Summary
Vi beskriver to metoder til betinget
Abstract
Hepatitis C virus (HCV) er en hepatotropisk virus med en værtsområdegenet begrænset til mennesker og chimpanser. Selv HCV-RNA-replikation er blevet observeret i humane ikke-hepatiske og murin cellelinier effektivitet var meget lav, og krævede lange udvælgelsesprocedurer hjælp HCV replicon konstruktioner som udtrykker dominante antibiotikum-selekterbare markører 1-5. HCV in vitro-forskning er derfor begrænset til humane hepatomaceller cellelinier permissive for virus ind og afslutning af den virale livscyklus. Grund HCV'er smalle art tropisme, er der ingen immunokompetente lille dyremodel, som holder hele HCV replikationscyklus 6-8. Ineffektiv replikation af HCV i ikke-humane celler fx af museoprindelse sandsynligvis på grund af manglende genetisk uforenelighed væsentlige vært afhængighed faktorer og / eller ekspression af restriktionssteder faktorer.
Vi undersøgte, om HCV formering er undertrykt af dominerende begrænsning FActors i enten humane cellelinjer afledt af ikke-hepatiske væv eller i muselever cellelinier. Til dette formål har vi udviklet to uafhængige betingede trans-komplementering metoder der er afhængige af somatisk celle fusion. I begge tilfælde er færdiggørelse af den virale replikationscyklus kun mulig i heterokaryoner. Følgelig vellykket trans-komplementation, som bestemmes ved at måle de novo produktion af infektiøst virusafkom, indikerer fravær af dominerende begrænsning.
Specifikt blev subgenomiske HCV replikoner der bærer et luciferase transgen transficeret ind meget permissive humane hepatomaceller (Huh-7.5-celler). Efterfølgende blev disse celler co-dyrkes og fusioneret til forskellige humane og murine celler, som udtrykker HCV-strukturelle proteiner kerne, envelope 1 og 2 (E1, E2) og accessoriske proteiner P7 og NS2. Forudsat, at cellefusion blev initieret ved behandling med polyethylenglycol (PEG), kulturen frigives infektiøs virussygdom partikel som inficerede naive celler i en receptor-afhængig måde.
At vurdere indflydelsen af dominerende begrænsning hele virale livscyklus, herunder celleindtrængen, RNA translation, replikation og viruskonstruktion, vi benyttede en human lever-cellelinie (Huh-7 Lunet N-celler 9), der mangler endogen ekspression af CD81, en væsentlig indgang faktor HCV. I fravær af ektopisk udtrykt CD81, er disse celler i det væsentlige resistente over for HCV-infektion 10. Vigtigt, når de co-dyrkes og fusioneres med celler, der udtrykker human CD81, men manglen på mindst et andet afgørende celleindtastning faktor (dvs. SR-BI, CLDN1, OCLN), kun de resulterende heterokaryoner vist det komplette sæt af HCV indrejse faktorer nødvendige for infektion. Derfor, for at analysere, om dominerende begrænsning faktorer undertrykke afslutningen af HCV-replikation cyklus vi fusioneret Lunet N-celler med forskellige celler fra human-og muse oprindelse, som opfylder ovennævnte critEria. Når co-dyrkede celler blev transficeret med en meget fusogent viralt kappeprotein mutant af prototypen foamy-virus (pFV 11) og derefter udfordret med infektiøse HCV-partikler (HCVcc), blev de novo produktion af infektiøst virus observeret. Dette indikerer, at HCV fuldført sin replikationscyklus i heterokaryoner således udelukke ekspression af dominerende restriktionssteder faktorer i disse cellelinier. Disse hidtil ukendte betingede trans-komplementering fremgangsmåder vil være anvendelige til screening af et stort panel af cellelinier og primære celler til ekspression af HCV-specifikke dominerende restriktionssteder faktorer.
Protocol
Cellefusion af PEG
1. Cellekultur
- Kultur Huh-7.5, HeLa og Hep56.1D naive eller pakkecellelinier 12 på 15 cm celle dyrkningsskåle i DMEM komplet (DMEM cplt) medium, DMEM suppleret med 2 mM L-glutamin, 1x ikke-essentielle aminosyrer, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 10% føtalt kalveserum. Anvende passende udvælgelse af stabile cellelinier som angivet i tabel 1.
2. Transfektion af HCV-RNA
- Vask Huh-7.5-celler (en konfluent 15 cm skål) to gange med phosphatbufret saltvand (PBS), Trypsinisér og resuspenderes ved en koncentration på 1.5x10 7 celler / ml i Cytomix (120 mM KCI, 0,15 mM CaCl2, 10 mM K 2 HPO4 [pH 7,6], 25 mM HEPES, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, indstillet til pH 7,6 med KOH og steriliseres ved filtrering) indeholdende 2 mM ATP og 5 mM glutathion.
- Transficering via electroporation 400 pi af cellesuspensionen (6x10 6 celler) med 10 ug HCV-RNA (pFKi389Luc-EI/NS3-3 '_JFH1_dg 13) under anvendelse af kuvetter med en spaltebredde på 0,4 cm og en Gene Pulser Xcell system (Biorad) sat til 975 pF og 270 V som beskrevet tidligere 14.
- Umiddelbart overføres transficeret Huh-7.5-celler til 10 ml DMEM cplt medium og frø hele suspensionen i en enkelt dyrkningsskål 10 cm i diameter. Dyrkning af celler i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
3. Induktion af Fusion af PEG
- Høst celler som beskrevet i 2.1, resuspenderes i DMEM cplt medium og fortyndes til 5x10 5 celler / ml.
- Generere en enkelt-cellesuspensioner af Huh-7.5, HeLa og Hep56.1D pakkeceller og fortyndes til 5x10 5 celler / ml, 2x10 5 celler / ml, og 2x10 5 celler / ml. Bemærk, at pakkeceller ektopisk udtrykker HCV-proteiner kerne, E1, E2, P7 og NS2 efter transduktion med to iafhængige lentivirusvektorer transducerende en C-E1 og E2-p7-NS2 ekspressionskassetten, henholdsvis 13, 15.
- Fremstilling af 6-brønds dyrkningsplader med 2-3 sterile dækglas per brønd til yderligere analyse af fusion effektivitet.
- Kombiner 1 ml transficerede Huh-7.5-celler indeholdende den subgenomiske replikon med 1 ml af pakkeceller, frø i en brønd af en 6-brønds plade og inkuber i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- På dette tidspunkt bør celledensitet ligge mellem 60-80% konfluens før induktion af cellefusion for at give cellerne at være i tæt nærhed til cellemembraner vil smelte.
- Aspirere medium fra co-dyrkede celler og vaskes en gang med 1 ml PBS, og derefter tilsættes forsigtigt 500 pi forvarmet 40% PEG-1500 eller PBS som kontrol og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C for at inducere heterokaryon dannelse.
- Aspirer PEG og omhyggeligt vaskes 3-5 gange i 1 minut (min) per vask med 2 ml PBS for at fjerne overskydende PEG og endelig tilsættes 2ml DMEM cplt medium til hver brønd og inkuber ved 37 ° C og 5% CO2.
- Otteogfyrre timer efter fusion, indsamle hver supernatant og filtreres gennem et 0,45 um filter.
- Foranstaltning produktion af infektiøse partikler i smeltet heterokaryoner ved inokulering af naive Huh-7.5-celler (8x10 4 celler / brønd var podet i en 12-brøndsplade, 24 timer inden inokulering) med 500 ul af cellefri dyrkningsvæske og efterfølgende bestemmelse af luciferase aktivitet 14.
4. Immunofluorescens at bestemme Fusion Effektivitet
- Efter opsamling cellekultursupernatanter (afsnit 3.8), vaskes brøndene indeholdende dækglas en gang med 1 ml PBS i 1 min. Alle følgende trin bør udføres ved stuetemperatur (RT) og vask bør ske med 1 ml PBS i 1 minut pr vask.
- Løse celler med 600 pi 3% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 15 minutter og derefter vaskes 3x med PBS. Omhyggeligt overføre dækglasi en 24-brønds plade med pincet.
- Permeabilisere cellerne med 500 pi 0,5% Triton X-100 i PBS i 5 minutter og vaskes derefter 3 gange med PBS.
- Fremstille primær antistofopløsning i PBS suppleret med 5% gedeserum. Anvende anti-NS5A-antistof (9E10) ved en koncentration på 0,5 ug / ml og humant monoklonalt anti-E2-antistof (CBH-23) ved en koncentration på 6,4 ng / ml. Anvendelse 250 uL til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i 45 min.
- Vaskes 3x med PBS og detektere bundne primære antistoffer med 250 ul sekundært gede-anti-mus eller ged-anti-humane IgG-antistoffer konjugeret til Alexa-Fluor 546 eller Alexa-Fluor 488, ved en koncentration på 2 ug / ml i PBS suppleret med 5% gedeserum. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Derefter vaskes 1 gang med PBS og efterfølgende farvning cellekerner med 250 pi DAPI (4 ', 6'-diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid) fortyndet 1:3000 i PBS, inkuberes i 1 minut ved stuetemperatur i mørke.
- Vask 4x med PBS og 1x med H2
Fusion af forbigående transfektion af prototype foamy-virus (pFV) glycoprotein
5. Fremstillinq af virale inokulum
- Frembringelse af en høj titer virusstamopløsningen ved transfektion in vitro transkriberede HCV-RNA i HuH-7.5-celler og høst cellekultursupernatant efter 48 timer og 72 timer som beskrevet tidligere 14. Bestemme viral titer ved begrænsende fortynding assay (TCID50) 13.
6. Cell Culture, Cell Fusion ved transfektion af et fusogent pFV Glycoprotein
- Kultur Lunet N, HeLa og Hep56.1D hCD81-celler i henhold til instruktionerne i tabel 1 i DMEM cplt medium indeholdende passende valg.
- Frigøre celler som beskrevet i 2.1, fremstilles enkelte cellesuspensioner i DMEM cplt medium, og co-dyrkning Lunet N-celler med HeLa-eller Hep56.1D hCD81 cellelinier ved passende forhold (f.eks 1:02 til Hep56.1D hCD81 eller 1:1 til HeLa-celler), hvilket gav en total celletæthed på 1.5x10 5 celler pr 12-brønd og inkuberes i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Den næste dag, transient transfektion af celler med højt fusogene pFV kappeprotein (pczHFVenvEM066 16) ved hjælp af Lipofectamine 2000 i overensstemmelse med producentens anvisninger.
7. Infektion Assay
- Inokulere heterokaryoner 30 timer efter transfektion med 350 pi af virusstamopløsningen (MOI på ~ 2,3) i 12 timer natten over, vaskes en gang med PBS, og der tilsættes 1 ml DMEM cplt medium per brønd. Inkuber i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Høst supernatant af heterokaryon kultur, filtreres gennem et 0,45 um filter og podes Huh-7.5-celler, podet i 96-brønds plader (1x10 4 celler / brønd) dagen før, i en begrænsende fortynding assay
- Efter 72 h, farves inficerede Huh-7.5-celler med en HCV-specifikt antistof (NS5A, 9E10) for at kvantificere produktion af infektiøst afkom partikler.
8. Visualisering af Cell Fusion
- For at visualisere fusion begivenheder, forberede 5 til 10 uM løsninger af CellTracker farvestoffer i DMEM medium uden tilsætningsstoffer og udfylde nedenstående trin 6 timer før co-kultur (beskrevet i afsnit 6.2 og 6.3).
- Vask adhærente celler en gang med 5 ml PBS og derefter inkuberes cellerne med 4 ml farveopløsning pr 10 cm skål i 45 minutter ved 37 ° C og 5% CO 2 (farvning Lunet N-celler med CellTracker Orange CMTMR og HeLa eller Hep56.1D hCD81 celler med CellTracker Green CMFDA, separat).
- Vask cellerne en gang med 5 ml PBS i 1 minut, og der tilsættes DMEM cplt medium inkuberes i 6 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Forberede podning og transfektion af farvede celler som beskrevet ovenfor i afsnit 6.2 og Imidlertid tilføjer et dækglas tilcelledyrkningsskål før podning.
- 30 timer efter transfektion, vaskes cellerne grundigt med 1 ml PBS i 1 minut og derefter fastgøre celler med 250 pi 3% PFA i 15 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne gang med 1 ml PBS i 1 minut, bejdse med DAPI i 1 minut som beskrevet i afsnit 4,6, skylles en gang med 1 ml PBS i 1 min, gentag vaskes med H 2 O og mount dækglas på objektglas (se afsnit 4,7 ). Analysere celler med et fluorescensmikroskop.
| Arter | Cellelinie | Oprindelse | Vækstmedium & udvalg |
| Menneskelig | Huh-7.5 | Subklon af Huh-7 hepatomacellelinie 17 | DMEM cplt |
| Huh-7.5 [CE1] [E2p7NS2] | Stabilt udtrykker virale proteiner kerne transducerede E1, E2, P7 og NS2 ved lentiviral gen transfer af to uafhængige genkassetter | DMEM cplt + blasticidin 5 ug / ml | |
| Huh-7 Lunet N | Subklon af Huh-7-hepatoma-cellelinie 9 | DMEM cplt | |
| HeLa | Cervikal adenocarcinom-cellelinie (ATCC nr.: CCL-2) | DMEM cplt | |
| HeLa [CE1] [E2p7NS2] | Stabilt udtrykker virale proteiner kerne transducerede E1, E2, P7 og NS2 ved lentiviral genoverførsel af to uafhængige genkassetter | DMEM cplt + G418 750 ug / mL; blasticidin 5 ug / ml | |
| Mus | Hep56.1D | Primær hepatocellulært carcinom (en slags gave fra J. Encke) Voksne C57BL/6J-mus | DMEM cplt |
| Hep56.1D [CE1] [E2p7NS2] | Stabilt expresning virale proteiner kerne transducerede E1, E2, P7 og NS2 ved lentiviral genoverførsel af to uafhængige genkassetter | DMEM cplt + G418 750 ug / mL; blasticidin 5 ug / ml | |
| Hep56.1D hCD81 | Stabilt udtrykker human CD81 transduceret af lentiviral genoverførsel | DMEM cplt + blasticidin 5 ug / ml |
. Tabel 1 Specifikationer om oprindelsen og kultur tilstand af brugte cellelinjer Cplt: komplet, G418: Geneticin, h: mennesker.
9. Repræsentative resultater
I denne undersøgelse, anvendte vi to forskellige metoder til somatisk cellefusion der giver os mulighed for specifikt at undersøge virkningen af begrænsninger faktorer på afslutningen af HCV-replikation cyklus i heterokaryoner. Det skal bemærkes, sikrer den betingede udformning af trans-komplementering ved fusion af de to forskellige celletyper,kun i ægte heterokaryoner mellem humane leverceller og ikke-tolerante cellelinier, virus montage (metode 1) eller virus indrejse og fuld HCV-replikation cyklus (metode 2) er gennemført.
Ved den første fremgangsmåde Huh-7.5-celler, meget tolerante over for HCV, blev transient transficeret med en subgenomisk replicon udtrykker en luciferase transgenet og HCV-ikke-strukturelle proteiner understøtter subgenomiske HCV-RNA-replikation (Huh-7.5 replikon celler). Disse celler blev co-dyrket og fusioneret til cellelinier, som udtrykker HCV-strukturelle proteiner kerne, E1, E2, samt tilbehør proteiner P7 og NS2. Figure1A viser en oversigt over den eksperimentelle procedure. Vigtigere efter PEG fusion, bør alle proteiner nødvendige for partikelsamling være til stede i den dannede heterokaryon som kan bekræftes ved immunofluorescens mod individuelle virale proteiner. Figur 1B viser et eksempel fusion begivenhed, hvor signaler til både NS5A udtrykt i HuH-7.5 replikon celler og E2udtrykt i Huh-7.5 [CE1] [E2p7NS2] pakkeceller blev detekteret i samme cytoplasmaet ved PEG-induceret heterokaryon formation. Når co-dyrkede celler blev stedet behandlet med PBS, blev der ikke fusion induceret således kun en enkelt-positive celler, og ingen co-lokalisering af signaler blev observeret. Endvidere, at styre ekspression af transgenet, udførte vi ELISA specifikke for kerne-og E2 (tidligere beskrevet i detaljer 15). Ud over bekæmpelse pakkende cellelinie Huh 7,5 [CE1] [E2p7NS2], frembragte vi HeLa og Hep56.1D pakkeceller som repræsentanter for human non-lever og muselever-celler. HCV-RNA-replikation effektivitet i disse sidstnævnte celler er lav, og HCV samling og frigivelse er ikke vist. Figur 1C illustrerer resultaterne af fusionen assayet. Supernatanter blev opsamlet fra co-dyrkning ved 48 timer efter fusion induktion og anvendt til at inokulere naive Huh-7.5-celler til efterfølgende luciferase assays. Især blev da Huh-7.5 replikon celler fusioneres med entennaive cellelinier eller behandlet med PBS som kontrol, blev der ikke infektivitet påvist i dyrkningsvæsker. Når cellefusion mellem Huh-7.5 replicon og pakkecellelinier blev induceret ved PEG, trans-komplementering mellem replicon og konstitutivt udtrykte strukturelle proteiner reddede virus produktion i de resulterende heterokaryoner og infektiøse viruspartikler blev frigivet i de dyrkningsvæsker. Vi konkluderede derfor, at virusproduktion kræves cellefusion og ekspression af virale proteiner i pakkecellelinier. Bemærkelsesværdigt, ikke kun de heterokaryoner af Huh-7.5 humane hepatomaceller, men også heterokaryoner med human ikke lever (HeLa [CE1] [E2p7NS2]) og muselever (Hep56.1D [CE1] [E2p7NS2]) cellerne tilladt virus frigivelse, indikerer, at montering og frigivelse ikke er overvejende hæmmes af mulige restriktion faktorer i disse celletyper. Ekspression af strukturelle proteiner i pakkecellelinier og autentisk indtræden i målceller blev vist i Frentzen
En alternativ fremgangsmåde til cellefusion blev anvendt til at analysere eventuelle begrænsninger, som påvirker celleindtrængen, RNA translation og RNA-replikation faser af replikationscyklussen og udelukke, at en høj virusbelastning i transficerede Huh 7,5 replikon celler ville udelukke påvisning af restriktions faktorer ved mætning. Til dette formål har vi udviklet en uafhængig assay baseret på podning af heterokaryoner med HCVcc og detektion af de novo virusproduktion i disse celler. Som skitseret i figur 2A, blev somatisk cellefusion induceret ved ekspression af et fusogent glycoprotein efter co-dyrkning af cellerne. Denne fremgangsmåde blev valgt, fordi følsomheden blev forøget sandsynligvis på grund af øget fusionseffektivitet. Heterokaryoner blev visualiseret ved farvning separate cellelinjer med CellTracker farvestoffer før co-dyrkning. En heterokaryon med homogent fordelte farvestoffer i cytoplasmaet viser fusionen af to celletyper som angiverd i figur 2B. Kun heterokaryoner af Lunet N celler med HeLa-celler eller Hep56.1D hCD81 celler alle HCV indtastning faktorer udtrykkes således selektivt gør heterokaryoner modtagelige for HCV celleindtrængen. Udfordring med HCVcc resulterede i fuldstændig replikation af HCV i heterokaryoner hvilket er tydeligt fra de novo produktion af infektiøst virusafkom cirka 10 gange over baggrunden af assayet (figur 2C). Som en kontrol blev Lunet N-celler fusioneres med Lunet N-celler. Vigtigere kun meget lave niveauer af infektiøs HCV tæt på detektionsgrænsen blev observeret. Lignende resultater blev opnået, når Lunet N-celler blev fusioneret med naive Hep56.1D celler. I begge tilfælde var human CD81 fraværende, så at HCV kan ikke produktivt inficere heterokaryoner. Denne meget lave infektivitet påvist i disse to sidstnævnte tilfælde kunne tilskrives lavt niveau af infektion af Lunet N-celler og / eller lave niveauer af residual infektiøs virus input fra inokulum. I kontrast HeLa-celler og Hep56.1D hCD81 celler udtrykke human CD81, således supplere den mangler celleindtastning faktor i heterokaryoner og tillader HCV celleindtastning. 10-fold øget niveau af infektiøs HCV påvist i mediet af heterokaryoner involverer disse to cellelinjer derfor sandsynligvis afspejler de novo produktion af infektiøse partikler i heterokaryoner. Således har vi konkluderet, at afslutning af HCV-replikation cyklus er ikke begrænset undtagen ekspressionen af dominerende HCV restriktionssteder faktorer i disse cellelinier.
Figur 1. Trans-komplementering af HCV samling og frigivelse i heterokaryoner. (A) Skematisk beskrivelse af den eksperimentelle procedure af PEG-medieret celle-fusion. Den JFH1 luciferase reporter replicon Luc-NS3-5B blev transficeret ind i naive Huh-7.5-celler ved elektroporering. Den næste dag blev cellerne frigjort og co-dyrket med naive celler eller emballage celler, som konstitutivt udtrykker HCV-kerne, E1, E2, P7 og NS2. 24 timer efter co-dyrkning blev heterokaryon dannelse induceret ved behandling med 40% PEG med PBS som negativ kontrol. Efter 48 timer blev celle-fri supernatant høstes til at inokulere naive Huh-7.5-celler. Infektivitet blev bestemt ved luciferaseaktivitet. (B) Til påvisning af heterokaryoner, blev celler immunfarvet under anvendelse af monoklonale antistoffer mod E2 og NS5A. Samtidig ekspression af begge proteiner i celler er indikativ for cellefusion. (C) luciferase målinger blev udført for at kvantificere viral infektivitet fremstillet heterokaryoner. Middelværdier af tre uafhængige eksperimenter og standardafvigelserne af midler er givet. Den vandrette bjælke repræsenterer baggrunden RLU bestemt i uinficerede Huh-7.5 celler. Klik her for at se større figur .
9/4029fig2.jpg "/>
Figur 2. Afslutning af HCV-replikation cyklus efter inokulering af heterokaryoner. (A) Skematisk oversigt over den eksperimentelle procedure. Huh-7 Lunet N-celler, der mangler CD81 blev co-dyrket med de angivne cellelinjer mangler eller udtrykker human CD81. Vigtigt, at disse sidstnævnte celler mangler mindst én HCV indgang faktor, og kan derfor ikke produktivt inficeret. Den næste dag blev fusion igangsat ved transfektion af et fusogent viralt kappeprotein fra pFV. Tredive timer senere blev celler provokeret med infektiøse HCV-partikler. At måle celleindtrængen, RNA replikation og virusproduktion båret af disse heterokaryoner, blev frigivet infektivitet i de cellefri dyrkningsvæsker bestemmes 48 timer efter inokulering. Til dette formål blev naive Huh-7.5-celler anvendt som målceller i en begrænsende fortynding assay (TCID50). (B) til påvisning af heterokaryoner, blev cellerne farvet med CellTracker Grøn eller CellTracker Orange 6 timer forud for co-Kulturplantertion og transfektion. Tredive timer senere blev cellerne fikseret og farvet med DAPI. (C) Lunet N-celler blev fusioneret til HeLa-celler, naive Hep56.1D eller Hep56.1D celler der udtrykker humant CD81. Disse kulturer blev inokuleret med HCVcc (MOI på 2,3). Dyrkningsvæsker blev opsamlet 48 timer senere og de novo partikel frigivelse fra heterokaryoner blev bestemt ved TCID 50 hjælp naive Huh-7.5 målceller. Middelværdier af tre uafhængige eksperimenter. Den vandrette bjælke viser detektionsgrænsen for analysen. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer to metoder til at inducere heterokaryon dannelse i dyrkede celler til analyse af dominante negative begrænsninger, som udelukker HCV-replikation. Under anvendelse af disse fremgangsmåder har vi udelukket nærvær af en dominant konstitutivt udtrykt eller virus-induceret faktor i forskellige humane ikke-leveren og i murine leveren cellelinier. Den første analyse primært analyserer, hvis restriktioner faktorer forebygge HCV samling og frigivelse af infektiøst afkom. Da der i dette tilfælde pakkecellerne er fusioneret til HCV replikon celler mulige restriktionssteder faktorer udtrykt i pakkecellerne kun få adgang til cytoplasmaet af celler, der allerede har en høj belastning af viralt RNA. Derfor har translation af viral RNA opnået, og adskillige produktive HCV-replikation komplekser er blevet etableret, hvilket reducerer chancerne for at opdage mulige begrænsninger i HCV oversættelse og RNA replikation. Faktisk kan den høje belastning af replicon RNA i disse celler udelukker deres identifikation ogkan også hindre påvisning af begrænsninger faktorer for HCV montering og / eller frigivelse på grund af mætning af virale faktorer. For at omgå denne begrænsning, har vi udviklet et andet trans-komplementering analysen, hvor HCV celleindtastning opnås kun i heterokaryoner. Derfor, i dette mere naturlige omgivelser, er virus replikation og efterfølgende produktion af infektiøst afkom igangsat og forløber i heterokaryoner dermed udsætte virusreplikation maskinen direkte til alle mulige restriktion mekanismer udtryk inden for de fusionerede celler. Idet vi har observeret de novo produktion af infektiøse partikler i dette system, konkluderer vi, at ingen af de testede cellelinier udtrykker dominerende begrænsning faktorer HCV celleindtrængen, RNA translation, RNA replikation eller viruskonstruktion og frigivelse. Især virale titere opnået i begge metoder afhænger af en række faktorer. Første transgen ekspression i pakkecellerne kan variere blandt de forskellige cellelinier og kan påvirke trans-Komplementering. Som vist i den supplerende materiale Frentzen et al. Kan referencenumre kriterier for transgen ekspression opnås ved specifik kerne og E2 ELISA og bestemmelse af fusion effektivitet. Desuden kunne cellestørrelse, tæthed, vækstrater og tilbøjelighed til at smelte påvirke heterokaryon dannelse. Derfor er udvises forsigtighed, når man sammenligner effektiviteten af virusproduktion mellem de enkelte heterokaryoner.
Det ville være meget interessant at analysere primære museceller imidlertid en begrænsning af den eksperimentelle opsætning er, at disse celler vil være vanskeligt at transducere og evnen til at fusionere med andre celler er næppe forudsigelig. Imidlertid har dette skal testes specifikt for hver type af primære celler. Alternativer til at identificere artsspecifikke begrænsninger faktorer kunne være indførelse af en cDNA bank af interferon-inducerede mus leverceller. Disse aspekter er allerede blevet drøftet indgående i PLoS patogener papiretved Frentzen et al 15.
For at validere tilgang til at finde potentielle begrænsninger faktorer, vi behandlede Hep56.1D emballage celler med murin IFN-α forud for co-dyrkning og fusion med Huh-7.5 replikon celler. Vi observerede en reduktion af infektivitet tyder på, at IFN-opregulerede gener kan begrænse forsamling i museceller og demonstrere, at potentielle antivirale faktorer kunne påvises med denne analyse.
De der er beskrevet i denne undersøgelse vil være nyttigt til screening af et stort panel af humane og ikke-humane cellelinjer og primære celler til begrænsninger i HCV replikationscyklus. I fremtiden kan sådanne undersøgelser bidrage til identifikation og karakterisering af nye antivirale begrænsninger mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TP modtaget konsulenthonorarer fra Biotest.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Takaji Wakita og Jens Bukh til JFH1 og J6CF isolater, hhv. Derudover har vi takker Charles Ris til Huh-7.5-celler og 9E10 antistof, Steven Foung for E2-specifikt antistof CBH-23, og alle medlemmer af Institut for eksperimentel virologi, Twincore for nyttige forslag og diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 | |
| L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 | |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 | |
| α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | ||
| ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 | |
| Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G | |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 | |
| G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 | |
| Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 | |
| Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 | |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 | |
| Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL | |
| α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | ||
| DAPI (4',6'- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Alexa-Fluor 546 - goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 | |
| Alexa-Fluor 488 - goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 | |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 | |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML | |
| All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | ||
| Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |
References
- Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells. J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).
- Kato, T. Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon. J. Virol. 79, 592-596 (2005).
- Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line. J. Virol. 78, 491-501 (2004).
- Date, T. Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells. J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).
- Chang, K. S. Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities. J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).
- Zhong, J. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).
- Lindenbach, B. D. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309, 623-626 (2005).
- Wakita, T. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat. Med. 11, 791-796 (2005).
- Witteveldt, J. CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells. J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).
- Bitzegeio, J. Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors. PLoS Pathog. 6, e1000978 (2010).
- Lindemann, D., Goepfert, P. A. The foamy virus envelope glycoproteins. Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).
- Brohm, C. Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation. J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).
- Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles. J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).
- Koutsoudakis, G. Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses. J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).
- Frentzen, A. Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines. PLoS Pathog. 7, e1002029 (2011).
- Lindemann, D. A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity. J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).
- Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).
