Summary
इन्फ्लूएंजा वायरस मेजबान सेल chromatin के साथ सहयोग से उनके आरएनए जीनोम पेश करता है. यहाँ, हम chromatin से संक्रमित कोशिकाओं की विधि बरकरार यह वायरल ribonucleoprotein परिसरों शुद्ध उपस्थित थे. वायरल परिसरों शुद्ध दोनों पश्चिमी धब्बा और प्रोटीन और शाही सेना सामग्री का भजन की पुस्तक विस्तार से विश्लेषण किया जा सकता है, क्रमशः.
Protocol
प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध प्रवाह संचित्र छवि में दिखाया गया है. 1 और अभिकर्मकों की एक मेज के नीचे प्रस्तुत है.
1. संक्रमण (16 - 24 घंटे)
- HELA कोशिकाओं के बाहर 5 150 मिमी है Dulbecco बार संशोधित ईगल (DMEM) मध्यम उच्च ग्लूकोज मध्यम, ऐसी है कि वे लगभग 80% अगले दिन (लगभग 5 x 10 8 कोशिकाओं) confluency तक पहुंच जाएगा में प्लास्टिक सेल संस्कृति बर्तन में बीज. यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं 100% confluency, तक पहुँच नहीं है.
- अगले दिन पर, में Strep टैग इन्फ्लूएंजा वायरस के शेयर कमजोर फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) युक्त 0.3% गोजातीय सीरम albumin (BSA) के 3 के संक्रमण की बहुलता है.
- कोशिकाओं के विकास से मध्यम निकालें, Pbs के साथ एक बार धोना, और 10 मिलीग्राम पीबीएस कोशिकाओं को वायरस युक्त जोड़ने. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- DMEM उच्च ग्लूकोज के साथ संक्रमण मध्यम बदलें, और 37 पर ऊष्मायन जारी डिग्री सेल्सियस
2. Subcellular Fractionation (3 घंटे)
- कोशिकाओं को ठंड पीबीएस के साथ एक बार और फिर धो ठंड पीबीएस में एक रबर खुरचनी और एक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब के हस्तांतरण के साथ कोशिकाओं को निलंबित.
- 1,000 rpm पर 5 मिनट के लिए एक टेबल शीर्ष अपकेंद्रित्र में और फिर गोली कोशिकाओं पीबीएस महाप्राण (व्यंजन).
- 10 मिलीलीटर ठंड sucrose के बफर में resuspend सेल गोली (10 मिमी HEPES 7.9 पीएच, 10 मिमी KCl, 2 मिमी मिलीग्राम एसीटेट (MgOAc) के, 3 मिमी 2 CaCl, 340 मिमी सूक्रोज, 1 मिमी dithiothreitol है (डीटीटी), 1% protease अवरोध करनेवाला मिश्रण) . निलंबन के बाद, एक 200 μl विंदुक टिप एक 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक सीरम विंदुक सेल clumps को बाधित करने के लिए संलग्न के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती हैं.
- बर्फ पर 10 मिनट सेते हैं. धीरे समय समय पर का पलटना कोशिकाओं resuspend.
- उच्च गति में 0.5% और भंवर के अंतिम 15 सेकंड के लिए एकाग्रता के लिए P-40 Nonidet (NP - 40). तुरंत +३,५०० XG 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए टेबल टॉप centrifu में अपकेंद्रित्रजीई.
- 4 में निकालें सतह पर तैरनेवाला और दुकान डिग्री सेल्सियस यह cytoplasmic अंश है. गोली छोटे और मूल सेल गोली से सफेद होना चाहिए. सभी भिन्न 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे के लिए भंडारित किया जा सकता है
- 5 मिलीलीटर ठंड sucrose के बफर, फिर से अपकेंद्रित्र में 2.5 चरण में गोली के रूप में धो और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- Resuspend 1.5 मिलीग्राम ठंड nucleoplasmic निष्कर्षण बफर (50 मिमी 7.9 पीएच HEPES, 150 मिमी KOAc, 1.5 मिमी 2 MgCl, 0.1% एनपी-40, 1 मिमी डीटीटी, 1% protease अवरोध करनेवाला मिश्रण) में गोली (नाभिक युक्त).
- एक चुस्त मूसल के साथ एक ठंडा, सब कांच 4 मिली Dounce homogenizer स्थानांतरण और 20 स्ट्रोक के साथ नाभिक homogenize.
Homogenization दौरान झाग से बचें. प्रतिरोध लगभग 10 स्ट्रोक के बाद वृद्धि करनी चाहिए. कुशल homogenization में एक चरण विपरीत खुर्दबीन के नीचे पुष्टि की जा सकती है. - एक 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण homogenized नाभिक और 4 में एक rotating पहिया पर 20 मिनट सेते हैं °सी.
- 10 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 4 microcentrifuge में 16,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र.
- 4 में निकालें सतह पर तैरनेवाला और दुकान डिग्री सेल्सियस यह nucleoplasmic अंश है.
- 1.5 मिलीग्राम पाचन बफर (50 मिमी 7.9 पीएच HEPES, 10 मिमी NaCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी डीटीटी, 1% protease अवरोध करनेवाला मिश्रण, 100 यू / मिलीलीटर Benzonase है (शाही सेना के विश्लेषण के लिए, 20 यू / एमएल RNase के साथ विकल्प resuspend गोली मुक्त DNase मैं)) 37 पूर्व गरम डिग्री सेल्सियस, और 37 पर 10 मिनट सेते हैं डिग्री सेल्सियस
- 5 एम NaCl 42 μl (150 मिमी NaCl के अंतिम एकाग्रता के लिए) जोड़ें और 20 मिनट 4 में आगे सेते हैं डिग्री सेल्सियस
- 10 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 4 microcentrifuge में 16,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र.
- 4 में निकालें सतह पर तैरनेवाला और दुकान डिग्री सेल्सियस यह ch150 अंश है.
- Resuspend गोली 1.5 मिलीग्राम ठंड उच्च नमक बफर (50 मिमी HEPES 7.9 पीएच, 500 मिमी NaCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 0.1% एनपी-40, 1 मिमी डीटीटी, 1% protease अवरोध करनेवाला मिश्रण) और बर्फ पर 20 मिनट सेते हैं.
- 16,000 पर एक्स जी <अपकेंद्रित्र/ Em> में 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक microcentrifuge.
- 4 में निकालें सतह पर तैरनेवाला और दुकान डिग्री सेल्सियस यह ch500 अंश है.
3. Strep टैग शोधन (2 घंटे)
- Cytoplasmic अंश (150 मिमी NaCl के अंतिम एकाग्रता के लिए) के लिए 5 एम NaCl 300 μl जोड़ें.
- अशेष भाजक में पैक Strep - Tactin अंश प्रति एक 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब में Sepharose मोती 100 μl.
- मोती Strep धो बफर के 10 संस्करणों (20 मिमी HEPES के 7.9 पीएच, 150 मिमी NaCl (ch500 नमूने के लिए 500 मिमी NaCl), 1 मिमी EDTA), ट्यूब पलटना मिश्रण है, और x 1000 ग्राम में एक tabletop में 5 मिनट अपकेंद्रित्र अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें, 3.3 दो बार कदम दोहराने और फिर Strep धो बफर की एक बराबर मात्रा में मनका गोली resuspend.
- प्रत्येक अंश (nuceloplasmic के लिए 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge ट्यूबों, ch150, और ch500 भिन्न और एक 15 मिलीलीटर cytoplasmic अंश के लिए चोटीदार ट्यूब में) को धोया Strep Tactin मनका घोल के 200 μl जोड़ें.
- घुमाएँ4 में ट्यूबों 1 ° सी एक rotating पहिया पर.
- ट्यूब 4 में 1 x 1000 छ मिनट डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- प्रत्येक ट्यूब के लिए 1 मिलीग्राम ठंड Strep धो बफर जोड़ें. 15 एमएल ट्यूब (cytoplasmic अंश) से 1.5 एमएल ट्यूब मोती स्थानांतरण. धोने के 4 बजे सभी ट्यूबों 1 मिनट डिग्री सेल्सियस, के बाद के रूप में 3.7 चरण में centrifuging. इस धोने कदम दो बार दोहराएँ.
- पिछले धोने कदम के बाद, एक फ्लैट विंदुक टिप का उपयोग धो बफर के सभी निशान को हटा दें. 100 μl क्षालन बफर (Strep धो बफर 2.5 मिमी desthiobiotin युक्त) और धीरे मिश्रण जोड़ें.
- बर्फ पर 15 मिनट सेते हैं. धीरे मोती कभी कभी मिश्रण ट्यूबों के नीचे दोहन द्वारा.
- अपकेंद्रित्र ट्यूबों 4 में 1 x 1000 जी मिनट ° सी microcentrifuge में. सतह पर तैरनेवाला युक्त eluted Strep - टैग vRNPs को ले लीजिए.
4. प्रतिनिधि परिणाम
fractionation की दक्षता सबसे अच्छा में fractionated lysates के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण antib न्यायsubcellular मार्कर (छवि 2) के लिए विशिष्ट odies. विशेष रूप से, सफल subnuclear fractionation कम या कोई, सेलुलर nucleoplasmic में शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय (पोल द्वितीय), या घुलनशील परमाणु 4 अंश है, और सबसे अधिक 150 मिमी 5 NaCl के साथ निकाला जाना चाहिए दिखाना चाहिए. पोल द्वितीय की गिरावट भी reproducibly असंक्रमित कोशिकाओं, 6 साहित्य के साथ संगत की तुलना में वायरस इन्फ्लूएंजा से संक्रमित कोशिकाओं में मनाया.
VRNPs की शुद्धि सबसे अच्छा चांदी या Coomassie धुंधला से माना जाता है, के रूप में छवि में एक cytoplasmic प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक के लिए दिखाया गया है. 3. हमारे अनुभव में, सबसे Strep-PB2 में शुद्ध होता है एक पूरी तरह का गठन vRNP के भाग के रूप में, यानी थोड़ा घुलनशील पोलीमरेज़ कब्जा कर लिया है. PA/PB1/PB2 चांदी या Coomassie के धुंधला द्वारा मनाया अनुपात: यह उच्च एनपी में परिलक्षित होता है. एक कम अनुपात RNases साथ बफर संदूषण से पता चलता है, के रूप में कई देशव्यापी RNases के (जैसे RNase एक) को फोड़ना वायरल शाही सेना के लिए इस तरह dissoci के रूप में जाना जाता हैएनपी multimers 7 से पोलीमरेज़ खाया. दिलचस्प बात यह है कि, अकेले Benzonase साथ इलाज है, जबकि वायरल शाही सेना को पचाने के लिए पर्याप्त, vRNP प्रोटीन की stochiometric अनुपात पर कोई प्रभाव नहीं है प्रकट होता है. हालांकि हम इस घटना की व्याख्या नहीं कर सकते हैं, हम ने कहा कि अन्य (नहीं दिखाया डेटा) RNases, साथ कि Benzonase सुझाव पाचन के बाद vRNPs के विघटन कुछ संरचनात्मक महत्वपूर्ण क्षेत्रों शाही सेना बरकरार छोड़ सकते हैं. से cytoplasm और nucleoplasm के nuclease पाचन बिना प्रदर्शन vRNPs की शुद्धि के बाद, 8 उच्च आणविक भार पर बेहोश लेकिन असतत बैंड चांदी धुंधला, (रेफरी देखें 3. जो आणविक वजन 8 इन्फ्लूएंजा जीनोम क्षेत्रों की भविष्यवाणी के अनुरूप द्वारा देखा जा सकता है ).
9 घंटे के बाद संक्रमण पर प्रत्येक अंश से शुद्ध vRNPs के रिश्तेदार मात्रा में छवि में दिखाया जाता है. 4. vRNPs का वितरण संक्रमण के पाठ्यक्रम पर बदलता रहता है, जल्दी समय बिंदुओं पर ch150 अंश में मजबूत संचय के साथ, औरदेर समय बिंदुओं पर nucleoplasm और cytoplasm में वृद्धि संचय.
चित्रा 1 subcellular fractionation के प्रवाह चार्ट. रेफरी से अनुकूलित. 3.
चित्रा 2 इन्फ्लूएंजा वायरस से संक्रमित कोशिकाओं से subcellular भिन्न के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण. 10 9 HELA कोशिकाओं 9 घंटे subcellular fractionation पूर्व के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस तनाव डब्लूएसएन से संक्रमित थे. कुल प्रोटीन की समान मात्रा में प्रत्येक लेन में लोड किया गया और दिखाया एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया. शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय (पोल द्वितीय) क्लोन 8WG16, जो सी टर्मिनल डोमेन (hypophosphorylated बैंड सबसे प्रमुख है) के सभी रूपों की पहचान का उपयोग करते हुए पाया गया. रेफरी से अनुकूलित. 3.
चित्रा 3.VRNPs शुद्ध चांदी दाग विश्लेषण. HELA कोशिकाओं rWSN (एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में) या 9 घंटे के लिए rWSN-PB2 Strep, cytoplasmic अंश से Strep शुद्धि के बाद से संक्रमित थे. तारांकन अर्थ बैंड जो RNase पाचन के बाद दिखाई नहीं हैं. रेफरी से अनुकूलित. 3.
चित्रा 4 vRNPs अलग सेलुलर भिन्न से शुद्ध की रजत दाग विश्लेषण है. 10 9 HELA कोशिकाओं के साथ 9 के लिए संक्रमित थे rWSN-PB2 Strep या rWSN घंटे subcellular fractionation और Strep शुद्धि के द्वारा पीछा किया. प्रत्येक अंश से प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक के बराबर मात्रा में भरी हुई थी. रेफरी से अनुकूलित. 3.
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Discussion
हालांकि कई अध्ययनों से हाल ही में व्यक्तिगत प्रोटीन या सेलुलर नेटवर्क इन्फ्लूएंजा वायरस संक्रमण 8 में शामिल की पहचान की है, इन मुलाकातों के बहुमत के कार्यात्मक महत्व अस्पष्ट बनी हुई है. इन्फ्लूएंजा वायरस शाही सेना संश्लेषण और जटिल 9 नाभिक की biophysical और जैव रासायनिक प्रकृति के लिए chromatin आधारित कार्यों के पूर्ण निर्भरता को देखते हुए, नई तकनीक के इन कार्यों को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. subnuclear fractionation हम यहाँ प्रस्तुत vRNPs की आत्मीयता शुद्धि के साथ मिलकर, महत्वपूर्ण वायरल शाही सेना कारखानों जो पहले से दुर्गम थे के लक्षण वर्णन अनुमति देता है.
कई subcellular fractionation प्रोटोकॉल पहले साहित्य में वर्णित किया गया है. हम ने कहा कि इन पारंपरिक तरीकों के सबसे नाभिक से vRNPs की समय से पहले रिसाव के लिए सीसा, एक घटना भी पोल द्वितीय के लिए 10 में वर्णित है. एक कम ग के साथ पूर्व बढ़कर कोशिकाओं की एक छोटी ऊष्मायन का उपयोग करकेएक कमजोर डिटर्जेंट, एनपी-40 के oncentration, कुशल प्लाज्मा झिल्ली सेल महत्वपूर्ण परमाणु रिसाव के बिना हुई. दिलचस्प है, हमारे subcellular fractionation A549 और HEK293T कोशिकाओं के बजाय HeLa दोनों सेल लाइनों में vRNPs मजबूत परमाणु रिसाव के लिए नेतृत्व कोशिकाओं का उपयोग कर प्रदर्शन. लगभग 0.2% करने के लिए एकाग्रता एनपी-40 कम इस मुद्दे के कम है, तथापि, इन सेल लाइनों के कुछ परिवर्तनशीलता के कारण, इष्टतम स्थितियों अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए. एक अन्य संभावित altermative गैर मानव इन्फ्लूएंजा वायरस अतिसंवेदनशील MDCK या वेरो कोशिकाओं के रूप में सेल लाइनों का इस्तेमाल होता है.
हमारे नमक निष्कर्षण प्रोटोकॉल परंपरागत chromatin के निष्कर्षण प्रक्रिया है जो अक्सर कम नमक सांद्रता और / या उच्च सांद्रता EDTA के उपयोग से अलग है. हमारे प्रोटोकॉल के दो विशिष्ट भिन्न, एक पोल II-high/histone-low के अंश और अपने पारस्परिक में chromatin अलग है है. हालांकि, अन्य chromatin के निष्कर्षण के तरीकों भी vRN के संबंध शुद्धीकरण के साथ संगत हो सकता हैपी एस. के बाद से सबसे chromatin के निष्कर्षण प्रक्रियाओं डीएनए प्रोटीन बातचीत पर ध्यान केंद्रित किया है के रूप में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की तुलना में, नई तकनीक के कसकर chromatin बाध्य बहु प्रोटीन 11 परिसरों को निकालने की आवश्यकता है.
सामान्य में, संक्रमण की लंबाई अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए वायरस उपभेदों और सेल लाइनों के बीच बदलाव के कारण. 3 के MOI में तनाव rWSN PB2 - Strep का उपयोग करना, हम समय 3 से 10 घंटे के बाद संक्रमण के लिए अलग - अलग बिंदुओं पर subcellular fractionation प्रदर्शन किया है. हमारे अनुभव में, संक्रमण के कम से कम 3 घंटे उपयोगी पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए भी कुछ शुद्ध vRNPs पैदावार, जबकि संक्रमण मजबूत कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव में 3 घंटे परिणाम की तुलना में अब और बाद में भागों का एक मिश्रण है.
बरकरार है, कसकर chromatin बाध्य वायरल परिसरों को अलग करने की क्षमता कई संभावनाओं को खोलता है. जब तक हम एक पुनः संयोजक वायरस व्यक्त Strep - टैग PB2, अन्य समानता टैग भी, इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पारं का उपयोगitional immunoprecipitation अन्य वायरल प्रोटीन को निशाना. इसके अलावा, जबकि हमारे vRNPs का विश्लेषण उनके प्रोटीन और शाही सेना घटकों के लक्षण वर्णन करने के लिए सीमित था, शुद्ध परिसरों भी इन विट्रो संश्लेषण assays में कार्यात्मक प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, की जुदाई subnuclear fractionation के माध्यम से मोटे कार्यात्मक प्रजातियों में vRNPs भी कई हाल ही में वर्णित वायरल कुशल वायरल शाही सेना 12,13 संश्लेषण के लिए आवश्यक प्रोटीन के बाद translational संशोधनों के करीब अध्ययन अनुमति दे सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों वायरस rWSN PB2 - Strep के लिए से नाडा Naffakh और मेरी ऐनी Rameix Welti (Institut पाश्चर) को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | SERVA Electrophoresis | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | Thermo Fisher Scientific, Inc. | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type "B" pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
References
- Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
- Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
- Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
- Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
- Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
- Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
- Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
- Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
- Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
- Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
- Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
- Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).
