Summary
Vi beskriver to metoder for betinget
Abstract
Hepatitt C virus (HCV) er en hepatotropic virus med en host-range begrenset til mennesker og sjimpanser. Selv om HCV RNA replikasjon har blitt observert i humane ikke-hepatiske og murine cellelinjer, var effektiviteten svært lav og nødvendige langsiktige valg prosedyrer ved hjelp HCV replikonet konstruerer uttrykke dominerende antibiotika-valgbare markører 1-5. HCV in vitro forskning er derfor begrenset til menneskelige hepatoma cellelinjer ettergivende for virus oppføring og ferdigstillelse av viral livssyklus. Grunnet HCVs smal arter tropisme, er det ingen immunkompetente liten dyremodell tilgjengelig som opprettholder hele HCV replikering syklus 6-8. Ineffektiv replikering av HCV i ikke-menneskelige celler f.eks av mus opprinnelse er sannsynligvis på grunn av manglende genetisk uforlikelighet av essensielle vert avhengighet faktorer og / eller uttrykket av restriksjonsenzymer faktorer.
Vi undersøkte om HCV forplantning undertrykt av dominerende begrensning factors i enten humane cellelinjer avledet fra ikke-hepatiske vev eller i mus lever cellelinjer. For dette formålet har vi utviklet to uavhengige betingede trans-complementation metoder baserer seg på somatisk celle fusjon. I begge tilfeller er fullføring av virusreplikasjon syklusen bare mulig i heterokaryons. Følgelig indikerer vellykket trans-complementation, som bestemmes ved å måle de novo produksjon av smittsom viral avkom, fravær av dominerende restriksjoner.
Spesielt ble subgenomic HCV replikon bærer en luciferase transgenet tilført i svært ettergivende humane hepatoma celler (Huh-7.5 celler). Senere ble disse cellene samtidig kultivert og smeltet sammen til ulike menneskelige og murine celler uttrykker HCV strukturelle proteiner kjerne, konvolutt 1 og 2 (E1, E2) og tilbehør proteiner P7 og ns2. Forutsatt at cellen fusjon ble initiert av behandling med polyetylen-glykol (PEG), utgitt kulturen smittsom viral particles som smittet naive celler i en reseptor-avhengig måte.
For å vurdere påvirkning av dominerende restriksjoner på hele viral livssyklus inkludert celleoppføring, RNA oversettelse, replikering og virus montering, tok vi fordel av et menneske lever cellelinje (Huh-7 Lunet N celler 9) som mangler endogene uttrykk av CD81, en vesentlig faktor oppføring av HCV. I fravær av ectopically uttrykte CD81, disse cellene er i hovedsak ildfast til HCV smitte 10. Viktigere, ved samtidig kultivert og smeltet sammen med celler som uttrykker menneskelig CD81 men mangel på minst en annen viktig celleoppføring faktor (dvs. SR-BI, CLDN1, OCLN), bare de resulterende heterokaryons vise komplett sett av HCV oppføring faktorer nødvendige for infeksjon. Derfor, for å analysere om dominerende restriksjoner faktorer undertrykke ferdigstillelse av HCV replikering syklusen, smeltet vi Lunet N celler med ulike celler fra mennesker og mus opprinnelse som oppfyller ovennevnte critEria. Når co-dyrkede celler ble tilført med en svært fusogenic viruskapselen protein mutant av prototypen skummende virus (PFV 11) og deretter utfordret med smittsomme HCV partikler (HCVcc), ble de novo produksjon av smittsomme virus observert. Dette indikerer at HCV fullført sin replikering syklus i heterokaryons dermed utelukker uttrykk for dominerende restriksjoner faktorer i disse cellelinjer. Disse romanen betingede trans-complementation metoder vil være nyttig for å skjerme en stor panel av cellelinjer og primære celler for uttrykk av HCV-spesifikke dominerende restriksjoner faktorer.
Protocol
Cell Fusion av PEG
1. Cell Culture
- Kultur Huh-7.5, Helà og Hep56.1D naive eller emballasjen cellelinjer 12 på 15 cm cellekultur retter i DMEM komplett (DMEM cplt) medium, supplert DMEM med 2 mm L-glutamin, 1x ikke-essensielle aminosyrer, 100 U / mL penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin, og 10% kalvefoster serum. Bruk passende valg til stabile cellelinjer som angitt i tabell 1.
2. Transfeksjon av HCV RNA
- Vask Huh-7.5 celler (en konfluent 15 cm rett) to ganger med Fosfatbufret saltvann (PBS), trypsinize, og resuspender i en konsentrasjon på 1.5x10 7 celler / ml i Cytomix (120 mM KCl, 0,15 mm 2 CaCl, 10 mM K 2 HPO 4 [pH 7,6], 25 mm HEPES, 2 mm EGTA, 5 mm 2 MgCl, justert til pH 7,6 med KOH og steriliseres ved filtrering) som inneholder 2 mM ATP og 5 mm glutation.
- Transfektere via electroporation 400 mL av cellesuspensjon (6x10 6 celler) med 10 mikrogram HCV RNA (pFKi389Luc-EI/NS3-3 '_JFH1_dg 13) bruker kyvetter med et gap bredde på 0,4 cm og en Gene pulser XCell system (Biorad) satt til 975 μF og 270 V som beskrevet tidligere 14.
- Umiddelbart overføre transfekterte Huh-7.5 cellene til 10 ml DMEM cplt medium og frø hele suspensjonen til en enkelt kultur fat med 10 cm diameter. Kultur celler for 24 timer ved 37 ° C og 5% CO 2.
3. Induksjon av Fusion av PEG
- Harvests celler som beskrevet i 2.1, resuspender i DMEM cplt medium og fortynn til 5x10 5 celler / ml.
- Generer encellede suspensjoner av Huh-7.5, Helà og Hep56.1D emballasje celler, og fortynn til 5x10 5 celler / ml, 2x10 5 celler / ml, og 2x10 5 celler / ml, henholdsvis. Merk at emballasje celler ectopically ekspress HCV proteiner kjernen, E1, E2, P7 og ns2 etter transduksjon med to iavhengige lentiviral vektorer transducing en C-E1 og E2-P7-ns2 uttrykk kassett, henholdsvis 13, 15.
- Forbered seks-brønns kultur plater med 2-3 sterile glasslokk slips per brønn for videre analyse av fusjon effektivitet.
- Kombiner en mL transfekterte Huh-7.5 celler huser den subgenomic replikonet med 1 ml emballasje celler, seedet inn i en brønn av en seks-brønns plate, og inkuber i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO 2.
- På dette tidspunkt bør celle tetthet varierer mellom 60-80% confluency før innledning av celle fusjon for å tillate celler til å være i nærheten for cellemembraner til sikring.
- Sug medium fra co-dyrkede celler og vaske en gang med 1 mL PBS, deretter tilsett forsiktig 500 mL av forvarmes 40% PEG-1500 eller PBS som kontroll og inkuber i 5 min ved 37 ° C for å indusere heterokaryon formasjon.
- Aspirer PEG og nøye vask 3-5 ganger for 1 minutt (min) per vask med 2 mL PBS for å fjerne overflødig PEG og til slutt legge til 2mL DMEM cplt medium til hver brønn og inkuber ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Førtiåtte timer etter fusion, samle hver supernatanten og filteret gjennom en 0,45 mikrometer filter.
- Mål produksjon av smittsomme partikler i smeltet heterokaryons ved poding av naive Huh-7.5 celler (8x10 4 celler / brønn seeded i en 12-brønns plate, 24 timer før inokulasjon) med 500 mL av celle-fri kultur væske og påfølgende fastsettelse av luciferase aktivitet 14.
4. Immunfluorescens til Bestem Fusion Effektivitet
- Etter å ha samlet cellekultur supernatants (§ 3.8), vaske brønner inneholder glassdeksel glipper en gang med 1 mL PBS i 1 min. Alle følgende trinn skal utføres ved romtemperatur (RT) og vasking bør gjøres med 1 mL PBS i 1 min per vask.
- Fiks celler med 600 mL av 3% paraformaldehyde (PFA) i PBS for 15 min og deretter vaske 3x med PBS. Nøye overføre dekker slipsinn i en 24-brønns plate ved hjelp av tang.
- Permeabilize celler med 500 mL av 0,5% Triton X-100 i PBS i 5 min og deretter vaske 3x med PBS.
- Forbered primære antistoff løsning i PBS supplert med 5% geit serum. Bruk anti-NS5A antistoff (9E10) i en konsentrasjon på 0,5 mg / ml og humant monoklonalt anti-E2 antistoff (CBH-23) i en konsentrasjon på 6,4 ng / ml. Påfør 250 mL til hver brønn og inkuberes ved romtemperatur i 45 min.
- Vask 3x med PBS og oppdage bundet primære antistoffer med 250 mL sekundære geit anti-mus eller geit anti-human IgG-antistoffer konjugert til Alexa-Fluor 546 eller Alexa-Fluor 488, ved en konsentrasjon på 2 mg / ml i PBS supplert med 5% geit serum. Inkuber i 30 min ved RT i mørket.
- Deretter vasker 1x med PBS og senere beis cellekjerner med 250 mL DAPI (4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) fortynnes 1:3,000 i PBS, inkuberes i 1 min ved RT i mørket.
- Vask 4x med PBS og 1x med H 2
Fusion av forbigående transfeksjon av prototype skummende virus (PFV) glykoprotein
5. Utarbeidelse av Viral podestoff
- Lag en høy titer virus lager av transfecting in vitro transkribert HCV RNA til Huh-7.5 celler og høsting cellekultur supernatanten etter 48 timer og 72 timer som beskrevet tidligere 14. Bestem viral titer ved å begrense fortynning analysen (TCID 50) 13.
6. Cellekultur, Cell Fusion ved transfeksjon av en Fusogenic PFV Glykoprotein
- Kultur Lunet N, HelÃ, og Hep56.1D hCD81 celler i henhold til instruksjonene i Tabell 1 i DMEM cplt medium med passende valg.
- Koble celler som beskrevet i 2.1, forberede encellete suspensjoner i DMEM cplt medium, og co-dyrke Lunet N celler med Jakten eller Hep56.1D hCD81 cellelinjer på passende forhold (f.eks 01:02 til Hep56.1D hCD81 eller 1:1 for Jakten celler) og ga en total celle tetthet av 1.5x10 5 celler per 12-brønn og inkuberes i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Den neste dagen, forbigående transfektere celler med svært fusogenic PFV konvolutt protein (pczHFVenvEM066 16) ved hjelp Lipofectamine 2000 i henhold til produsentens anvisninger.
7. Infeksjon Assay
- Inokuler heterokaryons 30 timer etter transfeksjon med 350 mL av virus lager (MOI av ~ 2,3) i 12 timer natten, vask straks med PBS og tilsett 1 mL DMEM cplt medium per brønn. Inkuber i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Innhøsting supernatanten av heterokaryon kultur, filter gjennom en 0,45 mikrometer filter og vaksinere Huh-7.5 celler, seeded i 96-brønners plater (1x10 4 celler / brønn) dagen før, i en begrensende utvanning analysen
- Etter 72 h, beis infiserte Huh-7.5 celler med en HCV-spesifikt antistoff (NS5A, 9E10) for å kvantifisere produksjon av smittsomme avkom partikler.
8. Visualisering av Cell Fusion
- For å visualisere fusion events, forberede 5 til 10 mm løsninger CellTracker fargestoffer i DMEM medium uten tilsetningsstoffer og fullføre trinnene nedenfor 6 timer før co-kulturen (beskrevet i pkt. 6.2 og 6.3).
- Vask heftende celler gang med 5 mL PBS og deretter inkuber celler med 4 mL farging løsning per 10 cm parabol for 45 min ved 37 ° C og 5% CO 2 (flekken Lunet N celler med CellTracker Orange CMTMR og Jakten eller Hep56.1D hCD81 celler med CellTracker Grønn CMFDA, separat).
- Vask celler gang med 5 mL PBS i 1 min og legg DMEM cplt medium, inkuberes i 6 timer ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Forbered seeding og transfeksjon av fargede celler som beskrevet ovenfor i pkt. 6.2 og likevel legge til et dekkglass tilcellekultur rett før såing.
- 30 timer etter transfeksjon, vaske cellene forsiktig med 1 mL PBS i 1 min og deretter fikse celler med 250 mL av 3% PFA for 15 min ved RT. Vask celler gang med 1 mL PBS i 1 min, beis med DAPI for 1 min som beskrevet i pkt. 4.6, vask straks med 1 mL PBS i 1 min, gjenta vaske med H 2 O og montere dekker sklir på glassplater (se pkt. 4.7 ). Analyser celler med en fluorescens mikroskop.
| Arter | Cellelinje | Origin | Vekst medium og utvalg |
| Menneskelig | Huh-7.5 | Subclone av Huh-7 hepatoma cellelinje 17 | DMEM cplt |
| Huh-7.5 [CE1] [E2p7NS2] | Stabilt uttrykke viral proteiner kjerne, transduced E1, E2, P7, og ns2, ved lentiviral genet transfer av to uavhengige genet kassetter | DMEM cplt + Blasticidin 5 mikrogram / ml | |
| Huh-7 Lunet N | Subclone av Huh-7 hepatoma cellelinje 9 | DMEM cplt | |
| Jakten | Cervikal adenokarsinom cellelinje (ATCC nummer: CCL-2) | DMEM cplt | |
| Jakten [CE1] [E2p7NS2] | Stabilt uttrykke viral proteiner kjerne, transduced E1, E2, P7, og ns2, ved lentiviral genoverføring av to uavhengige genet kassetter | DMEM cplt + G418 750 mikrogram / ml; Blasticidin 5 mikrogram / ml | |
| Mus | Hep56.1D | Primær hepatocellulær karsinom (slags gave av J. Encke) Voksen C57BL/6J mus | DMEM cplt |
| Hep56.1D [CE1] [E2p7NS2] | Stabilt extrykke viral proteiner kjerne, transduced E1, E2, P7, og ns2, ved lentiviral genoverføring av to uavhengige genet kassetter | DMEM cplt + G418 750 mikrogram / ml; Blasticidin 5 mikrogram / ml | |
| Hep56.1D hCD81 | Stabilt uttrykke menneskelige CD81 transduced ved lentiviral genoverføring | DMEM cplt + Blasticidin 5 mikrogram / ml |
. Tabell 1 Spesifikasjoner om opprinnelse og kultur tilstand av brukte cellelinjer Cplt: komplett, G418: geneticin, H: menneskelig.
9. Representative Resultater
I denne studien, søkte vi to forskjellige metoder for somatisk celle fusjon som tillater oss å spesifikt undersøke virkningen av restriksjoner faktorer på ferdigstillelse av HCV replikering syklusen i heterokaryons. Av notatet, forsikrer den betingede utformingen av trans-complementation ved fusjon av de to ulike celletypene sombare i ekte heterokaryons mellom menneskelige leverceller og ikke-ettergivende cellelinjer, virus montering (tilnærming 1) eller virus oppføring og full HCV replikering syklus (tilnærming 2) er oppnådd.
I den første tilnærmingen Huh-7.5 celler, svært ettergivende for HCV, ble midlertidig tilført med en subgenomic replikonet uttrykker en luciferase transgenet og HCV ikke-strukturelle proteiner som støtter subgenomic HCV RNA replikering (Huh-7.5 replikonet celler). Disse cellene var co-kultiverte og smeltet sammen til cellelinjer som uttrykker HCV strukturelle proteiner kjerne, E1, E2, samt tilbehør proteiner P7, og ns2. Figure1A viser en oversikt over den eksperimentelle prosedyren. Viktigere, etter PEG fusion, bør alle proteiner som kreves for partikkel montering være til stede i dannet heterokaryon som kan bekreftes ved immunfluorescens mot enkelte virale proteiner. Figur 1B viser en eksemplarisk fusjon hendelse i hvilke signaler både NS5A uttrykt i Huh-7.5 replikonet celler og E2uttrykt i Huh-7.5 [CE1] [E2p7NS2] emballasje cellene ble oppdaget i samme cytoplasma ved PEG-indusert heterokaryon formasjon. Når co-dyrkede celler ble isteden behandlet med PBS, ble det ikke fusjon indusert dermed kun single-positive celler og ingen samlokalisering av signaler ble observert. Videre, for å kontrollere transgene uttrykk, utførte vi ELISAs spesifikke for kjerne og E2 (tidligere rapportert i detalj 15). I tillegg til kontroll emballasjen cellelinje Huh 7.5 [CE1] [E2p7NS2], genererte vi Jakten og Hep56.1D emballasje celler som representanter for menneskelig ikke-lever og mus leverceller, henholdsvis. HCV RNA replikasjon effektivitet i disse siste cellene er lav og HCV montering og utgivelsen har ikke blitt vist. Figur 1C illustrerer resultatene av sammensmeltingen analysen. Supernatants ble hentet fra co-kulturen på 48 timer etter fusjon induksjon og brukes til å vaksinere naive Huh-7.5 celler for påfølgende luciferase analyser. Spesielt ble da Huh-7.5 replikonet celler smeltet sammen med entennaive cellelinjer eller behandlet med PBS som kontroll, ble det ikke smittsomhet påvist i kulturen væsker. Men når cellen fusjon mellom Huh-7.5 replikonet og emballasje cellelinjer ble indusert av PEG, reddet trans-complementation mellom replikonet og konstitutivt uttrykt strukturelle proteiner virus produksjonen i de resulterende heterokaryons og smittsomme virale partikler ble sluppet inn i kulturen væsker. Vi konkluderte derfor at viruset produksjonen krevde celle fusjon og uttrykk av virale proteiner i emballasje cellelinjer. Påfallende, ikke bare heterokaryons av Huh-7.5 menneskelige hepatoma celler, men også heterokaryons med menneskelig non-leveren (Jakten [CE1] [E2p7NS2]) og mus lever (Hep56.1D [CE1] [E2p7NS2]) celler tillatt virus utgivelse, indikerer at montering og slipp ikke er dominant hemmet av mulige restriksjoner faktorer i disse celletypene. Uttrykk for strukturelle proteiner i emballasje cellelinjer og autentisk oppføring i målcellene ble vist i Frentzen
En alternativ metode for celle fusjon ble benyttet for å analysere mulige restriksjoner som påvirker celleoppføring, RNA oversettelse og RNA replikering stadier av replikering syklus og for å utelukke at en høy viral belastning i transfekterte Huh 7,5 replikonet celler ville utelukke påvisning av restriksjon faktorer ved metning. For dette formålet har vi utviklet en uavhengig analyse basert på inokulering av heterokaryons med HCVcc og påvisning av de novo virus produksjon i disse cellene. Som skissert i figur 2A, ble somatisk celle fusjon indusert av uttrykket av en fusogenic glykoprotein etter co-kultivering av cellene. Denne metoden ble valgt fordi sensitiviteten ble økt sannsynligvis på grunn av økt fusion effektivitet. Heterokaryons var visualisert ved farging separate cellelinjer med CellTracker fargestoffer før co-dyrking. En heterokaryon med homogent fordelt fargestoffer i cytoplasma indikerer fusjon av to celletyper som indikererd i figur 2B. Bare i heterokaryons av Lunet N celler med Jakten celler eller Hep56.1D hCD81 celler er alle HCV oppføring faktorer uttrykt dermed selektivt gjengi heterokaryons mottakelige for HCV celleoppføring. Utfordring med HCVcc resulterte i fullstendig replikering av HCV i heterokaryons som er tydelig fra de novo produksjon av smittsom viral avkom omtrent 10 ganger over bakgrunnen for analysen (Figur 2C). Som en kontroll ble Lunet N celler smeltet sammen med Lunet N celler. Viktigere bare svært lave nivåer av smittsomme HCV nær deteksjonsgrensen ble observert. Lignende resultater ble oppnådd da Lunet N celler ble smeltet sammen med naive Hep56.1D celler. I begge tilfeller var menneskelig CD81 fraværende, slik at HCV ikke kunne produktivt infisere heterokaryons. Denne svært lav smittsomhet påvist i disse to siste tilfellene skyldes trolig lavt nivå av smitte av Lunet N celler og / eller lave nivåer av rest smittsomme virus innspill fra podestoff. I kontrast Jakten celler og Hep56.1D hCD81 celler uttrykker menneskelig CD81, og dermed utfyller de mangler celleoppføring faktor i heterokaryons og tillater HCV celleoppføring. Den 10-ganger økt nivå av smittsom HCV oppdaget på mellomlang av heterokaryons involverer disse to cellelinjer derfor reflekterer sannsynligvis de novo produksjon av smittsomme partikler i heterokaryons. Dermed konkluderte vi med at ferdigstillelse av HCV replikering syklusen er ikke begrenset eksklusive uttrykk for dominerende HCV restriksjoner faktorer i disse cellelinjer.
Figur 1. Trans-complementation av HCV montering og slipp i heterokaryons. (A) Skjematisk oversikt over den eksperimentelle prosedyren av PEG-mediert celle fusjon. Den JFH1 luciferase reporter replikonet Luc-NS3-5B ble tilført inn naive Huh-7.5 celler ved electroporation. Dagen ble cellene frittliggende og co-kultiveres med naive celler eller emballasje celler constitutively uttrykker HCV kjerne, E1, E2, P7 og ns2. 24 timer etter co-dyrking, ble heterokaryon dannelse indusert ved behandling med 40% PEG bruke PBS som negativ kontroll. Etter 48 timers, ble celle-free supernatanten høstet til å vaksinere naive Huh-7.5 celler. Smittsomhet ble bestemt av luciferase aktivitet. (B) For påvisning av heterokaryons, ble cellene immunostained bruker monoklonale antistoffer mot E2 og NS5A. Samtidig uttrykk av både proteiner i celler er en indikasjon på celle fusjon. (C) luciferase Målingene ble utført for å kvantifisere viral smittsomhet produsert fra heterokaryons. Middelverdier av tre uavhengige eksperimenter og standardavvik av midlene er gitt. Den horisontale linjen representerer bakgrunnen RLU bestemmes i friske Huh-7.5 celler. Klikk her for å se større figur .
9/4029fig2.jpg "/>
Figur 2. Fullføring av HCV replikering syklus etter inokulering av heterokaryons. (A) Skjematisk oversikt over den eksperimentelle prosedyren. Huh-7 Lunet N celler mangler CD81 var co-kultiveres med de indikerte cellelinjene mangler eller uttrykke menneskelige CD81. Viktigere, disse siste cellene mangler minst én HCV oppføring faktor, og kan derfor ikke produktivt infisert. Dagen ble Fusion initiert av transfeksjon av en fusogenic viruskapselen protein fra PFV. Tretti timer senere, ble cellene utfordret med smittsomme HCV partikler. For å måle celleoppføring, RNA replikasjon og virus produksjonen opprettholdes av disse heterokaryons, ble utgitt smittsomhet i celle-frie kultur væsker bestemt 48 timer etter vaksinasjon. For dette formål, var naive Huh-7.5 celler brukt som målceller i en begrensende fortynning analysen (TCID 50). (B) For påvisning av heterokaryons, ble cellene farget med CellTracker Grønn eller CellTracker Orange 6 timer før co-Kulturplanterasjon og transfeksjon. Tretti timer senere, ble cellene fiksert og farget med DAPI. (C) Lunet N celler ble smeltet Jakten celler, naive Hep56.1D eller Hep56.1D cellene og uttrykke menneskelige CD81. Disse kulturene ble inokulert med HCVcc (MOI på 2,3). Kultur væsker ble samlet 48 h senere og de novo partikkel utslipp fra heterokaryons ble bestemt av TCID 50 via naive Huh-7.5 målceller. Middelverdier av tre uavhengige eksperimenter blir gitt. Den horisontale linjen representerer deteksjonsgrensen på analysen. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer to metoder for å indusere heterokaryon formasjon i dyrkede celler for analysen av dominerende negative restriksjoner som utelukker HCV replikering. Ved hjelp av disse prosedyrene ekskludert vi tilstedeværelsen av en dominerende constitutively uttrykt eller virus-indusert faktor i ulike menneskelige ikke-leveren og i murine lever cellelinjer. Den første analysen analyserer primært om restriksjoner faktorer forebygge HCV montering og frigjøring av smittsomme avkom. Siden i dette tilfellet emballasje cellene er smeltet til HCV replikonet celler, mulige restriksjoner faktorer uttrykt i emballasje cellene bare få tilgang til cytoplasma av celler som allerede har en høy belastning av virale RNA. Derfor har oversettelse av viral RNA er oppnådd og mange produktive HCV replikering komplekser har blitt etablert, og dermed redusere sjansene for å oppdage mulige restriksjoner av HCV oversettelse og RNA replikasjon. Faktisk kan den høye belastningen av replikonet RNA i disse cellene utelukker deres identifikasjon ogkan også hindre påvisning av restriksjon faktorer for HCV montering og / eller utslipp skyldes metning av viral faktorer. For å omgå denne begrensningen, utviklet vi en andre trans-complementation analysen der HCV celleoppføring oppnås bare i heterokaryons. Følgelig i denne mer naturlig setting, er virusreplikasjon og påfølgende produksjon av smittsom avkom startet og fortsetter i heterokaryons dermed utsette virusreplikasjon maskiner direkte til alle mulige restriksjoner mekanismer uttrykt i de sammenvokste cellene. Siden vi observerte de novo produksjon av smittsomme partikler i dette systemet, konkluderer vi med at ingen av de testede cellelinjer uttrykker dominerende restriksjoner faktorer av HCV celleoppføring, RNA oversettelse, RNA replikasjon eller virus montering og slipp. Spesielt, virale titere oppnådd i begge metodene avhenger et sett av faktorer. Først transgene uttrykk i emballasje cellene kan variere mellom de ulike cellelinjer og kunne påvirke trans-Complementation. Som vist i supplerende materiale i Frentzen et al., Kan referere til kriterier for transgene uttrykk fås ved spesifikk kjerne og E2 ELISAs og bestemmelse av fusjon effektivitet. Videre kunne celle størrelse, tetthet, vekst og tilbøyelighet til å fusjonere påvirke heterokaryon formasjon. Følgelig utvises forsiktighet når man sammenligner effektiviteten av viruset produksjon mellom individuelle heterokaryons.
Det ville være veldig interessant å analysere primære mus celler, derimot, er en begrensning av den eksperimentelle oppsettet at disse cellene ville bli vanskelig å transduce og evnen til å fusjonere med andre celler er neppe forutsigbar. Dette har imidlertid å bli testet spesielt for alle typer primære celler. Alternativer for å identifisere artsspesifikke restriksjoner faktorer kan være innføringen av en cDNA bank av interferon-induserte mus leverceller. Disse aspektene er allerede blitt diskutert mye i PLoS patogener papirav Frentzen et al 15.
For å validere tilnærming for å finne potensielle restriksjoner faktorer vi behandlet Hep56.1D emballasje celler med murine IFN-α før co-dyrking og fusion med Huh-7.5 replikonet celler. Vi observerte en reduksjon av smittsomhet foreslå at IFN-oppregulert gener kunne begrense montering i mus celler og demonstrere at potensielle antivirale faktorer kan påvises med denne analysen.
Systemene som er beskrevet i denne studien vil være nyttig for å skjerme en stor panel av menneskelige og ikke-menneskelige cellelinjer og primære celler for restriksjoner av HCV replikering syklus. I fremtiden kan slike undersøkelser bidra til identifisering og karakterisering av nye antivirale restriksjoner mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TP mottatt konsulenthonorarer fra Biotest.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Takaji Wakita og Jens Bukh for JFH1 og J6CF isolater, henholdsvis. Videre har vi takke Charles Rice til Huh-7.5 celler og 9E10 antistoff, Steven Foung for E2-spesifikt antistoff CBH-23, og alle medlemmer av Department of Experimental virologi, Twincore for nyttige innspill og diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 | |
| L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 | |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 | |
| α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | ||
| ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 | |
| Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G | |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 | |
| G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 | |
| Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 | |
| Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 | |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 | |
| Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL | |
| α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | ||
| DAPI (4',6'- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Alexa-Fluor 546 - goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 | |
| Alexa-Fluor 488 - goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 | |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 | |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML | |
| All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | ||
| Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |
References
- Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells. J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).
- Kato, T. Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon. J. Virol. 79, 592-596 (2005).
- Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line. J. Virol. 78, 491-501 (2004).
- Date, T. Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells. J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).
- Chang, K. S. Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities. J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).
- Zhong, J. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).
- Lindenbach, B. D. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309, 623-626 (2005).
- Wakita, T. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat. Med. 11, 791-796 (2005).
- Witteveldt, J. CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells. J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).
- Bitzegeio, J. Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors. PLoS Pathog. 6, e1000978 (2010).
- Lindemann, D., Goepfert, P. A. The foamy virus envelope glycoproteins. Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).
- Brohm, C. Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation. J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).
- Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles. J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).
- Koutsoudakis, G. Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses. J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).
- Frentzen, A. Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines. PLoS Pathog. 7, e1002029 (2011).
- Lindemann, D. A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity. J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).
- Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).
