inkuberades vid 30 ° C under 15 minuter. Följande inkubering translationsreaktionen skiktades på toppen av 5-30% sackarosgradient i 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl2, 100 mM kaliumacetat, 1 mM DTT och centrifugerades i Beckman Coulter SW55-Ti-rotor vid 41 tusen rpm, 4 ° C under 2 timmar. Efter hastigheten sedimentation, var lutning lossas och ribosomen pro le erhölls. Data registrerades med PeakTrak programmet (ISCO-gradient densitetsgradient fraktioneringssystemet). Fraktioner samlades, var proteinet TCA ut och beslutade om 16,5% T, 6% C Tris-Tricin PAGE-gel 15. Gelén torkades och exponerades för autoradiografi. Efter exponering gelén skannas med Typhoon 9410 imaging scanner. Figur 2,1 visar att fullängds Gamma-B kristallin finns i 70S ribosomen fraktioner. Således tillåter SecM överstegring sekvens isolering av de stabila bovint gamma-B-kristallin RNC. Data i figur 2,2 visar tydligt att de isolerade RNC är verkligen stabila. I det aktuella experimentet 70S fraktioner efter första omgången av sackarosgradientcentrifugering poolades och sackaros avlägsnades med användning av Amicon Ultra-4 centrifugaltyp filterenhet (Millipore) följt av buffertbyte i lösning innehållande 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl2, 100 mM kaliumacetat, 1 mM DTT. Detta prov utsattes vidare för en ytterligare runda av centrifugering genom 5-30% sackarosgradient och fraktionerades. Varje fraktion behandlades och analyserades som i figur 2,1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För reproducerbara resultat, kvalitet och koncentrationen av de komponenter som används för in vitro transkription och translation är kritiska. Vi har använt kommersiellt tillgängliga in vitro transkription och extrakt översättning och de ger effektiva och reproducerbara resultat, om den hanteras varsamt. Kvaliteten på mRNA kan påverka översättningen, så det är av yttersta vikt att testa integritet mRNA innan du använder den för in vitro translation. Inkubationstiden för in vitro-translation varierar med längden av proteinet. Dessutom kan tid / hastighet centrifugering anpassas i enlighet med i fallet är 70S ribosomala fraktionen inte bra lösta och separeras från 50-talet. Vidare bör ribosom bundna proteinkomplex hanteras noggrant för att undvika RNas kontaminering. Dessutom bör buffertbetingelser följas noggrant och kelatmedel som kan kelaterar Mg 2 + bör undvikas.
SecM gripandesekvens, när dess översättning interagerar med ribosomproteiner L4 och L22 samt 23S rRNA i ribosomala tunneln 7,8. Ett antal kritiska rester, som utgör SecM gripandet motivet, F XXXX WI XXXX GIRAGP 7 (i fetstil) är av oerhörd betydelse att säkerställa effektiviteten i translationell gripandet. Mutationer eller deletioner av dessa kritiska rester kan leda till lindring av översättningen förlängningen gripandet 7,8. Sålunda bibehålla den sekvens av SecM gripande motivet F XXXX XXXX WI GIRAGP 7 intakt är absolut avgörande för att säkerställa att proteinet som studeras skulle förbli stabilt bundna till ribosomer.
Denna teknik kan användas för analys av strukturen av sam-translationella mellanprodukter och sam-translationell vikbara av olika proteiner. Det har nyligen framgångsrikt använts för att bestämma den exakta strukturen of flera ribosom bundna begynnande kedjor med hjälp av NMR 10-11. Dessutom kan denna teknik även användas för att generera halvfärdiga peptiderna med förutbestämda storlekar för analys av deras tertiära interaktioner med accessoriska proteiner, kofaktorer eller ligander.
Ett alternativt tillvägagångssätt för att producera RNC komplex skulle innebära användning av trunkerade mRNA som saknar stoppkodon. Detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning av många forskare för att studera sam-translationella proteinveckning se t ex 12,16. Emellertid har det ett antal nackdelar. Detta tillvägagångssätt kan inte användas in vivo och också problematisk för användning in vitro med E. coli-extrakt på grund av närvaron i E. coli av SsrA system som medierar tillsats av den C-terminala peptid-märke (AANDENYALAA) till proteiner translaterade från mRNA utan i-ram stoppkodon, vilket leder till deras nedbrytning 17. Därför, i det senare fallet måste man använda en fullständigt rekonstitueradtuted och / eller ett system, som saknar / undertrycka SsrA-märkning maskiner. SecM-riktat stannar är effektiv och unik eftersom det har visat sig ge stannade ribosomkomplex in vivo och in vitro med nästan samma effektivitet 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Human Frontier Science Program bidrag RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
