Summary
Vi beskriver två metoder för villkorlig
Abstract
Hepatit C-virus (HCV) är ett hepatotropiskt virus med en värdspektrum begränsad till människor och schimpanser. Även om HCV RNA-replikation har observerats i humana icke-hepatiska och murin cellinjer, var effektiviteten mycket låg och lång sikt, urvalsförfaranden med HCV repliken konstruerar uttrycker dominerande antibiotika valbara markörer 1-5. HCV in vitro-forskning är därför begränsad till humana hepatomcellinjer tillåtande för virus in och färdigställande av virusets livscykel. På grund av HCV smala arter tropism, finns det ingen immunkompetenta litet djur modell tillgänglig som upprätthåller hela HCV-replikationscykeln 6-8. Ineffektiv replikation av HCV i icke-humana celler, t.ex. från mus är troligen beroende på brist på genetisk inkompatibilitet av väsentliga faktorer värdceller beroende och / eller uttryck av restriktionsställen faktorer.
Vi undersökte om HCV utbredning hämmas av dominerande restriktion FActors i antingen humana cellinjer härledda från icke-levervävnader eller i muslever cellinjer. För detta ändamål har vi utvecklat två oberoende villkorliga trans-komplementering metoder som bygger på somatisk fusion. I båda fallen är avslutad virusreplikation cykeln endast möjligt i heterokaryoner. Följaktligen indikerar framgångsrik träns-komplementering, som bestäms genom mätning av de novo-produktion av infektiösa virala avkomman, frånvaro av dominanta begränsningar.
Specifikt subgenomiska HCV replikoner bär en luciferas transgen transfekterades i mycket tillåtande humana hepatomceller (Huh-7.5-celler). Därefter dessa celler samodlades och fuseras till olika humana och murina celler som uttrycker HCV-strukturella proteiner kärna, höljet 1 och 2 (E1, E2) och proteiner tillbehöret p7 och NS2. Förutsatt att cellfusion initierades genom behandling med polyetylen-glykol (PEG), frigörs den kultur smittsam virussjukdom paARTIKLARNA som infekterats naiva celler i en receptor-beroende sätt.
För att bedöma påverkan av dominerande restriktioner hela virusets livscykel, inklusive cellinmatning, RNA översättning, replikering och virus montering tog vi fördel av en human lever cellinje (Huh-7 LUNET N-celler 9) som saknar endogent uttryck av CD81, en viktig post faktor HCV. I frånvaro av ektopiskt uttryckt CD81, dessa celler är i huvudsak okänsliga för HCV-infektion 10. Viktigt vid samtidig odlas och smält med celler som uttrycker människans CD81 men saknar minst en annan avgörande cellinmatning faktor (dvs. SR-BI, CLDN1, OCLN), endast de resulterande heterokaryoner visa den fullständiga uppsättningen av HCV inträde faktorer förutsättning för infektion. Därför att analysera om dominerande begränsning faktorer undertrycka avslutad HCV replikationscykeln, smält vi LUNET N-celler med olika celler från människa och mus ursprung som uppfyller ovan nämnda critERIA. När samodlade celler transfekterades med en mycket fusogena virala höljesproteinet mutant av prototypen skumvirus (PFV 11) och därefter med infektiösa HCV-partiklar (HCVcc), var de novo-produktion av infektiöst virus observerades. Detta tyder på att HCV framgångsrikt slutfört sin replikering cykel i heterokaryoner vilket utesluter uttryck för dominerande begränsning faktorer i dessa cellinjer. Dessa nya villkorliga trans-komplementering metoder vara användbara för att visa en stor panel av cellinjer och primära celler för uttryck av HCV-specifika dominerande begränsning faktorer.
Protocol
Cellfusion med PEG
1. Cellodling
- Kultur Huh-7,5, HeLa och Hep56.1D naiva eller förpackning cellinjer 12 på 15 kultur cm cell skålar i DMEM komplett (DMEM cplt)-medium, kompletterat DMEM med 2 mM L-glutamin, 1 x icke-essentiella aminosyror, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin och 10% fetalt kalvserum. Tillämpa lämplig selektion av stabila cellinjer som anges i tabell 1.
2. Transfektion av HCV RNA
- Tvätta Huh-7.5-celler (en konfluent 15 cm skål) två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), Trypsinisera, och återsuspendera i en koncentration av 1.5x10 7 celler / ml i Cytomix (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 10 mM K 2 HPO 4 [pH 7,6], 25 mM HEPES, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, justerades till pH 7,6 med KOH och steriliserades genom filtrering) innehållande 2 mM ATP och 5 mM glutation.
- Transfektera via electroporatjon 400 | il av cellsuspensionen (6x10 6 celler) med 10 | ig HCV-RNA (pFKi389Luc-EI/NS3-3 '_JFH1_dg 13) med användning av kyvetter med en gapbredd av 0,4 cm och en Gene Pulser XCell systemet (Biorad) inställd på 975 xF och 270 V som beskrivits tidigare 14.
- Omedelbart överföra transfekterade Huh-7.5-celler till 10 ml av DMEM-medium cplt och frö hela suspensionen till en enda odlingsskål av 10 cm i diameter. Odlingsceller under 24 h vid 37 ° C och 5% CO2.
3. Induktion av Fusion av PEG
- Harvest celler beskrivs i 2,1, resuspendera i DMEM cplt medium och späd till 5x10 5 celler per ml.
- Alstra enkel-cellsuspensioner av Huh-7,5, HeLa och Hep56.1D celler förpackningar och utspädda till 5x10 5 celler / ml, 2x10 5 celler / ml, och 2x10 5 celler / ml, respektive. Notera att packningsceller ektopiskt uttrycker HCV-proteiner centrala, E1, E2, p7 och NS2 efter transduktion med två iberoende lentivirala vektorer transducerande en C-E1 och E2-p7-NS2-expressionskassetten, respektive 13, 15.
- Förbered 6-brunnars odlingsplattor med 2-3 sterila täckglas per brunn för vidare analys av fusion effektivitet.
- Kombinera 1 ml av transfekterade Huh-7.5-celler härbärgerande den subgenoma replikonet med 1 ml av packade celler, kärnor till en brunn i en 6-brunnsplatta och inkubera under 24 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Vid denna tidpunkt, bör celltätheten vara mellan 60-80% konfluens innan induktionen av cellfusion för att tillåta cellerna att vara i omedelbar närhet till cellmembran att fusera.
- Aspirera mediet från samodlade celler och tvätta en gång med 1 ml PBS, sedan försiktigt tillsätt 500 | il förvärmd 40% PEG-1500 eller PBS som kontroll och inkubera under 5 min vid 37 ° C för att inducera heterokaryonbildning.
- Aspirera PEG och noggrant tvätta 3-5 gånger i 1 minut (min) per tvätt med 2 ml PBS för att avlägsna överskott PEG och slutligen tillsätt 2ml DMEM cplt medium till varje brunn och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
- Fyrtioåtta timmar efter fusion, samla varje supematant och filtrera genom en 0,45 fim filter.
- Mäta produktionen av infektiösa partiklar i smält heterokaryoner genom inokulering av naiva Huh-7.5-celler (8x10 4 celler / brunn ympades i en 12-brunnsplatta, 24 h före ympning) med 500 | il av cellfritt odlingsvätska och efterföljande bestämning av luciferas Verksamhet 14.
4. Immunofluorescens för att bestämma Fusion effektivitet
- Efter uppsamling cellodlingssupernatanter (sektion 3.8), tvätta brunnarna innehållande glas täckglas gång med 1 ml PBS under 1 min. Alla följande steg skall utföras vid rumstemperatur (RT) och tvättning som skall göras med 1 ml PBS under 1 min per tvätt.
- Fixera cellerna med 600 | il av 3% paraformaldehyd (PFA) i PBS under 15 min och sedan tvätta 3x med PBS. Försiktigt över täckglasi en 24-brunnsplatta med användning av pincett.
- Permeabilisera cellerna med 500 | il 0,5% Triton X-100 i PBS under 5 min och därefter tvätta 3x med PBS.
- Framställ primär antikropp i PBS kompletterad med 5% getserum. Använda anti-NS5A-antikropp (9E10) vid en koncentration av 0,5 | ig / ml och humant monoklonalt anti-E2-antikropp (CBH-23) vid en koncentration av 6,4 ng / ml. Tillämpas 250 | il till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur under 45 minuter.
- Tvätta 3x med PBS och detektera bundna primära antikroppar med 250 | il sekundär get-anti-mus eller get anti-humana IgG-antikroppar konjugerade till Alexa Fluor-546 eller Alexa Fluor-488, vid en koncentration av 2 | ig / ml i PBS supplementerat med 5% getserum. Inkubera under 30 min vid RT i mörker.
- Därefter tvättas 1 gång med PBS och därefter färga cellkärnor med 250 | il DAPI (4 ', 6'-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid) utspädd 1:3000 i PBS, inkubera under 1 minut vid RT i mörker.
- Tvätta 4x med PBS och 1x med H 2
Fusion genom transient transfektion av prototyp skummande virus (PFV) glykoprotein
5. Framställning av viralt inokulum
- Producera en hög titer lager virus genom transfektion av in vitro transkriberad HCV-RNA i Huh-7.5-celler och skörd av supernatanten cellkultur efter 48 h och 72 h såsom beskrivits tidigare 14. Bestämma viral titer genom begränsande utspädning analys (TCID50) 13.
6. Cellodling, cellfusion genom transfektion av en fusogen PFV Glykoprotein
- Kultur LUNET N, HeLa och Hep56.1D hCD81 celler enligt anvisningarna i tabell 1 i DMEM cplt medium som innehåller lämpliga val.
- Ta bort celler, som beskrivs i 2,1, förbereda enkelcellsuspensioner i DMEM cplt medium, och co-odla LUNET N-celler med HeLa eller Hep56.1D hCD81-cellinjer vid lämpliga förhållanden (t.ex. 1:2 för Hep56.1D hCD81 eller 1:1 för HeLa-celler) som ger en total celldensitet av 1.5x10 5 celler per 12-brunn och inkubera under 24 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Nästa dag, transient transfektera celler med det mycket fusogena PFV höljesprotein (pczHFVenvEM066 16) genom användning av Lipofectamine 2000 enligt tillverkarens instruktioner.
7. Infektionsanalysen
- Ympa heterokaryoner 30 h efter transfektion med 350 | il av virusstam (MOI av ~ 2,3) under 12 timmar över natten, tvättas en gång med PBS och tillsätt 1 ml DMEM cplt medium per brunn. Inkubera under 48 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Skörd supernatant av heterokaryon kultur, filtrera genom ett 0,45 pm filter och inokulera Huh-7.5-celler, sådda i 96-brunnars plattor (1x10 4 celler / brunn) dagen innan, under en begränsande spädningsanalys
- Efter 72 h fläck infekterade Huh-7.5-celler med en HCV-specifik antikropp (NS5A; 9E10) för att kvantifiera framställningen av infektiös avkomma partiklar.
8. Visualisering av cell-fusion
- För att visualisera fusion evenemang, förbereda 5 till 10 iM lösningar av CellTracker färgämnen i DMEM medium utan tillsatser och slutföra stegen nedan 6 timmar före sam-kultur (beskrivs i avsnitt 6.2 och 6.3).
- Tvätta vidhäftande celler en gång med 5 ml PBS och därefter inkubera cellerna med 4 ml av färgning lösning per 10 cm skål i 45 min vid 37 ° C och 5% CO2 (fläck LUNET N-celler med CellTracker orange CMTMR och HeLa eller Hep56.1D hCD81 celler med CellTracker Grön CMFDA, separat).
- Tvätta cellerna en gång med 5 ml PBS under 1 min och tillsätt DMEM cplt medium inkubera under 6 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Framställ ympning och transfektion av färgade celler såsom beskrivits ovan i avsnitten 6.2 och Emellertid lägger en täckremsa förcellodlingsskål före sådd.
- 30 h efter transfektion, tvättas cellerna försiktigt med 1 ml PBS under 1 min och därefter fixera cellerna med 250 | il 3% PFA i 15 min vid RT. Tvätta cellerna en gång med 1 ml PBS i 1 min, färga med DAPI för 1 min som beskrivs i avsnitt 4,6, tvätta en gång med 1 ml PBS i 1 min, upprepa tvätta med H 2 O och montera täckglas på glasskivor (se avsnitt 4,7 ). Analysera celler med ett fluorescensmikroskop.
| Arter | Cellinje | Ursprung | Odlingsmedium och val av |
| Human | Huh-7.5 | Subklon av Huh-7 hepatomcellinje 17 | DMEM cplt |
| Huh-7,5 [CE1] [E2p7NS2] | Stabilt uttrycker virala proteiner kärna, transducerade E1, E2, p7 och NS2, genom lentivirala t-genenVERFÖRING av två oberoende genkassetterna | DMEM + cplt Blasticidin 5 | ig / ml | |
| HuH-7 LUNET N | Subklon av Huh-7 hepatomcellinje 9 | DMEM cplt | |
| HeLa | Cervikal adenokarcinom-cellinje (ATCC nummer: CCL-2) | DMEM cplt | |
| HeLa [CE1] [E2p7NS2] | Stabilt uttrycker virala proteiner kärna, transducerade E1, E2, p7 och NS2, genom lentivirala genöverföring av två oberoende genkassetterna | DMEM + cplt G418 750 | ig / ml; Blasticidin 5 | ig / ml | |
| Mus | Hep56.1D | Primär hepatocellulär carcinom (typ gåva J. Encke) Vuxna C57BL/6J-möss | DMEM cplt |
| Hep56.1D [CE1] [E2p7NS2] | Stabilt expressning virala proteiner kärna, transducerade E1, E2, p7 och NS2, genom lentivirala genöverföring av två oberoende genkassetterna | DMEM + cplt G418 750 | ig / ml; Blasticidin 5 | ig / ml | |
| Hep56.1D hCD81 | Stabilt uttrycker humana CD81 transduceras genom lentivirala genöverföring | DMEM + cplt Blasticidin 5 | ig / ml |
. Tabell 1 Specifikationer om ursprung och kultur tillstånd används cellinjer Cplt: komplett, G418: Geneticin, h: människa.
9. Representativa resultat
I denna studie har vi använt två olika metoder för somatisk cellfusion som tillåter oss att specifikt undersöka effekten av begränsning faktorer avslutad HCV-replikation cykeln heterokaryoner. Att notera, försäkrar den villkorade utformningen av trans-komplettering vid fusion av de två olika celltyper somEndast i verkliga heterokaryoner mellan mänskliga leverceller och icke-tillåtande cellinjer och virus montering (metod 1) eller virus inresa och hela HCV-replikationscykeln (metod 2) uppnås.
I det första tillvägagångssättet Huh-7.5-celler, höggradigt permissiva för HCV, transfekterades transient med en subgenom replikon som uttrycker en transgen luciferas och HCV icke-strukturella proteiner stödjande subgenomiska HCV RNA-replikation (Va-7.5 replikon-celler). Dessa celler samodlades och fuseras till cellinjer som uttrycker HCV-strukturella proteiner kärna, E1, E2, liksom proteiner tillbehör p7 och NS2. Figure1A visar en översikt av det experimentella förfarandet. Viktigt är att efter PEG sammansmältning bör alla proteiner som krävs för partikelsammansättning vara närvarande i den formade heterokaryon som kan bekräftas genom immunofluorescens mot individuella virala proteiner. Figur 1B visar ett exempel på fusion händelse där signaler för både NS5A uttryckta i Huh-7,5 repliken celler och E2uttryckt i Huh-7,5 [CE1] [E2p7NS2] förpackningsmaterial celler detekterades på samma cytoplasman på PEG-inducerad heterokaryonbildning. När samodlade celler istället behandlades med PBS, gjordes ingen sammansmältning inducerades sålunda endast enkel-positiva celler och ingen co-lokalisering av signaler observerades. Dessutom, för att kontrollera transgenexpression, utförde vi ELISA som är specifika för kärnan och E2 (tidigare rapporteras i detalj 15). Förutom kontrollgruppen packande cellinjen Huh 7,5 [CE1] [E2p7NS2] genererade vi HeLa-och Hep56.1D celler förpackning som representanter för humant icke-lever-och musceller lever, respektive. HCV-RNA-replikation effektivitet i dessa senare celler är låg och HCV montering och frisättning har inte visats. Figur 1C illustrerar resultaten av den fusions-analysen. Supematanter samlades in från samodling vid 48 h efter sammansmältning induktion och användes för att ympa naiva Huh-7.5-celler för efterföljande luciferasanalyser. Anmärkningsvärt var när Huh-7,5 repliken celler förenas med antingennaiva cellinjer eller behandlade med PBS som kontroll, ingen smittsamhet detekterades i odlingsvätskor. När emellertid cellfusion mellan Huh-7,5 replikon och förpackning cellinjer inducerades genom PEG, räddades träns-komplementering mellan replikon och konstitutivt uttryckta strukturella proteiner virusproduktion i de resulterande heterokaryoner och infektiösa virala partiklar frisattes in i odlingsvätskor. Vi drog därför slutsatsen att viruset behöver produceras cellfusion och uttryck av virala proteiner i packningscellinjer. Påfallande, inte bara de heterokaryoner av Huh-7.5 humana hepatomceller, men även heterokaryoner med humant icke-lever (HeLa [CE1] [E2p7NS2]) och muslever (Hep56.1D [CE1] [E2p7NS2]) celler tilläts virusfrisättning, vilket indikerar att montering och släpp inte dominant hämmas av eventuella begränsning faktorer i dessa celltyper. Expression av strukturella proteiner i packningscellinjer och autentiska inträde målceller visas i Frentzen
En alternativ metod för cellfusion användes för att analysera eventuella begränsningar som påverkar cellinmatning, RNA översättning och RNA stadier replikering av replikering cykeln och att utesluta att en hög viral börda i transfekterade Huh 7,5 repliken celler skulle utesluta upptäckt av begränsning faktorer av mättnad. För detta ändamål har vi utvecklat en oberoende analys baserad på ympning av heterokaryoner med HCVcc och upptäcka de novo virusproduktion i dessa celler. Såsom beskrivs översiktligt i fig 2A, somatiska cellfusion induceras genom expression av en fusogen glykoprotein efter samodling av cellerna. Denna metod valdes eftersom känsligheten ökades sannolikt på grund av ökad sammansmältning effektivitet. Heterokaryoner visualiserades genom färgning separata cellinjer med CellTracker färgämnen före samodling. En heterokaryon med homogent fördelade färgämnen i cytoplasman visar fusion av två celltyper som indikerard i figur 2B. Endast i heterokaryoner av LUNET N celler med HeLa celler eller Hep56.1D hCD81 celler samtliga HCV inträde faktorer uttryckt på följande sätt selektivt gör heterokaryoner mottagliga för HCV cell inträde. Utmaning med HCVcc resulterade i fullständig replikation av HCV i heterokaryoner vilket framgår av de novo-produktion av infektiös virusavkomma ungefär 10-faldigt över bakgrunden för analysen (figur 2C). Som en kontroll odlades LUNET N-celler fuserades med LUNET N-celler. Viktigt endast mycket låga halter av smittsamma HCV nära detektionsgränsen observerades. Liknande resultat erhölls när LUNET N-celler fuserades med naiva Hep56.1D celler. I båda fallen var mänskliga CD81 frånvarande så att HCV inte kunde produktivt infektera heterokaryoner. Denna mycket låg infektivitet detekteras i dessa två senare fallen kan troligen tillskrivas låg nivå av infektion av LUNET N-celler och / eller låga nivåer av kvarvarande infektiöst virus insignal från inokulum. I kontrast HeLa celler och Hep56.1D hCD81 celler uttrycker människans CD81, och kompletterar därmed den bristande faktorn cellen post i de heterokaryoner och tillåter HCV cell inträde. Den 10-faldig ökad nivå av smittsam HCV detekteras i medium heterokaryoner där dessa två cellinjer därför sannolikt speglar de novo produktion av infektiösa partiklar i heterokaryoner. Därför drog vi slutsatsen att slutförandet av HCV-replikation cykeln inte är begränsad utom ett uttryck för dominerande HCV begränsning faktorer i dessa cellinjer.
Figur 1. Trans-komplementering av HCV montering och frisättning i heterokaryoner. (A) Schematisk skiss av det experimentella förfarande som för PEG-medierad cellfusion. Den JFH1 luciferas-reporter-replikon Luc-NS3-5B transfekterades in i naiva Huh-7.5-celler genom elektroporation. Nästa dag, frigjordes celler och samodlade med naiva celler eller förpackningar celler som konstitutivt uttrycker HCV-kärna, E1, E2, p7 och NS2. 24 h efter samodling tillsattes heterokaryonbildning inducerades genom behandling med 40% PEG med användning av PBS som negativ kontroll. Efter 48 timmar tillsattes cellfri supernatant skördades för att ympa naiva Huh-7.5-celler. Infektivitet bestämdes genom luciferasaktivitet. (B) För detektion av heterokaryoner, cellerna immunfärgades med användning av monoklonala antikroppar mot E2 och NS5A. Samtidig expression av båda proteinerna i celler är ett tecken på cellfusion. (C) Luciferas mätningar utfördes för att kvantifiera viral smitta produceras från heterokaryoner. Medelvärden av tre oberoende experiment och standardavvikelserna för de medel ges. Den horisontella stapel representerar bakgrunden RLU bestämdes i oinfekterade Huh-7,5 celler. Klicka här för att visa en större bild .
9/4029fig2.jpg "/>
Figur 2. Fullbordandet av HCV-replikation efter inokulering av heterokaryoner. (A) Schematisk översikt av det experimentella förfarandet. HuH-7 LUNET N-celler som saknar CD81 samodlades med de indikerade cellinjema som saknar eller som uttrycker humant CD81. Viktigt är att dessa senare celler saknar åtminstone en HCV-post faktor och kan därför inte produktivt infekterade. Nästa dag tillsattes sammansmältning initierades genom transfektion av en fusogen viralt höljesprotein från PFV. Trettio timmar senare utmanades cellerna med infektiösa HCV-partiklar. För att mäta cell posten, RNA-replikation och virusproduktion stöds av dessa heterokaryoner, släpptes smitta i cellfria odlingsvätskor bestäms 48 timmar efter ympning. För detta ändamål har tidigare obehandlade Huh-7.5-celler användes som målceller i en begränsande spädningsanalys (TCID50). (B) För detektion av heterokaryoner, färgades cellerna med CellTracker Green eller CellTracker orange 6 h före sam-Kulturväxteration och transfektion. Trettio timmar senare fixerades cellerna och färgades med DAPI. (C) LUNET N-celler fuserades med HeLa-celler, obehandlade Hep56.1D eller Hep56.1D celler som uttrycker humana CD81. Dessa kulturer ympades med HCVcc (MOI av 2,3). Kultur vätskor samlades 48 timmar senare och de novo partiklar som avges från heterokaryoner bestämdes genom TCID 50 med naiva Huh-7,5 målceller. Medelvärden av tre oberoende experiment ges. Den horisontella stapel representerar detektionsgränsen för analysen. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar två metoder för att inducera heterokaryonbildning i odlade celler för analys av dominanta negativa restriktioner som hindrar HCV-replikation. Med användning av dessa förfaranden har vi inte närvaron av en dominerande konstitutivt uttryckt eller virus-inducerad faktor i olika humana icke-lever och i murina lever cellinjer. Den första analysen analyseras främst om begränsning faktorer hindrar HCV montering och frisättning av infektiös avkomma. Eftersom det i detta fall förpackningen cellerna smälts till HCV-repliken celler möjliga begränsningen faktorer uttryckta i förpackningar cellerna får bara tillgång till cytoplasman av celler som redan har en hög belastning av viralt RNA. Därför har översättning av viralt RNA genomförts och många produktiva HCV-replikation komplex har upprättats, vilket minskar chanserna att upptäcka eventuella begränsningar av HCV översättning och RNA-replikation. I själva verket kan den höga belastning av replikon-RNA i dessa celler utesluter deras identifiering ochkan också hindra detektering av restriktionsställen faktorer för HCV montering och / eller frisättning på grund av mättnad av virala faktorer. För att kringgå denna begränsning, utvecklade vi en andra trans-komplettering analys där HCV cellinmatning bara uppnås i heterokaryoner. Följaktligen i detta mer naturliga miljö är virusreplikation och efterföljande produktion av infektiöst avkomma inletts och fortsätter i heterokaryoner därmed exponera virusreplikation maskinen direkt till alla möjliga begränsningen mekanismer som uttrycks i de sammansmälta cellerna. Eftersom vi observerade de novo produktion av infektiösa partiklar i detta system, drar vi slutsatsen att ingen av de testade cellinjer uttrycker dominerande begränsning faktorer av HCV cellinmatning, RNA translation, RNA-replikation eller virus montering och släpp. Noterbart virala titrar som uppnåtts i båda metoderna beror på en uppsättning faktorer. Först transgen uttryck i de förpackningar cellerna kan variera mellan de olika cellinjer och kan påverka trans-Komplementering. Såsom visas i det kompletterande materialet i Frentzen et al. Kan referenskriterierna för transgen expression erhållas genom specifik kärna och E2 ELISA och bestämning av fusion effektivitet. Dessutom skulle cellens storlek, densitet, tillväxthastighet och benägenhet att smälta påverka heterokaryonbildning. Följaktligen bör försiktighet iakttas när man jämför effektiviteten i virusproduktion mellan enskilda heterokaryoner.
Det skulle vara mycket intressant att analysera primära musceller är emellertid en begränsning av den experimentella uppställningen att dessa celler skulle vara svårt att transducera och förmågan att fusera med andra celler är knappast förutsägbar. Emellertid har denna som skall testas specifikt för varje typ av primära celler. Alternativ för att identifiera artspecifika restriktionsställen faktorer kan vara införandet av en cDNA-bank av interferon-induced musleverceller. Dessa aspekter har redan diskuterats ingående i PLoS patogener papperetgenom Frentzen et al 15.
För att validera den metod för att finna möjlighet till begränsning faktorer vi behandlade Hep56.1D förpackningar celler med mus IFN-α före sam-odling och fusion med Huh-7,5 repliken celler. Vi observerade en minskning av smittsamhet vilket tyder på att IFN-uppreglerade gener skulle kunna begränsa montering i musceller och visa att potentiella antivirala faktorer kunde detekteras med denna analys.
De system som beskrivs i denna studie kommer att vara användbara för att screena en stor panel av humana och icke-humana cellinjer eller primära celler för begränsning av HCV-replikationscykeln. I framtiden kan sådana studier bidra till identifiering och karakterisering av nya antivirala mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TP fick konsulttjänster avgifter från Biotest.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Takaji Wakita och Jens Bukh för JFH1 och J6CF isolat, respektive. Dessutom har vi tackar Charles Rice för Huh-7,5 celler och 9E10 antikroppen, Steven Foung för E2-specifik antikropp CBH-23, och alla medlemmar i avdelningen för experimentell virologi, Twincore för hjälpsamma förslag och diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 | |
| L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 | |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 | |
| α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | ||
| ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 | |
| Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G | |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 | |
| G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 | |
| Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 | |
| Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 | |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 | |
| Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL | |
| α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | ||
| DAPI (4',6'- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Alexa-Fluor 546 - goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 | |
| Alexa-Fluor 488 - goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 | |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 | |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML | |
| All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | ||
| Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |
References
- Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells. J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).
- Kato, T. Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon. J. Virol. 79, 592-596 (2005).
- Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line. J. Virol. 78, 491-501 (2004).
- Date, T. Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells. J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).
- Chang, K. S. Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities. J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).
- Zhong, J. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).
- Lindenbach, B. D. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309, 623-626 (2005).
- Wakita, T. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat. Med. 11, 791-796 (2005).
- Witteveldt, J. CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells. J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).
- Bitzegeio, J. Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors. PLoS Pathog. 6, e1000978 (2010).
- Lindemann, D., Goepfert, P. A. The foamy virus envelope glycoproteins. Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).
- Brohm, C. Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation. J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).
- Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles. J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).
- Koutsoudakis, G. Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses. J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).
- Frentzen, A. Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines. PLoS Pathog. 7, e1002029 (2011).
- Lindemann, D. A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity. J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).
- Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).
