Summary
हम सशर्त के लिए दो विधियों का वर्णन
Protocol
खूंटी द्वारा सेल फ्यूजन
1. सेल संस्कृति
- हं 7.5 HELA और पैकेजिंग भोले या सेल लाइनों 15 सेमी DMEM पूरा (DMEM cplt) मध्यम में सेल संस्कृति बर्तन पर 12 Hep56.1D संस्कृति, DMEM की 2 मिमी एल glutamine, है 1x गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 100 के साथ पूरक यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 μg / एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम. स्थिर सेल लाइनों के रूप में तालिका 1 में संकेत के लिए उपयुक्त चयन पर लागू करें.
2. HCV शाही सेना के अभिकर्मक
- हं - 7.5 कोशिकाओं फास्फेट (एक संगामी 15 सेमी पकवान) के साथ दो बार धो (पीबीएस) खारा, trypsinize बफर और 1.5x10 7 कोशिकाओं / एमएल Cytomix में एक एकाग्रता (120 मिमी KCl, 0.15 मिमी 2 CaCl, 10 मिमी कश्मीर में resuspend है 2 HPO 4 [पीएच 7.6], 25 मिमी HEPES के, 2 मिमी EGTA 5 मिमी 2 MgCl, KOH के साथ 7.6 पीएच को समायोजित और निस्पंदन द्वारा निष्फल) 2 मिमी एटीपी और 5 मिमी glutathione युक्त.
- Transfect के माध्यम से electroporatआयन सेल 10 μg HCV आरएनए ('pFKi389Luc-EI/NS3-3 13 _JFH1_dg) के साथ निलंबन (6x10 6 कोशिकाओं) 0.4 सेमी की एक अंतराल चौड़ाई और एक जीन pulser Xcell प्रणाली (Biorad) के 975 के लिए सेट के साथ cuvettes का उपयोग कर के 400 μL μF और 270 वी के रूप में 14 पहले से वर्णित है.
- तुरंत DMEM cplt मध्यम और 10 सेमी व्यास का एक ही संस्कृति डिश में पूरे निलंबन बीज के 10 एमएल ट्रांसफ़ेक्ट हं-7.5 कोशिकाओं के हस्तांतरण. संस्कृति कोशिकाओं के 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
3. फ्यूजन की खूंटी से प्रेरण
- हार्वेस्ट कोशिकाओं के रूप में 2.1 में वर्णित, DMEM cplt मध्यम में resuspend और 5x10 5 / एमएल कोशिकाओं के लिए कमजोर है.
- हं-7.5 के एकल कोशिका निलंबन, HeLa, और Hep56.1D पैकेजिंग कोशिकाओं, और कमजोर करने के लिए 5x10 5 कोशिकाओं / एमएल, 2x10, 5 कोशिकाओं / एमएल, और 2x10 5 कोशिकाओं / एमएल क्रमशः, उत्पन्न. नोट करें कि पैकेजिंग ectopically के साथ दो व्यक्त HCV के प्रोटीन कोर, E1, E2 p7, और NS2 कोशिकाओं के पारगमन के बादनिर्भर lentiviral वैक्टर transducing सी E1 और E2-p7 NS2 अभिव्यक्ति कैसेट, क्रमशः 13, 15.
- 2-3 संलयन दक्षता के आगे के विश्लेषण के लिए बाँझ कांच अच्छी तरह से प्रति निकल जाता है कवर के साथ 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों तैयार.
- ट्रांसफ़ेक्ट हं 7.5 पैकेजिंग कोशिकाओं, बीज के 1 एमएल के साथ अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से 6 थाली में subgenomic replicon शरण कोशिकाओं के 1 एमएल का मिश्रण है, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में 24 घंटे के लिए सेते हैं.
- इस समय बिंदु पर, सेल घनत्व सेल संलयन के शामिल होने से पहले के बीच में 60-80% confluency लेकर क्रम में कोशिकाओं के कोशिका झिल्ली के लिए फ्यूज के लिए करीब निकटता में होने की अनुमति चाहिए.
- सह संवर्धित कोशिकाओं से मध्यम महाप्राण (व्यंजन) और 1 एमएल पीबीएस के साथ एक बार धोना, तो ध्यान से 5 मिनट के लिए 37 ° C पर पूर्व गर्म 40% खूंटी-1500 या नियंत्रण और सेते हैं के रूप में पीबीएस 500 μL heterokaryon गठन प्रेरित जोड़ने.
- खूंटी महाप्राण (व्यंजन) और ध्यान से धो प्रति 1 मिनट (न्यूनतम) के लिए 3-5 बार 2 एमएल पीबीएस के साथ धोने के लिए अतिरिक्त खूंटी को हटाने और अंत में 2 जोड़नेDMEM cplt एक अच्छी तरह से मध्यम और 37 में सेते हैं एमएल डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- अड़तालीस घंटे के बाद संलयन, प्रत्येक सतह पर तैरनेवाला और एक .45 माइक्रोन के माध्यम से फिल्टर फिल्टर इकट्ठा.
- इनकार heterokaryons में संक्रामक कणों के भोले हं 7.5 (4 / अच्छी तरह से एक थाली 12 अच्छी तरह से, 24 घंटे पहले टीका करने के लिए वरीयता प्राप्त कोशिकाओं 8x10) कोशिकाओं के सेल से मुक्त संस्कृति तरल पदार्थ के 500 μL और luciferase के बाद दृढ़ संकल्प के साथ टीका द्वारा उपाय उत्पादन 14 गतिविधि.
4. फ्यूजन क्षमता का निर्धारण करने के लिए immunofluorescence
- सेल संस्कृति supernatants (3.8 अनुभाग) को इकट्ठा करने के बाद धोने, कुओं गिलास को कवर युक्त 1 मिनट के लिए 1 एमएल पीबीएस के साथ एक बार निकल जाता है. सभी निम्नलिखित कदम कमरे के तापमान (आर टी) में किया जाना चाहिए और धोने धोने प्रति 1 मिनट के लिए 1 एमएल पीबीएस के साथ किया जाना चाहिए.
- , पीबीएस में 15 मिनट के लिए 600 3% paraformaldehyde के μL (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और तो पीबीएस के साथ 3x धोने. ध्यान से कवर निकल जाता है हस्तांतरण24 अच्छी तरह से संदंश का उपयोग कर की थाली में.
- 0.5% ट्राइटन, पीबीएस में 5 मिनट के लिए X-100 के 500 μL साथ कोशिकाओं Permeabilize के और बाद में पीबीएस के साथ 3x धोना.
- पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के लिए 5% बकरी सीरम के साथ पूरक तैयार. 6.4 एनजी / एमएल के एक एकाग्रता में 0.5 μg / एमएल और मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विरोधी E2 (CBH-23) की एकाग्रता में विरोधी NS5A प्रतिरक्षी (9E10) का प्रयोग करें. एक अच्छी तरह से 250 μL लागू करें और 45 मिनट के लिए आरटी में सेते हैं.
- पीबीएस के साथ 3x धो और 250 μL माध्यमिक बकरी विरोधी माउस या बकरी विरोधी मानव आईजीजी विशेष 546 एलेक्सा Fluor या 488 एलेक्सा-Fluor संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ ही प्राथमिक एंटीबॉडी 2 पीबीएस में μg / एमएल की एकाग्रता पर, पता लगाने के साथ पूरक 5% बकरी सीरम. आर टी पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं.
- फिर, Pbs के साथ 1x धोने और बाद में 250 μL DAPI (4 ', 6'-diamidino 2 phenylindole dihydrochloride) पीबीएस में 1:3,000 पतला, आरटी में 1 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं के साथ सेल नाभिक दाग.
- पीबीएस और 1x साथ में 2 एच के साथ 4x धो
प्रोटोटाइप फेनयुक्त वायरस की क्षणिक अभिकर्मक (PFV) ग्लाइकोप्रोटीन द्वारा फ्यूजन
5. वायरल Inoculum की तैयारी
- हं 7.5 कोशिकाओं में इन विट्रो लिखित HCV शाही सेना में transfecting है और 48 घंटे और 72 घंटे के बाद सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला कटाई के रूप में 14 पहले से वर्णित द्वारा एक उच्च टिटर वायरस स्टॉक का उत्पादन. कमजोर पड़ने (50 TCID) परख 13 सीमित वायरल अनुमापांक द्वारा निर्धारित.
6. सेल, सेल फ्यूजन संस्कृति एक Fusogenic PFV glycoprotein के प्रोटोकॉल से
- संस्कृति Lunet N HeLa, और उपयुक्त चयन युक्त DMEM cplt माध्यम तालिका 1 में दिए गए निर्देशों के अनुसार Hep56.1D hCD81 कोशिकाओं.
- 2.1 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को अलग करें, DMEM cplt मीटर में एकल कक्ष निलंबन तैयारedium, और सह खेती Lunet एन HeLa या Hep56.1D hCD81 सेल लाइनों के साथ उचित अनुपात (01:02 hCD81 Hep56.1D या HELA कोशिकाओं के लिए 1:01 के लिए उदाहरण के लिए) प्रति 1.5x10 5 कोशिकाओं की कुल सेल घनत्व उपज कोशिकाओं 12 अच्छी तरह से और 37 पर 24 घंटे के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- अगले दिन, transiently अत्यधिक fusogenic PFV लिफाफा प्रोटीन (16 pczHFVenvEM066) के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार 2000 Lipofectamine का उपयोग करके कोशिकाओं transfect.
7. संक्रमण परख
- Heterokaryons वायरस स्टॉक के 350 रातोंरात 12 ज के लिए (2.3 ~ MOI) μL साथ अभिकर्मक के बाद 30 घंटे टीका लगाना, Pbs के साथ एक बार धोने और अच्छी तरह से प्रति DMEM cplt मध्यम 1 एमएल जोड़ने. 37 में 48 घंटे के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- Heterokaryon संस्कृति की फसल सतह पर तैरनेवाला, एक .45 माइक्रोन फिल्टर और टीका लगाना हं 7.5 कोशिकाओं, 96 अच्छी तरह से प्लेट में वरीयता (1x10 चार कक्षों अच्छी तरह से /) से पहले दिन एक सीमित कमजोर पड़ने परख में, के माध्यम से फिल्टर
- संक्रामक संतान कणों का उत्पादन यों, 72 घंटे के बाद, एक HCV विशेष (9E10 NS5A) एंटीबॉडी के साथ संक्रमित हं-7.5 कोशिकाओं के दाग.
8. सेल फ्यूजन का विज़ुअलाइज़ेशन
- संलयन घटनाओं कल्पना करने के लिए, additives के बिना DMEM मध्यम में 5-10 CellTracker रंगों की माइक्रोन समाधान और तैयार सह संस्कृति के पहले 6 घंटे नीचे चरणों को पूरा करने (वर्गों 6.2 और 6.3 में वर्णित).
- पक्षपाती कोशिकाओं पीबीएस की 5 एमएल के साथ एक बार और धो तो 45 मिनट के लिए 37 से 10 सेमी पकवान प्रति समाधान धुंधला की 4 एमएल के साथ कोशिकाओं को सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 (Lunet एन CellTracker से ऑरेंज CMTMR और HeLa या Hep56.1D के साथ कोशिकाओं के दाग CellTracker ग्रीन CMFDA, अलग) के साथ hCD81 कोशिकाओं.
- कोशिकाओं को एक बार और 1 मिनट के लिए 5 एमएल पीबीएस के साथ धो DMEM cplt मध्यम, 37 में 6 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 सेते हैं जोड़ने.
- बोने और दाग कोशिकाओं के अभिकर्मक की तैयारी के रूप में 6.2 वर्गों में ऊपर वर्णित है और हालांकि, एक कवर पर्ची जोड़नेबोने से पहले सेल संस्कृति पकवान.
- 30 घंटे के बाद अभिकर्मक, कोशिकाओं ध्यान से 1 मिनट के लिए पीबीएस की 1 एमएल के साथ धोने और फिर 3% पीएफए के 250 μL के साथ आर टी पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं तय है. कोशिकाओं को एक बार में 1 मिनट के लिए धो 1 एमएल पीबीएस के साथ, 1 मिनट के लिए DAPI साथ दाग 4.6 खंड में वर्णित के रूप में 1 मिनट के लिए 1 एमएल पीबीएस के साथ एक बार धोना, एच 2 हे और माउंट कवर निकल जाता है के साथ गिलास स्लाइड पर धो दोहराना (खंड 4.7 देखें ). एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ कोशिकाओं का विश्लेषण.
| प्रजाति | सेल लाइन | मूल | विकास मध्यम और चयन |
| मानव | हं - 7.5 | हं-7 hepatoma सेल 17 लाइन की subclone | DMEM cplt |
| हुह 7.5 [CE1] [E2p7NS2] | इस stably वायरल प्रोटीन कोर व्यक्त, E1, E2, p7, और NS2, lentiviral जीन टी द्वारा transducedदो स्वतंत्र जीन कैसेट की ransfer | DMEM cplt + Blasticidin 5 μg / एमएल | |
| हुह-7 Lunet एन | हं-7 hepatoma सेल लाइन 9 की subclone | DMEM cplt | |
| HeLa | सरवाइकल ग्रंथिकर्कटता सेल लाइन (ATCC संख्या: सीसीएल 2) | DMEM cplt | |
| HeLa [CE1] [E2p7NS2] | इस stably वायरल प्रोटीन कोर व्यक्त, E1, E2, p7, और NS2, दो स्वतंत्र जीन कैसेट की lentiviral जीन स्थानांतरण द्वारा transduced | DMEM cplt 750 / μg एमएल G418, Blasticidin 5 μg / एमएल | |
| माउस | Hep56.1D | प्राथमिक hepatocellular कार्सिनोमा (जे Encke की तरह उपहार) वयस्क C57BL/6J चूहों | DMEM cplt |
| Hep56.1D [CE1] [E2p7NS2] | Stably पूर्ववायरल प्रोटीन कोर दबाव, E1, E2, p7, और NS2, दो स्वतंत्र जीन कैसेट की lentiviral जीन स्थानांतरण द्वारा transduced | DMEM cplt 750 / μg एमएल G418, Blasticidin 5 μg / एमएल | |
| Hep56.1D hCD81 | Stably व्यक्त मानव CD81 lentiviral जीन स्थानांतरण द्वारा transduced | DMEM cplt + Blasticidin 5 μg / एमएल |
पूरा G418:: geneticin ज मानव इस्तेमाल किया सेल Cplt लाइनों के मूल और संस्कृति की हालत के बारे में निर्दिष्टीकरण तालिका 1.
9. प्रतिनिधि परिणाम
इस अध्ययन में, हम लागू दैहिक सेल संलयन की दो अलग अलग तरीकों कि हमें विशेष रूप से heterokaryons में HCV प्रतिकृति चक्र के पूरा होने पर प्रतिबंध कारकों के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुमति देते हैं. नोट के अलावा, पार complementation के दो विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के विलय पर सशर्त डिजाइन कि भरोसा दिलाते(2 दृष्टिकोण) मानव जिगर की कोशिकाओं और गैर-अनुमोदक सेल लाइनों, वायरस विधानसभा (1 दृष्टिकोण) या वायरस के प्रवेश और पूर्ण HCV प्रतिकृति चक्र के बीच सच heterokaryons में ही पूरा कर रहे हैं.
पहले दृष्टिकोण में हं 7.5 कोशिकाओं, अत्यधिक HCV के लिए अनुमोदक, transiently एक subgenomic luciferase transgene और HCV गैर संरचनात्मक प्रोटीन subgenomic HCV शाही सेना प्रतिकृति (हुह 7.5 replicon सेल) का समर्थन व्यक्त replicon के साथ ट्रांसफ़ेक्ट गया. इन कोशिकाओं को सह - सुसंस्कृत और HCV के संरचनात्मक प्रोटीन कोर व्यक्त, E1, E2, के रूप में अच्छी तरह से गौण प्रोटीन P7, और NS2 सेल लाइनों के लिए जुड़े हुए थे. Figure1A प्रयोगात्मक प्रक्रिया के एक सिंहावलोकन से पता चलता है. महत्वपूर्ण बात है, खूंटी संलयन के बाद, सभी कण विधानसभा के लिए प्रोटीन की आवश्यकता है जो व्यक्ति वायरल प्रोटीन के खिलाफ immunofluorescence द्वारा पुष्टि की जा सकती गठन heterokaryon में मौजूद होना चाहिए. चित्रा 1 बी एक अनुकरणीय संलयन घटना है जो में दोनों NS5A के लिए संकेत हं 7.5 replicon कोशिकाओं और E2 में व्यक्त दर्शाया गया हैहं - 7.5 में व्यक्त CE1] [E2p7NS2] पैकेजिंग कोशिकाओं खूंटी प्रेरित heterokaryon गठन पर एक ही cytoplasm में पाया गया. जब सह संवर्धित कोशिकाओं के बजाय पीबीएस के साथ इलाज किया गया, कोई संलयन इस प्रकार प्रेरित किया गया था केवल एक सकारात्मक कोशिकाओं और नहीं सह स्थानीयकरण संकेतों के मनाया गया. इसके अलावा, transgene अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए, हम मूल और E2 (पहले 15 विस्तार से रिपोर्ट) के लिए विशिष्ट ELISAs प्रदर्शन किया. नियंत्रण पैकेजिंग सेल लाइन के अलावा हं 7.5 [CE1] [E2p7NS2], हम HELA और मानव गैर - जिगर और माउस जिगर की कोशिकाओं के लिए प्रतिनिधि, क्रमशः के रूप Hep56.1D पैकेजिंग कोशिकाओं उत्पन्न. इन उत्तरार्द्ध कोशिकाओं में HCV शाही सेना प्रतिकृति दक्षता कम और HCV के विधानसभा और रिहाई दिखाया नहीं किया गया है. चित्रा 1C संलयन परख के परिणाम दिखाता है. Supernatants सह संस्कृति से 48 घंटे के बाद संलयन प्रेरण में एकत्र किए गए थे और बाद luciferase assays के लिए भोले हं 7.5 कोशिकाओं को टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया. विशेष रूप से, हुह 7.5 replicon कोशिकाओं जब दोनों के साथ जुड़े हुए थेभोले सेल लाइनों या नियंत्रण के रूप में पीबीएस के साथ इलाज किया, कोई संक्रामकता संस्कृति तरल पदार्थ में पाया गया था. हालांकि, जब हं 7.5 replicon और पैकेजिंग सेल लाइनों के बीच सेल संलयन खूंटी द्वारा प्रेरित किया गया था, replicon और रचनात्मक रूप में व्यक्त संरचनात्मक प्रोटीन के बीच के पार complementation परिणामस्वरूप heterokaryons में वायरस उत्पादन बचाया और संक्रामक वायरल कणों संस्कृति तरल पदार्थ में जारी किए गए. इसलिए हम निष्कर्ष निकाला है कि वायरस उत्पादन और पैकेजिंग सेल लाइनों में वायरल प्रोटीन की सेल संलयन अभिव्यक्ति की आवश्यकता है. Strikingly, न केवल हं 7.5 मानव hepatoma कोशिकाओं की heterokaryons, लेकिन यह भी मानव गैर - जिगर (HeLa [CE1] [E2p7NS2]) जिगर माउस और (Hep56.1D [CE1] [E2p7NS2]) कोशिकाओं की अनुमति दी वायरस रिलीज के साथ heterokaryons यह दर्शाता है कि विधानसभा और रिलीज के प्रबल रूप से प्रतिबंध के इन प्रकार की कोशिकाओं में संभव कारकों से नहीं हिचकते हैं. Frentzen पैकेजिंग सेल लाइनों और लक्ष्य कोशिकाओं में प्रामाणिक प्रविष्टि में संरचनात्मक प्रोटीन की अभिव्यक्ति में दिखाया गया था
सेल प्रवेश, आरएनए अनुवाद और शाही सेना प्रतिकृति प्रतिकृति चक्र के चरणों को प्रभावित करने के लिए संभव प्रतिबंध का विश्लेषण करने के लिए और बाहर है कि ट्रांसफ़ेक्ट हं 7.5 replicon कोशिकाओं में एक उच्च वायरल भार संतृप्ति द्वारा प्रतिबंध कारकों का पता लगाने छीन सेल संलयन का एक वैकल्पिक तरीका इस्तेमाल किया गया था. यह अंत करने के लिए, हम HCVcc का पता लगाने और नए सिरे से इन कोशिकाओं में वायरस उत्पादन के साथ heterokaryons की टीका के आधार पर एक स्वतंत्र परख विकसित किया है. चित्र 2A में उल्लिखित है, दैहिक सेल संलयन सह कक्षों की खेती के बाद एक fusogenic ग्लाइकोप्रोटीन की अभिव्यक्ति के द्वारा प्रेरित किया गया था. इस विधि क्योंकि संवेदनशीलता की संभावना, संलयन दक्षता में वृद्धि के कारण बढ़ा दिया गया था चुना गया था. Heterokaryons CellTracker सह खेती पहले रंग के साथ अलग सेल लाइनों धुंधला द्वारा देखे थे. Cytoplasm के भीतर homogenously वितरित रंगों के साथ एक heterokaryon इंगित करता है दो प्रकार की कोशिकाओं के विलय के रूप में संकेत मिलता हैघ में चित्रा 2B. Lunet N HELA कोशिकाओं है या Hep56.1D hCD81 कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं के heterokaryons में ही सभी HCV प्रविष्टि कारकों व्यक्त कर रहे हैं इस प्रकार चुनिंदा HCV सेल प्रविष्टि के लिए अतिसंवेदनशील heterokaryons प्रतिपादन. HCVcc साथ चैलेंज heterokaryons जो परख (चित्रा -2) की पृष्ठभूमि के ऊपर लगभग 10 गुना संक्रामक वायरल संतान के डी Novo की उत्पादन से स्पष्ट है में HCV की पूरी प्रतिकृति में हुई. एक नियंत्रण के रूप में, Lunet एन कोशिकाओं Lunet एन कोशिकाओं के साथ जुड़े हुए थे. महत्वपूर्ण बात सीमा का पता लगाने के लिए संक्रामक HCV पास के ही बहुत कम स्तर पर मनाया गया. इसी तरह के परिणाम प्राप्त किया गया जब Lunet एन कोशिकाओं के भोले Hep56.1D कोशिकाओं के साथ जुड़े हुए थे. दोनों ही मामलों में, मानव CD81 अनुपस्थित था इतना है कि HCV उत्पादकता heterokaryons नहीं संक्रमित कर सकता है. यह बहुत से कम उत्तरार्द्ध इन दो मामलों में पाया संक्रामकता संभावना Lunet एन कोशिकाओं और / या अवशिष्ट inoculum से संक्रामक वायरस इनपुट के निम्न स्तर के संक्रमण का स्तर कम करने के लिए attributable है. इसके विपरीत HELA कोशिकाओं औरp56.1D hCD81 कोशिकाओं CD81 मानव व्यक्त, इस प्रकार heterokaryons में कमी सेल प्रवेश कारक पूरक और HCV सेल प्रवेश की अनुमति है. संक्रामक HCV के 10 गुना वृद्धि हुई स्तर पर इन दो सेल लाइनों को शामिल heterokaryons के माध्यम में पाया इसलिए संभावना heterokaryons में संक्रामक कणों के डी Novo उत्पादन को दर्शाता है. इस प्रकार, हम निष्कर्ष निकाला है कि HCV प्रतिकृति चक्र के पूरा होने की प्रमुख इन सेल लाइनों में HCV प्रतिबंध कारकों की अभिव्यक्ति को छोड़कर सीमित नहीं है.
चित्रा 1 ट्रांस - complementation HCV के विधानसभा और heterokaryons में रिलीज की. (ए) खूंटी की मध्यस्थता सेल संलयन की प्रयोगात्मक प्रक्रिया के योजनाबद्ध रूपरेखा. JFH1 luciferase संवाददाता replicon ल्यूक-NS3 - 5B भोले हं 7.5 कोशिकाओं में electroporation द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था. अगले दिन, कोशिकाओं को अलग किया गया और भोले कोशिकाओं या पैकेजिंग के साथ सह सुसंस्कृत अनिवार्यता से HCV के कोर, E1, E2, p7 और NS2 व्यक्त कोशिकाओं. 24 घंटे के बाद सह - खेती, heterokaryon गठन नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पीबीएस का उपयोग कर 40% खूंटी के साथ उपचार से प्रेरित किया गया था. 48 के बाद घंटे, सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला भोले हं 7.5 कोशिकाओं टीका लगाना काटा गया था. इस संक्रामकता luciferase गतिविधि के द्वारा निर्धारित किया गया था. (बी), heterokaryons का पता लगाने के लिए कोशिकाओं E2 और NS5A के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग immunostained गया. कोशिकाओं के भीतर दोनों प्रोटीन के साथ - साथ अभिव्यक्ति सेल संलयन का संकेत है. (सी) luciferase माप वायरल heterokaryons से उत्पादित संक्रामकता यों प्रदर्शन किया गया. तीन स्वतंत्र और प्रयोगों का मतलब है की मानक विचलन की मीन मूल्यों को दिया जाता है. क्षैतिज पट्टी है पृष्ठभूमि असंक्रमित हं 7.5 कोशिकाओं में निर्धारित RLU का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
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चित्रा 2. Heterokaryons की टीका के बाद HCV प्रतिकृति चक्र के समापन (ए) प्रयोगात्मक प्रक्रिया के योजनाबद्ध सिंहावलोकन. हुह-7 Lunet एन CD81 कमी कोशिकाओं संकेत सेल लाइनों की कमी या CD81 मानव व्यक्त के साथ सह सुसंस्कृत थे. महत्वपूर्ण बात, इन बाद कोशिकाओं को कम से कम HCV प्रविष्टि कारक की कमी है और इसलिए उत्पादकता संक्रमित नहीं किया जा सकता है. अगले दिन, संलयन एक fusogenic PFV से वायरल लिफाफा प्रोटीन का अभिकर्मक के द्वारा शुरू किया गया था. तीस घंटे बाद, कोशिकाओं के संक्रामक HCV के कणों के साथ चुनौती दी थी. सेल प्रविष्टि, शाही सेना प्रतिकृति और वायरस इन heterokaryons द्वारा निरंतर उत्पादन को मापने के लिए, सेल से मुक्त संस्कृति के तरल पदार्थ में जारी संक्रामकता 48 घंटे के बाद टीका निर्धारित किया गया था. यह अंत करने के लिए, भोले हं 7.5 कोशिकाओं के एक सीमित कमजोर पड़ने परख (50 TCID) में लक्षित कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया. (बी), heterokaryons का पता लगाने के लिए कोशिकाओं CellTracker ग्रीन या CellTracker ऑरेंज घंटे 6 के साथ दाग रहे थे सह cultiv पहलेव्यावहारिक और अभिकर्मक. तीस घंटे बाद, कोशिकाओं और तय DAPI के साथ दाग थे. (सी) Lunet एन कोशिकाओं HELA कोशिकाओं, भोले Hep56.1D या Hep56.1D मानव CD81 व्यक्त कोशिकाओं से जुड़े हुए थे. इन संस्कृतियों HCVcc 2.3 MOI के साथ inoculated थे. संस्कृति तरल पदार्थ के 48 घंटे बाद एकत्र किए गए थे और heterokaryons से नए सिरे से कण रिलीज 50 TCID द्वारा निर्धारित किया गया था भोले हं 7.5 लक्ष्य कोशिकाओं का उपयोग कर. तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मीन मूल्यों को दिया जाता है. क्षैतिज बार परख का पता लगाने सीमा का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
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Discussion
हम दो तरीकों प्रमुख नकारात्मक प्रतिबंध है कि HCV प्रतिकृति छीन के विश्लेषण के लिए संवर्धित कोशिकाओं heterokaryon गठन प्रेरित उपस्थित थे. इन प्रक्रियाओं का प्रयोग हम विभिन्न मानव गैर - जिगर और murine जिगर सेल लाइनों में एक प्रमुख रचनात्मक रूप में व्यक्त या वायरस प्रेरित कारक की उपस्थिति को बाहर. पहली परख मुख्य रूप से विश्लेषण अगर प्रतिबंध कारकों HCV और संक्रामक संतान की विधानसभा रिलीज को रोकने. चूंकि इस मामले में पैकेजिंग की कोशिकाओं HCV के replicon कोशिकाओं में जुड़े हुए हैं, संभव प्रतिबंध पैकेजिंग कोशिकाओं में व्यक्त कारकों केवल कि पहले से ही वायरल शाही सेना के एक उच्च लोड कोशिकाओं के cytoplasm के लिए उपयोग मिलता है. इसलिए, वायरल शाही सेना का अनुवाद पूरा हो गया है और कई उत्पादक HCV प्रतिकृति परिसरों की स्थापना की गई है, इस प्रकार HCV के अनुवाद और शाही सेना प्रतिकृति के संभावित प्रतिबंध का पता लगाने की संभावना को कम करने. वास्तव में, इन कोशिकाओं में replicon शाही सेना के उच्च लोड उनकी पहचान और छीन सकताभी HCV के विधानसभा और या वायरल कारकों से संतृप्ति के कारण रिलीज / प्रतिबंध कारकों का पता लगाने में बाधा हो सकती है. इस सीमा को दरकिनार करने के लिए, हम एक दूसरे के पार complementation परख जहां HCV सेल प्रवेश केवल heterokaryons में हासिल की है विकसित. नतीजतन, यह अधिक प्राकृतिक सेटिंग में, वायरस प्रतिकृति और संक्रामक संतान के बाद उत्पादन शुरू है और इस प्रकार heterokaryons में आय वायरल प्रतिकृति मशीनरी को उजागर सभी संभव प्रतिबंध तंत्र जुड़े कोशिकाओं के भीतर व्यक्त करने के लिए सीधे. जब से हम इस प्रणाली में संक्रामक कणों के डी Novo उत्पादन मनाया, हम परीक्षण सेल लाइनों का कोई भी निष्कर्ष HCV एक सेल प्रवेश, आरएनए अनुवाद, शाही सेना प्रतिकृति या वायरस विधानसभा और रिहाई की प्रमुख प्रतिबंध कारकों को व्यक्त करता है. विशेष रूप से, वायरल दोनों तरीकों में हासिल titers कारकों में से एक सेट पर निर्भर करते हैं. पहले, पैकेजिंग कोशिकाओं में transgene अभिव्यक्ति विभिन्न सेल लाइनों के बीच भिन्न हो और ट्रांस को प्रभावित कर सकता है हो सकता है- Complementation. Frentzen एट अल. अनुपूरक सामग्री में दिखाया गया, transgene अभिव्यक्ति के लिए संदर्भ मापदंड के विशिष्ट कोर और E2 ELISAs और संलयन दक्षता का निर्धारण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, सेल आकार, घनत्व, विकास दर और फ्यूज प्रवृत्ति heterokaryon गठन को प्रभावित कर सकता है. नतीजतन, सावधानी जब व्यक्ति heterokaryons के बीच वायरस उत्पादन की क्षमता की तुलना warranted है.
यह बहुत प्राथमिक माउस कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा, हालांकि, प्रयोगात्मक स्थापना की एक सीमा है कि इन कोशिकाओं transduce मुश्किल होगा और अन्य कोशिकाओं के साथ फ्यूज करने की क्षमता शायद ही उम्मीद के मुताबिक है. हालांकि, इस के लिए विशेष रूप से प्राथमिक कोशिकाओं के हर प्रकार के लिए परीक्षण किया जाना है. प्रजाति विशेष के प्रतिबंध कारकों की पहचान करने के लिए वैकल्पिक इंटरफेरॉन प्रेरित माउस जिगर की कोशिकाओं के एक सीडीएनए बैंक में परिचय हो सकता है. इन पहलुओं को पहले से ही PLoS रोगज़नक़ों कागज में किया गया है बड़े पैमाने पर चर्चाद्वारा Frentzen एट अल 15.
संभावित प्रतिबंध कारकों हम murine - IFN - α के साथ सह खेती और हं 7.5 replicon कोशिकाओं के साथ विलय से पहले Hep56.1D पैकेजिंग कोशिकाओं का इलाज खोजने के दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए. हम संक्रामकता की कमी सुझाव है कि IFN-upregulated माउस कोशिकाओं में जीन विधानसभा प्रतिबंधित सकता है और प्रदर्शन है कि संभावित antiviral कारकों इस परख के साथ पता लगाया जा सकता है मनाया.
इस अध्ययन में वर्णित प्रणाली मानव और गैर मानव कोशिका लाइनों या HCV प्रतिकृति चक्र के प्रतिबंध के लिए प्राथमिक कोशिकाओं की एक बड़ी पैनल स्क्रीन के लिए उपयोगी हो जाएगा. भविष्य में, इस तरह के अध्ययन और उपन्यास antiviral प्रतिबंध तंत्र की पहचान लक्षण वर्णन करने के लिए योगदान कर सके.
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Disclosures
टी.पी. Biotest से शुल्क परामर्श प्राप्त किया.
Acknowledgments
हम Takaji Wakita और JFH1 और J6CF आइसोलेट्स के लिए जेन्स Bukh, क्रमशः के लिए आभारी हैं. इसके अलावा हम चार्ल्स चावल हं 7.5 कोशिकाओं के लिए और 9E10 प्रतिरक्षी, E2 विशिष्ट एंटीबॉडी CBH-23 के लिए स्टीवन Foung, और उपयोगी सुझाव और विचार विमर्श के लिए Twincore प्रायोगिक विषाणु विज्ञान विभाग के सभी सदस्यों का धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 | |
| L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 | |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 | |
| α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | ||
| ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 | |
| Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G | |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 | |
| G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 | |
| Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 | |
| Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 | |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 | |
| Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL | |
| α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | ||
| DAPI (4',6'- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Alexa-Fluor 546 - goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 | |
| Alexa-Fluor 488 - goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 | |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 | |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML | |
| All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | ||
| Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |
References
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