Summary
We beschrijven twee methoden voor voorwaardelijke
Abstract
Hepatitis C virus (HCV) is een hepatotrope virus met een gastheer-range beperkt tot mensen en chimpansees. Hoewel HCV-RNA-replicatie is waargenomen bij de mens niet-lever-en muizen cellijnen, het rendement was erg laag en de vereiste lange termijn selectieprocedures met HCV replicon bouwt uiten dominante antibiotica-selecteerbare merkers 1-5. HCV-in-vitro-onderzoek is dan ook beperkt tot humane lever cellijnen permissief voor virus in-en voltooiing van de virale levenscyclus. Door de smalle soorten tropisme zware bedrijfsvoertuigen, is er geen immunocompetente klein diermodel beschikbaar bevorderen die voor de volledige HCV replicatiecyclus 6-8. Inefficiënte replicatie van HCV in niet-menselijke cellen bijvoorbeeld van de muis herkomst is waarschijnlijk te wijten aan een gebrek aan genetische onverenigbaarheid van essentiële gastheer afhankelijkheid factoren en / of expressie van beperking factoren.
We hebben onderzocht of HCV voortplanting wordt onderdrukt door dominante beperking factors in een menselijke cellijnen afgeleid van niet-lever weefsels of muizenlever cellijnen. Hiervoor ontwikkelden we twee onafhankelijke voorwaardelijke trans-aanvulling methoden te vertrouwen op somatische celfusie. In beide gevallen voltooiing van de virale replicatie cyclus slechts mogelijk in de heterokaryons. Bijgevolg succesvolle trans-complementatie, die wordt bepaald door de novo productie van infectieuze virale nageslacht geeft geen dominerende beperkingen.
In het bijzonder werden subgenome HCV replicons het dragen van een luciferase transgen getransfecteerd in zeer tolerant humane lever cellen (Huh-7.5-cellen). Vervolgens werden deze cellen samen gekweekt en gefuseerd met verschillende menselijke en muizen cellen die HCV structurele eiwitten kern omhulling 1 en 2 (E1, E2) en extra eiwitten P7 en NS2. Mits celfusie werd gestart door behandeling met polyethyleenglycol (PEG), de cultuur vrijgegeven infectieuze virus paARTIKELEN die naïeve cellen die geïnfecteerd zijn in een receptor-afhankelijke manier.
Om de invloed van de dominante beperkingen op de volledige virale levenscyclus zoals mobiele toegang, RNA-vertaling, replicatie en assemblage virus te beoordelen, hebben we geprofiteerd van een menselijke lever cellijn (Huh-7 Lunet N cellen 9), die endogene expressie van CD81 mist, essentieel ingang factor HCV. Aangezien ectopisch tot expressie CD81, deze cellen in wezen ongevoelig HCV infectie 10. Belangrijk is dat bij gelijktijdige gekweekt en versmolten met cellen die de menselijke CD81 maar gebrek in ieder geval een andere cruciale celinvoer factor (dat wil zeggen SR-BI, CLDN1, OCLN) uit te drukken, alleen de resulterende heterokaryons weer te geven van de complete set van HCV toegang factoren vereiste voor de infectie. Daarom, om te analyseren als dominante beperking factoren onderdrukken voltooiing van de HCV replicatie cyclus, we Lunet N cellen gefuseerd met verschillende cellen van mens en muis oorsprong die de hierboven genoemde crit voldoenERIA. Als co-gekweekte cellen werden getransfecteerd met een zeer fusogeen virale manteleiwit mutant van de prototype schuimende virus (PFV 11) en vervolgens uitgedaagd met infectieuze HCV deeltjes (HCVcc) werd de novo productie van infectieus virus waargenomen. Dit geeft aan dat HCV succes zijn replicatie voltooid heterokaryons dus uitgesloten expressie van dominant beperking factoren deze cellijnen. Deze nieuwe voorwaardelijke trans-aanvulling methoden zal nuttig zijn om een groot panel van cellijnen en primaire cellen screenen voor de expressie van HCV-specifieke dominante beperking factoren.
Protocol
Celfusie van PEG
1. Cel Cultuur
- Culture Huh-7.5 HeLa en Hep56.1D naïeve inpakcellijnen 12 op 15 cm cel kweekschalen in DMEM complete (DMEM CPLT) medium, DMEM aangevuld met 2 mM L-glutamine, 1x niet-essentiële aminozuren, 100 U / mL penicilline, 100 pg / ml streptomycine, en 10% foetaal kalfsserum. Passende selectie van stabiele cellijnen zoals aangegeven in tabel 1.
2. Transfectie van HCV RNA
- Tweemaal wassen Huh-7.5 cellen (een confluente 15 cm schotel) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), trypsinize en resuspenderen in een concentratie van 1.5x10 7 cellen / ml in Cytomix (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 10 mM K 2 HPO 4 [pH 7,6], 25 mM HEPES, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, pH 7,6 met KOH en gesteriliseerd door filtratie) dat 2 mM ATP en 5 mM glutathion.
- Transfecteren via electroporation 400 pi van de celsuspensie (6x10 6 cellen) met 10 ug HCV RNA (pFKi389Luc-EI/NS3-3 "_JFH1_dg 13) cuvetten met een spleetbreedte van 0,4 cm en een Gene Puiser Xcell systeem (Biorad) op 975 uF en 270 V als eerder beschreven 14.
- Onmiddellijk overbrengen getransfecteerd Huh-7.5-cellen tot 10 ml DMEM CPLT medium en zaad de gehele ophanging in een cultuur schotel van 10 cm diameter. Culture cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
3. Inductie van Fusion door PEG
- Oogsten cellen zoals beschreven in 2.1, opnieuw in suspensie in DMEM CPLT medium en vul aan tot 5x10 5 cellen / ml.
- Genereren enkele-celsuspensies van Huh-7.5 HeLa en Hep56.1D inpakcellen en verdun tot 5x10 5 cellen / ml, 2x10 5 cellen / ml en 2x10 5 cellen / ml. Merk op dat inpakcellen ectopisch express HCV proteïnen kern, E1, E2, p7 en NS2 na transductie met twee inafhankelijk van lentivirale vectoren transduceren een C-E1 en E2-P7-NS2 expressiecassette, respectievelijk 13, 15.
- Bereid 6-well kweekplaten met 2-3 steriele glazen dekglaasjes per putje voor verdere analyse van fusie-efficiëntie.
- Combineer 1 mL getransfecteerde Huh-7.5 cellen die het subgenomische replicon met 1 ml inpakcellen, zaad in een putje van een 6-wells plaat, en incuberen gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Op dit tijdstip moet celdichtheid liggen tussen 60-80% confluentie voor inductie van celfusie zodat cellen worden in de nabijheid van celmembranen te smelten.
- Zuigen medium van co-gekweekte cellen en was eenmaal met 1 ml PBS, dan wordt voorzichtig 500 pi voorverwarmde 40% PEG-1500 of PBS als controle Incubeer 5 min bij 37 ° C heterokaryon vorming induceren.
- Zuig PEG en zorgvuldig 3-5 keer wassen gedurende 1 minuut (min) per wasbeurt met 2 mL PBS om het teveel aan PEG te verwijderen en tot slot voeg 2ml DMEM medium CPLT aan elk putje en incuberen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Achtenveertig uur na de fusie, het verzamelen van elke supernatant en filtreer door een 0,45 pm filter.
- Meet de productie van besmettelijke deeltjes in gesmolten heterokaryons door inoculatie van naïeve Huh-7.5-cellen (8x10 4 cellen / putje gezaaid in een 12-wells plaat, 24 uur voorafgaand aan de inenting) met 500 pL van cel-vrije cultuur vloeistof en daaropvolgende bepaling van luciferase activiteit 14.
4. Immunofluorescentie naar Fusion efficiëntie te bepalen
- Na het verzamelen van Celkweeksupernatants (paragraaf 3.8), was putjes met glazen deksel een keer glijdt met 1 ml PBS gedurende 1 minuut. Alle volgende stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT) en wassen moet gebeuren met 1 ml PBS gedurende 1 min per wasstap.
- Zet cellen met 600 pi van 3% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 15 minuten en daarna wassen 3x met PBS. Zorgvuldig over te dragen dekglaasjesin een 24-wells plaat met een tang.
- Permeabilize cellen met 500 ul 0,5% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten en vervolgens 3x wassen met PBS.
- Bereid primaire antilichaam in PBS aangevuld met 5% geitenserum. Gebruik anti-NS5A antilichaam (9E10) bij een concentratie van 0,5 pg / ml en menselijke monoclonale anti-E2-antilichaam (CBH-23) bij een concentratie van 6,4 ng / ml. Breng 250 pi aan elk putje en incuberen bij kamertemperatuur 45 minuten.
- Was 3x met PBS en detecteren gebonden primaire antilichamen met 250 pi secundaire geit anti-muis of geit anti-menselijk IgG-antilichamen geconjugeerd met Alexa-Fluor 546 of Alexa-Fluor 488 in een concentratie van 2 pg / ml in PBS aangevuld met 5% geitenserum. Gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Vervolgens wassen 1x met PBS en vervolgens celkernen vlek 250 pi DAPI (4 ', 6'-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride) verdund in PBS 1:3,000, geïncubeerd 1 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Was 4x met PBS en 1x met H 2
Fusie door kortstondige transfectie van prototype schuimig virus (PFV) glycoproteïne
5. Voorbereiding van Viral Inoculum
- Maak een hoge titer virus voorraad door transfecteren in-vitro getranscribeerde HCV-RNA in Huh-7.5-cellen en het oogsten van celcultuur supernatant na 48 uur en 72 uur zoals eerder beschreven 14. Bepaal virale titer door beperkende verdunning assay (TCID50) 13.
6. Cultuur van de Cel, Cell Fusion door transfectie van een fusogeen PFV Glycoproteïne
- Cultuur Lunet N, HeLa en Hep56.1D hCD81 cellen volgens de instructies in tabel 1 in DMEM CPLT medium met juiste selecties.
- Maak cellen zoals beschreven in 2.1, voor te bereiden enkele cel suspensies in DMEM CPLT medium, en co-cultiveren Lunet N cellen met HeLa of Hep56.1D hCD81 cellijnen op de juiste verhoudingen (bijvoorbeeld 1:2 voor Hep56.1D hCD81 of 1:1 voor HeLa cellen) waardoor in totaal celdichtheid van 1.5x10 5 cellen per 12 goed en geïncubeerd 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- De volgende dag transient transfecteren cellen met de zeer fusogeen PFV manteleiwit (pczHFVenvEM066 16) met Lipofectamine 2000 volgens de fabrikant.
7. Infectie Assay
- Enten heterokaryons 30 uur na transfectie met 350 ul virusstock (MOI van ~ 2.3) gedurende 12 uur overnacht eenmaal wassen met PBS en 1 ml DMEM medium CPLT per well. Incubeer 48 h bij 37 ° C en 5% CO2.
- Oogst supernatant van heterokaryon cultuur, filter door een 0,45 pm filter en inoculatie Huh-7.5-cellen, gezaaid in 96-well platen (1x10 4 cellen / putje) de dag ervoor, in een beperkte verdunning test
- Na 72 uur, vlek besmet Huh-7.5-cellen met een HCV-specifieke antilichaam (NS5A; 9E10) om de productie van besmettelijke nakomelingen deeltjes te kwantificeren.
8. Visualisatie van celfusie
- Om fusie gebeurtenissen te visualiseren, voor te bereiden 5 tot 10 uM oplossingen van CellTracker kleurstoffen in DMEM medium zonder additieven en voer de stappen onder de 6 uur voor co-cultuur (beschreven in paragraaf 6.2 en 6.3).
- Ze wast hechtende cellen met 5 ml PBS en cellen geïncubeerd met 4 ml oplossing per vlekken 10 cm schotel 45 min bij 37 ° C en 5% CO2 (vlek Lunet N cellen CellTracker Orange CMTMR en HeLa of Hep56.1D hCD81 cellen met CellTracker Green CMFDA, afzonderlijk verkrijgbaar).
- Keer wassen cellen met 5 ml PBS gedurende 1 minuut en voeg DMEM medium CPLT, incuberen gedurende 6 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Bereid zaaien en transfectie van gekleurde cellen zoals beschreven in 6.2 en echter een dekglas aan decelcultuur gerecht vóór het zaaien.
- 30 uur na transfectie zorgvuldig gewassen cellen met 1 ml PBS gedurende 1 minuut en vervolgens cellen vast met 250 pi van 3% PFA gedurende 15 min bij KT. Ze wast cellen met 1 ml PBS gedurende 1 minuut, met DAPI vlek gedurende 1 minuut, zoals beschreven in paragraaf 4.6, een keer wassen met 1 ml PBS gedurende 1 minuut, herhaal dan wassen met H 2 O en mount dekglaasjes op glasplaatjes (zie rubriek 4.7 ). Analyseer cellen met een fluorescentie microscoop.
| Soorten | Cellijn | Herkomst | Groeimedium & selectie |
| Menselijk | Huh-7.5 | Subkloon van Huh-7 hepatomacellijn 17 | DMEM CPLT |
| Huh-7.5 [CE1] [E2p7NS2] | Stabiel tot expressie virale eiwitten kern, E1, E2, p7 en NS2, getransduceerd door lentivirale gen transfer van twee onafhankelijke gen cassettes | DMEM CPLT + Blasticidine 5 ug / ml | |
| Huh-7 Lunet N | Subkloon van Huh-7 hepatomacellijn 9 | DMEM CPLT | |
| HeLa | Cervicale adenocarcinoom cellijn (ATCC nummer: CCL-2) | DMEM CPLT | |
| HeLa [CE1] [E2p7NS2] | Stabiel tot expressie virale eiwitten kern, E1, E2, p7 en NS2, getransduceerd door lentivirale genoverdracht van twee onafhankelijke gen cassettes | DMEM + CPLT G418 750 ug / mL; Blasticidine 5 ug / ml | |
| Muis | Hep56.1D | Primaire hepatocellulair carcinoom (soort gift van J. Encke) Volwassen C57BL/6J-muizen | DMEM CPLT |
| Hep56.1D [CE1] [E2p7NS2] | Stabiel exop virale eiwitten kern getransduceerde E1, E2, p7 en NS2 door lentivirale genoverdracht van twee onafhankelijke gen cassettes | DMEM + CPLT G418 750 ug / mL; Blasticidine 5 ug / ml | |
| Hep56.1D hCD81 | Stabiel tot expressie menselijke CD81 getransduceerd door lentivirale genoverdracht | DMEM CPLT + Blasticidine 5 ug / ml |
. Tabel 1 Specificaties over de herkomst en de cultuur staat van de gebruikte cellijnen CPLT: compleet, G418: geneticine, h: de mens.
9. Representatieve resultaten
In deze studie hebben we toegepast twee verschillende methoden van somatische celfusie die ons in staat om specifiek onderzoek naar de impact van de beperking factoren op de voltooiing van het HCV replicatie cyclus in heterokaryons. Van de nota, de voorwaardelijke ontwerp van de trans-aanvulling bij de fusie van de twee verschillende soorten cellen zorgt ervoor datalleen echte heterokaryons tussen menselijke levercellen en niet-permissieve cellijnen virus samenstel (benadering 1) of virus ingang en de volledige HCV replicatiecyclus (benadering 2) zijn afgerond.
In de eerste benadering Huh-7.5 cellen zeer tolerant voor HCV werden voorbijgaand getransfecteerd met een subgenomische replicon expressie van een transgen luciferase en HCV niet-structurele eiwitten ondersteunen subgenomische RNA HCV replicatie (uitleg-7.5 replicon cellen). Deze cellen werden samen gekweekt en gefuseerd met cellijnen expressie HCV structurele eiwitten kern, E1, E2, alsmede bijkomende eiwitten P7 en NS2. Figure1A geeft een overzicht van de experimentele procedure. Belangrijk na PEG-fusie dienen alle eiwitten vereist deeltjes montage aanwezig in de gevormde heterokaryon kan worden bevestigd door immunofluorescentie op individuele virale eiwitten. Figuur 1B toont een voorbeeldige fusie evenement waarbij signalen voor beide NS5A uitgedrukt in Huh-7.5 replicon cellen en E2uitgedrukt in Huh-7.5 [CE1] [E2p7NS2] verpakking cellen werden aangetroffen in dezelfde cytoplasma bij de PEG-geïnduceerde heterokaryon formatie. Als co-gekweekte cellen in plaats behandeld met PBS, werden geen fusie aldus geïnduceerde alleen een positieve cellen en zonder co-lokalisatie van signalen waargenomen. Bovendien zou expressie van het transgen te beheersen, voerden we ELISA die specifiek zijn voor de kern en E2 (eerder in detail 15). Naast de controle inpakcellijn Huh 7,5 [CE1] [E2p7NS2] genereerden we HeLa en Hep56.1D inpakcellen als vertegenwoordigers voor menselijke niet-lever en muizenlever cellen. HCV RNA replicatie-efficiëntie van deze laatste cellen laag en HCV montage en afgifte is niet aangetoond. Figuur 1C toont de resultaten van de fusie assay. Supernatanten werden verzameld uit de co-cultuur op 48 uur na de fusie inductie en gebruikt om naïeve Huh-7.5-cellen te enten voor de volgende luciferase assays. Met name werd bij Huh-7.5 replicon cellen gefuseerd met eennaïeve cellijnen of behandeld met PBS als controle werd geen infectiviteit gevonden in de kweekvloeistoffen. Wanneer echter celfusie tussen Huh-7.5 replicon en inpakcellijnen werd geïnduceerd door PEG, trans-complementatie van replicon en constitutief tot expressie structurele eiwitten gered virusproductie in de resulterende heterokaryons en infectieuze virusdeeltjes werden losgelaten in de kweekvloeistoffen. Er werd geconcludeerd dat virusproductie vereist celfusie en expressie van virale eiwitten in de inpakcellijnen. Opvallend is dat niet alleen de heterokaryons van Huh-7.5 humane lever cellen, maar ook heterokaryons met menselijke niet-lever (HeLa [CE1] [E2p7NS2]) en de muis lever (Hep56.1D [CE1] [E2p7NS2]) cellen toegestaan virus release, wat aangeeft dat de montage en introductie niet worden overwegend geremd door eventuele beperking factoren in deze celtypen. Expressie van structurele eiwitten in verpakking cellijnen en authentieke binnenkomst in doelcellen werd getoond in Frentzen
Een alternatieve celfusie werd gebruikt om mogelijke restricties voor celbinnendringing, RNA en RNA vertaling replicatie fasen van de replicatiecyclus analyseren en te sluiten dat een hoge virale belasting in getransfecteerde Huh 7,5 replicon cellen zou detectie restrictie factoren weg door verzadiging. Daartoe ontwikkeld onafhankelijk assay gebaseerd op inoculatie van heterokaryons met HCVcc en detectie van de novo virus productie in deze cellen. Zoals in figuur 2A is somatische celfusie geïnduceerd door het expressieproduct van fusogeen glycoproteïne na co-kweken van de cellen. Deze methode is gekozen omdat de gevoeligheid is waarschijnlijk gestegen door de toegenomen fusie-efficiëntie. Heterokaryons werden gevisualiseerd door kleuring aparte cellijnen met CellTracker kleurstoffen voorafgaand aan de co-teelt. Een heterokaryon met homogeen verdeeld kleurstoffen in het cytoplasma geeft fusie van twee soorten cellen zoals aangevend in figuur 2B. Alleen in heterokaryons van Lunet N cellen met HeLa-cellen of Hep56.1D hCD81 cellen worden alle HCV toegang factoren die zijn uitgedrukt dus selectief heterokaryons gevoelig voor HCV celinvoer renderen. Challenge met HCVcc tot een volledige replicatie van HCV in heterokaryons hetgeen blijkt uit de novo productie van infectieuze virale nageslacht ongeveer 10 maal boven de achtergrond van de assay (figuur 2C). Als controle werden Lunet N cellen gefuseerd met Lunet N cellen. Belangrijk slechts zeer lage niveaus van infectieuze HCV nabij de detectielimiet waargenomen. Vergelijkbare resultaten werden verkregen wanneer Lunet N cellen werden gefuseerd met naïeve Hep56.1D cellen. In beide gevallen menselijke CD81 afwezig zodat HCV niet productief infecteren heterokaryons. Deze zeer lage infectiviteit gevonden in deze laatste twee gevallen is waarschijnlijk te wijten aan lage infectie van Lunet N cellen en / of lage hoeveelheden resterende infectieus virus invoer van de inoculum. In tegenstelling HeLa cellen Hijp56.1D hCD81 cellen brengen menselijke CD81, zulks ter aanvulling van de ontbrekende celinvoer factor in de heterokaryons en het toestaan van HCV celinvoer. De 10-voudig verhoogd niveau van besmettelijke HCV ontdekt in het medium van heterokaryons met betrekking tot deze twee cellijnen daarom waarschijnlijk weerspiegelt de novo productie van besmettelijke deeltjes in heterokaryons. Zo concludeerden we dat de voltooiing van de HCV cyclus niet beperkt zonder de expressie van dominant HCV beperking factoren in deze cellijnen.
Figuur 1. Trans-complementatie van HCV montage en introductie heterokaryons. (A) Schematisch overzicht van de experimentele procedure van PEG-gemedieerde celfusie. De JFH1 luciferase reporter replicon Luc-NS3-5B werd getransfecteerd in naïeve Huh-7.5-cellen door middel van elektroporatie. De volgende dag werden de cellen losgemaakt en samen gekweekt met naïeve cellen of verpakking cellen constitutief tot expressie HCV kern, E1, E2, p7 en NS2. 24 uur na cocultivatie werd heterokaryon vorming geïnduceerd door behandeling met 40% PEG met PBS als negatieve controle. Na 48 uur werd celvrij supernatant geoogst te naïef Huh-7.5-cellen te enten. Infectiviteit werd bepaald door luciferaseactiviteit. (B) Voor de detectie van heterokaryons, werden de cellen immunostained met behulp van monoklonale antilichamen tegen E2 en NS5A. Gelijktijdige expressie van eiwitten in cellen is indicatief voor celfusie. (C) Luciferase metingen werden uitgevoerd om virale besmettelijkheid uit heterokaryons kwantificeren. Gemiddelde waarden van drie onafhankelijke experimenten en de standaarddeviatie van de middelen worden gegeven. De horizontale balk staat voor de achtergrond RLU bepaald bij niet-geïnfecteerde Huh-7.5-cellen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
9/4029fig2.jpg "/>
Figuur 2. Voltooiing van HCV replicatiecyclus na inoculatie van heterokaryons. (A) Schematische weergave van de experimentele procedure. He-7 Lunet N cellen zonder CD81 werden samen gekweekt met de aangegeven cellijnen beschikbaar of expressie menselijke CD81. Belangrijk deze laatste cellen missen ten minste een HCV ingang factor en dus niet met vrucht worden geïnfecteerd. De volgende dag werd fusie geïnitieerd door transfectie van een fusogeen virale manteleiwit van PFV. Dertig uur later werden de cellen geprovoceerd met infectieuze HCV deeltjes. Om cel binnenkomst, RNA-replicatie en virus productie ondersteund door deze heterokaryons te meten, werd uitgebracht infectiviteit in de cel-vrije cultuur vloeistoffen bepaald 48 uur na inenting. Hiertoe werden naïeve Huh-7.5 cellen als doelcellen in beperkende verdunning assay (TCID50). (B) voor detectie van heterokaryons werden de cellen gekleurd met CellTracker groen of CellTracker Orange 6 uur voorafgaand aan co-Gecultivatie en transfectie. Dertig uur later werden de cellen gefixeerd en gekleurd met DAPI. (C) Lunet N cellen werden gefuseerd met HeLa-cellen, naïve Hep56.1D of Hep56.1D cellen die de menselijke CD81. Deze culturen werden geïnoculeerd met HCVcc (MOI 2,3). Cultuur vloeistoffen werden 48 uur later verzameld en de novo deeltjes vrijlating uit de heterokaryons werd bepaald door TCID 50 met behulp van naïeve Huh-7.5 doelcellen. Gemiddelde waarden van drie onafhankelijke experimenten zijn vermeld. De horizontale balk staat voor de detectiegrens van de test. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We twee methoden heterokaryon vorming in gekweekte cellen induceren voor de analyse van dominant negatieve beperkingen die HCV weg. Met deze procedures we niet de aanwezigheid van een dominante constitutief of virus-geïnduceerde factor in verschillende humane niet-lever en in muizen lever cellijnen. De eerste test analyseert in de eerste plaats als beperking factoren te voorkomen HCV-assemblage en het vrijkomen van besmettelijke nageslacht. Aangezien in dit geval de inpakcellen zijn gefuseerd met HCV replicon cellen mogelijk beperkt factoren die in de inpakcellen alleen toegang tot het cytoplasma van de cellen die reeds een grote belasting van viraal RNA. Daarom is de vertaling van viraal RNA afgerond en talrijke productieve HCV replicatie complexen zijn vastgesteld, waardoor er minder kans op mogelijke beperkingen van de HCV-vertaling en RNA-replicatie op te sporen. In feite kan de hoge belasting van replicon RNA in deze cellen weg de identificatie enkan ook belemmeren detectie van beperking factoren voor HCV montage en / of release als gevolg van verzadiging door virale factoren. Om deze beperking te omzeilen, ontwikkelden we een tweede trans-complementatie test waar HCV celinvoer alleen wordt bereikt in heterokaryons. Bijgevolg is in deze meer natuurlijke omgeving, is virus replicatie en de daarop volgende productie van besmettelijke nakomelingen begonnen en verloopt in heterokaryons dus het blootstellen van de virale replicatie machines rechtstreeks aan alle mogelijke beperking mechanismen die binnen het gefuseerde cellen. Sinds zagen we de novo productie van infectieuze deeltjes in dit systeem, kunnen we concluderen dat geen van de geteste cellijnen uitdrukt dominante beperking factoren van HCV cel binnenkomst, RNA vertaling, RNA-replicatie of virus montage en release. Met name virale titers bereikt beide methoden afhangen van een aantal factoren. Eerste transgenexpressie in de inpakcellen kan variëren tussen de verschillende cellijnen kunnen beïnvloeden trans-Complementatie. Zoals in de aanvullende materiaal Frentzen et al.. Kan verwezen criteria transgenexpressie worden verkregen door specifieke kern en E2 ELISA en de bepaling van fusie efficiëntie. Bovendien zou celgrootte, dichtheid, groeicijfers en neiging tot fuseren te beïnvloeden heterokaryon formatie. Daarom is voorzichtigheid geboden bij het vergelijken van de efficiëntie van de virus productie tussen individuele heterokaryons.
Het zou zeer interessant primaire muizencellen analyseren echter een beperking van de experimentele opstelling is dat deze cellen moeilijk te transduceren en in staat te fuseren met andere cellen nauwelijks voorspelbaar. Dit heeft echter specifiek getest voor elk type van primaire cellen. Alternatieven voor soort-specifieke beperking factoren te identificeren kan de invoering van een cDNA-bank van interferon-geïnduceerde muis levercellen zijn. Deze aspecten zijn reeds uitvoerig besproken in de PLoS pathogenen papierdoor Frentzen et al. 15.
Om de aanpak van het vinden van mogelijke beperking factoren die we Hep56.1D verpakking cellen behandeld met muizen IFN-α voorafgaand aan de co-teelt en fusie met Huh-7.5 replicon cellen te valideren. We zagen een vermindering van de besmettelijkheid suggereert dat IFN-opgereguleerd genen kan de montage te beperken in muizencellen en waaruit blijkt dat potentiële antivirale factoren kunnen worden gedetecteerd met deze test.
De systemen die in deze studie is het nuttig een groot paneel van humane en niet-humane cellijnen of primaire cellen beperkingen van het HCV replicatiecyclus screenen. In de toekomst kunnen dergelijke studies bijdragen aan de identificatie en karakterisering van nieuwe antivirale beperking mechanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TP overleg met de ontvangen vergoedingen van Biotest.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar Takaji Wakita en Jens Bukh voor JFH1 en J6CF isolaten, respectievelijk. Verder danken wij Charles Rice voor Huh-7.5-cellen en het 9E10 antilichaam, Steven Foung voor de E2-specifieke antilichaam CBH-23, en alle leden van de afdeling Experimentele Virologie, Twincore voor nuttige suggesties en discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 | |
| L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 | |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 | |
| α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | ||
| ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 | |
| Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G | |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 | |
| G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 | |
| Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 | |
| Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 | |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 | |
| Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL | |
| α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | ||
| DAPI (4',6'- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Alexa-Fluor 546 - goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 | |
| Alexa-Fluor 488 - goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 | |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 | |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML | |
| All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | ||
| Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |
References
- Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells. J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).
- Kato, T. Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon. J. Virol. 79, 592-596 (2005).
- Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line. J. Virol. 78, 491-501 (2004).
- Date, T. Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells. J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).
- Chang, K. S. Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities. J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).
- Zhong, J. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).
- Lindenbach, B. D. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309, 623-626 (2005).
- Wakita, T. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat. Med. 11, 791-796 (2005).
- Witteveldt, J. CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells. J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).
- Bitzegeio, J. Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors. PLoS Pathog. 6, e1000978 (2010).
- Lindemann, D., Goepfert, P. A. The foamy virus envelope glycoproteins. Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).
- Brohm, C. Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation. J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).
- Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles. J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).
- Koutsoudakis, G. Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses. J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).
- Frentzen, A. Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines. PLoS Pathog. 7, e1002029 (2011).
- Lindemann, D. A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity. J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).
- Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).
