Summary
Biz burada artık rutin stabil bağlı ribozom doğmakta olan zincir kompleksleri (RNCs) izole etmek için kullanılan bir tekniği açıklar. Bu teknik bir 17 amino asit uzunluğunda SECM "tutuklama" dizisi bir prokaryotik çeviri uzama durdurmak olduğunu keşif yararlanır (
Abstract
Kapsamlı araştırma hücrede protein katlanması eş öteleme işlemi 1-5 olduğunu düşündüren yeterli kanıt sağlamıştır. Ancak, polipeptid zinciri işlevsel formunu elde etmek için işbirliği translasyonal katlama sırasında izlediği kesin yolu hala bir muammadır. Bu proses anlamak ve co-translasyon katlama aramaddelerinin tam konformasyon belirlemek amacıyla, bu da daha fazla yapısal analizi izin vermek için önceden belirlenmiş bir büyüklükteki olgunlaşmamış zincirler taşıyan RNCs izolasyonu izin teknikleri geliştirmek için gereklidir.
SECM (sekresyon monitör) 170 amino asit olan E. SECM-seca operon 6 içerisinde aşağı SecA (salgılanması sürüş) ATPase ekspresyon düzenleyen coli proteini. Nakatogawa ve Ito başlangıçta SECM proteininin C-ucu bölgesi içinde bir 17 amino asit sekansı, uzun (150-FSTPVWISQA QGIRA g p-166) için yeterli ve gerekli olduğu bulunduböylece peptidil-glisil-tRNA stabil 7-9 P-site ribozomal bağlı üreten, Gly165 az SECM uzama durmasına neden olur. Daha da önemlisi, bu 17 amino asit sekansı, uzun, böylece önceden belirlenmiş boyutlardaki 7 olgunlaşmamış zincirler taşıyan RNCs üretimini sağlayan hemen hemen herhangi bir tam uzunlukta ve / veya kesilmiş proteininin C-ucu oluşturacak şekilde eklenebilir olduğu bulunmuştur. Böylece, hedef proteinin içine kaynaşmış ya takıldığında, SECM durdurduklarını sekansı polipeptid zinciri uzama durması üretir ve E. in vivo hem de istikrarlı RNCs üretir coli hücreleri ve hücre içermeyen sisteminde in vitro. Sakkaroz degrade santrifüj daha RNCs izole etmek için kullanılır.
İzole RNCs co-translasyon katlama aramaddelerinin yapısal ve fonksiyonel özellikleri analiz etmek için kullanılabilir. Son zamanlarda, bu tekniğin başarılı birçok ribozom bağlı doğmakta zincirleri 10,11 yapısı içgörü kazanmak için kullanılmıştır. Burada sığır Gamma-B kristalen izolasyonu tarif SECM için erimiş ve in vitro çeviri sistemi bir oluşturulur RNCs.
Protocol
1. Şablon DNA hazırlanması ve in vitro transkripsiyonu sonucunda
- Ilgi genindeki bir T7 ve / veya örneğin plazmid göre SP6 promoter içinde klonlanmış edilir. Ilgi RNCs elde etmek için, polipeptid hedef C-terminali SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7 durması indükleyici dizisinin eklenmesi ile uzar. Ilgi polipeptid fragmanı ribozom tünel dışarı a'ya emin olmak için, hedef protein C-ucu kısmı 12-14, en azından 30 amino asitleri ile uzatılabilir zorundadır. Esnek bir Glisin-serin zengin bir bağlayıcının herhangi bir olası konformasyonel kısıtlamaları önlemek için, protein ve SECM durması dizisi arasında sokulabilir.
- In vitro transkripsiyonu sonucunda için, şablon DNA ORF mansap kesme sınırlama enzimi ile lineerleştirilebilir edilmelidir. Bir agaroz jel elektroforez ile ilgili sınırlama sindirim ürünü çalıştırarak plazmid DNA tam doğrusallaştırma doğrulamak için gereklidir.
- Lineerleştirilmiş plazmaid fazla in vitro transkripsiyon reaksiyonunda kullanılmıştır. Şablon DNA, farklı konsantrasyonda in vitro transkripsiyonu sonucunda için gereken optimal DNA konsantrasyonu tespit etmek test edilebilir. Genellikle Ambion Kullanıcı MEGAscript Yüksek verim Transkripsiyon Seti (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) ile, 1 mikrogram lineerleştirilebilir DNA 40-60 mikrogram mRNA verir. In vitro transkripsiyon olarak üreticinin talimat (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) takip yapılır .
- In vitro transkripsiyon ardından mRNA üreticinin talimat (Ambion Kullanıcı MEGAscript Yüksek verim Transkripsiyon Takımı, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) göre lityum klorür yağış ile arıtılır.
- mRNA bütünlüğünü daha da akrilamid veya agaroz jel kullanılarak elektroforez ile doğrulanır.
2. In vitro Çeviri
RTS 100 E. coli HY Seti (5 Başbakan, Gaither kullanılarak in vitro çeviri içinsburg, MD) aşağıdaki adımları izleyin:
- In vitro çeviri reaksiyon aşağıdaki üreticinin talimat 100 ul hazırlayın. Kısaca, nükleaz ücretsiz su içinde 24 ul amino asit karışımı eksi metiyonin (1 mM), Ribonükleaz İnhibitörü 10 birim (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), radyoaktif 20 μCi [35 S] (-Methionine MP Biomedicals eklemek, Solon, OH), 20 ul Reaksiyon karışımı, 24 ul Sulandırma tampon ve E. 24 ul coli Lizat.
- Sıcak için önceden reaksiyon için 5 dakika süreyle 30 ° C'de inkübe reaksiyon. 10-15 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe çevirisi ve reaksiyon için mRNA 1-2 ug ekleyin.
- Buz üzerinde çeviri tepki koyarak reaksiyonu durdurun.
3. In vitro Çeviri Reaksiyonunda gelen Doğan ekleşimlerin İzolasyonu
- RNCs izole etmek için, çeviri reaksiyon 20 mM HEPES-KOH pH 7'de% 5-30 sakkaroz degrade 4.5 mL üstüne katmanlı0,5, 15 mM MgCl2, 100 mM potasyum asetat, 1 mM DTT ve, 41.000 rpm'de 4 Beckman Coulter SW55 rotor kullanılarak-Ti ° C'de 2 saat için santrifüjlenmiştir.
- Santrifüj sonrasında, sukroz gradient farklı ribozomal nüfus ve ilgili doğmakta olan zincirleri izole etmek fraksiyonlara olduğunu. Ayırma bir ISCO UA-6 absorbans dedektörü kullanılarak 254 nm sürekli kayıt ile ISCO Programlanabilir Yoğunluk Gradient Sistemi kullanılarak izlenir.
- 70S ribozom içeren fraksiyon (ler) toplanmış ve daha fazla deney amaca bağlı olarak analiz edilir.
4. Protein Gözlem Tris-trişin SDS PAGE ile ribozoma Bound
SECM genişletilmiş protein ribozom 70S bağlı kalır mı, kontrol etmek, degrade fraksiyonlar toplanmış ve aşağıdaki şekilde tedavi edildi:
- Her fraksiyonda proteinin% 10 arasında bir nihai konsantrasyona trikloroasetik asit (TCA) eklenerek çökeltilir ve 4 ° C'de inkübe edildi overniGHT.
- Gece boyunca inkübasyondan sonra, numuneler pelet 15 dk için protein 14.000 X g'de santrifüje edildi. Aşağıdaki santrifüjleme süpernatan kaldırılır ve pellet çözeltisi içeren aseton ile iki kez yıkandı: 1 mM Tris-HCl, pH 7.6 (04:01). Pelet daha da hava ile kurutulmuştur ve SDS-PAGE yükleme tamponu içinde eritildi.
- Tedavi örnek çözülmesi ve Tris-trişin SDS-PAGE ile analiz edilmiştir.
- Elektroforez sonrasında, agaroz tespit edildi, vakum jel boyacı kullanarak ve otoradyografi tabi kurutulur. Olgunlaşmamış polipeptidlerin dağılımı phosphoimaging kullanılarak tespit edilmiştir.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Burada stably ribozom 70S bağlı tam uzunlukta bovin gamma-B kristalen izolasyonu tanımlayan bir deney sunulmaktadır. Şekil 1 sığır gamma-B kristalen RNCs izolasyonu dahil adımları tasvir etmektedir. Gamma-B kristalen of C-terminali 32 amino asit t genel uzatılmıştırribozomal tünel olduğunu tam uzunlukta proteini extrudes dışarı sağlamak o, bu da polipeptid füzyon C-terminali çok yer SECM durdurduklarını dizisi içerir. In vitro çeviri ardından, 70S ribozomlar sukroz gradient santrifüj (Şekil 2.1) izole edildi. Protein stabil ribozom bağlı kalmasını sağlamak için, fraksiyonları içeren 70S toplandı, tuzu, tampon alışverişinde ve sukroz gradient santrifüj ek bir yuvarlak (Şekil 2.2) tabi. Şekil 2'de gösterilmiştir sonucu açıkça SECM verimli Gamma-B kristalen RNCs translasyonel tutuklama uyarabilir göstermektedir.
Şekil 1.. RNCs izole edilmesi söz konusu olan adımlar şematik bir açıklama. Bovin gamma-B kristalen bir C-terminali 32 amino asit sekansı uzatıldı. Bu genişletilmişC-terminal bölgeleri de SECM durması sekansı içerir. SECM sırası ile gamma-B kristalen pIVEX 2.3 (T7 bazlı) plazmid içinde klonlandı. In vitro transkripsiyonu sonucunda için DNA Xbal ile lineerleştirilebilir edildi. Lineerize şablon daha in vitro transkripsiyonu sonucunda için kullanılmıştır. DNA şablonu olarak T7 T7 promotörü arasında gamma-B kristalen geni bulunan aşağı doğru transkripsiyonun T7 RNA polimerazı tarafından kabul edilmektedir. mRNA lityum klorür çöktürme yöntemi kullanılarak saflaştırıldı. MRNA arıtılmış ve sonra vitro çeviri için kullanılmıştır. Inkübasyondan sonra reaksiyonun için 5-30% sukroz gradyanı üzerine katmanlı ve 2 saat boyunca 41.000 rpm, 4 ° C'de Beckman Coulter SW55 rotor-Ti santrifüjlendi.
Şekil 2. Sığır Gamma-B kristalen izolasyonu stabil 70S ribozom bağlı RNCs. 1 mcg mRNA 100 ul reaksiyon E. karıştırıldı coli S30 Ekstrakt Sistem 20 μCi [35S] ile protokolü bölümünde bahsedilen-metionin ve 15 dakika süreyle 30 ° C'de inkübe edildi. Inkübasyondan sonra reaksiyonun için 20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 15 mM MgCl2, 100 mM potasyum asetat, 1 mM DTT içinde% 5-30 sukroz gradyanı üzerine katmanlı ve 41.000 Beckman Coulter SW55 rotor-Ti santrifüjlendi rpm, 2 saat için 4 ° C'de. Hızın çöktürme takiben, gradyan boşaltılır edildi ve pro ribozom le elde edildi. Veri PeakTrak programı (ISCO gradyanı yoğunluk gradyanı fraksiyonasyon sistemi) tarafından kaydedildi. Kesirler toplandı, protein TCA çöktürüldü ve çözülmesi% 16.5 T,% 6 C Tris-T olduricine SAYFA jel 15. Jel, kurutulur ve otoradyografi için maruz bırakıldı. Aşağıdaki maruz jel Typhoon 9410 görüntüleme tarayıcısı kullanılarak taranmıştır. Şekil 2.1 tam uzunlukta Gamma-B kristalen 70S ribozom kesirler mevcut olduğunu göstermektedir. Böylece, SECM durdurduklarını sekansı stabil bovin gamma-B kristalen RNCs izolasyonu sağlar. Şekil 2.2 Veri açıkça izole RNCs gerçekten kararlı olduğunu göstermektedir. Mevcut deneyde sukroz gradient santrifüj ilk turu sonrasında 70S fraksiyonlar toplandı ve sukroz HEPES-KOH pH 7.5, 15 mM, 20 mM içeren çözüm tampon değişimi takip Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Ünitesi (Millipore) kullanılarak kaldırıldı MgCl2, 100 mM potasyum asetat, 1 mM DTT. Bu örnek% 5-30 daha sukroz gradyeni ve fraksiyonlara yoluyla santrifüjleme ek bir yuvarlak tabi tutuldu. Her bir fraksiyon muamele edilmiş ve Şekil 2,1 gibi analiz edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro transkripsiyonu ve çeviri için kullanılan bileşenlerin tekrarlanabilir sonuçlar, kalite ve konsantrasyonu için kritiktir. Biz in vitro transkripsiyon ve çeviri özleri içinde piyasaya kullanmış ve dikkatli eğer onlar, verimli ve tekrarlanabilir sonuçlar verir. MRNA Kalite çeviri etkileyebilir, bu nedenle in vitro çeviri için kullanmadan önce mRNA bütünlüğünü test etmek için büyük önem taşımaktadır. In vitro çeviri için inkübasyon süresi, proteinin uzunluğu ile değişir. Ayrıca, santrifüjleme ile zaman / hızı, buna göre ayarlanabilir durumda, 70S ribozom fraksiyonu de çözülmüş verilmez ve 50S ayrılır. Ayrıca, ribozom bağlı protein kompleksleri RNaz kirlenmesini önlemek için dikkatle ele alınmalıdır. Ayrıca, tampon koşulları dikkatle izlenmelidir ve Mg 2 yakalıyorlar olabilir kıskaç ajanlar + kaçınılmalıdır.
SECM tutuklamasekans, onun için ribozom tünel 7,8 in ribozomal proteinler ve L4 L22 yanı sıra, 23S rRNA ile etkileşim halinde. SECM tutuklama motifi oluşturan kritik artıkları, bir dizi, F XXXX WI XXXX GIRAGP 7 (kalın) translasyonel tutuklama etkinliğin sağlanması, büyük önem taşımaktadır. Mutasyonlar, ya da bu kritik kalıntılarının silme çeviri uzama tutuklama ile 7,8 kabartma yol açabilir. Böylece, SECM tutuklama motifi sırası muhafaza F XXXX WI XXXX GIRAGP sağlam 7 çalışma kapsamında protein stabil ribozom bağlı kalacağını sağlamak için kesinlikle önemlidir.
Bu teknik, co-translasyon ara maddeler ve çeşitli protein eş translasyon katlama yapısının analizi için kullanılabilir. Yakın zamanda, başarılı bir şekilde kesin yapısına o belirlemek için kullanılmıştırf NMR 10-11 yardımıyla birçok ribozom bağlı doğmakta olan zincirleri. Buna ek olarak, bu yöntem ayrıca aksesuar proteinler, kofaktörler ve ligandlar olan üçüncül etkileşimlerin analizi için önceden belirlenmiş bir büyüklükteki olgunlaşmamış peptid oluşturmak için de kullanılabilir.
RNCs kompleksleri üretmek için alternatif bir yaklaşım durdur kodon yoksun kesilmiş mRNA'lar kullanımı söz konusu olacaktır. Bu yaklaşım yaygın co-translasyonal protein katlanması örneğin 12,16 görmek incelemek için birçok araştırmacı tarafından kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu sakıncaları bir dizi sahiptir. Bu yaklaşım, in vivo olarak çalışan ve E. ile in vitro olarak kullanım için ayrıca problemli edilemez E. coli içerisinde varlığı nedeniyle özü SsrA sisteminin coli olduğu aracılık bunların degradasyon 17 yol açan, in-çerçevesi durdur kodonlar olmadan mRNA'lar çevrilmiş proteinleri ile C-terminal peptid etiket (AANDENYALAA) ilavesiyle. Bu nedenle, daha sonraki durumunda, tek bir tam reconsti kullanmak zorundaTÜTED sistemi ve / veya sistem, eksik / baskılayarak SsrA-etiketleme makineleri. Hemen hemen benzer verim 18 ile in vivo ve in vitro durdu ribozom kompleksleri üretmek için kanıtlanmıştır olarak SECM yönettiği durdurduklarını verimli ve benzersizdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma İnsan Frontier Bilim Programı hibe RGP0024 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
