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Biology

चूहा Splenocytes से टी सेल ग्रोथ फैक्टर की तैयारी

doi: 10.3791/402 Published: October 31, 2007

Summary

हम टी सेल विकास में विशिष्ट प्रतिजन चूहे टी लिम्फोसाइट लाइनों के इन विट्रो विस्तार के लिए इस्तेमाल किया कारक की तैयारी का वर्णन.

Abstract

प्रतिजन विशेष टी सेल संस्कृति में लाइनों या क्लोन के रखरखाव प्रतिजन प्रेरित सेल विस्तार 1,2 के चरणों द्वारा अलग सक्रियण के दौर की आवश्यकता है. 2 इंटरल्यूकिन के विस्तार के चरण के दौरान संस्कृति मीडिया के अलावा करने के लिए कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए आवश्यक है और अल्पकालिक टी सेल लाइनों को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है, लेकिन TH1 3 ध्रुवीकरण को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है. 2 इंटरल्यूकिन की टी सेल विकास (TCGF) कारक है जो साइटोकिन्स का मिश्रण होता है द्वारा रिप्लेसमेंट अधिक 3 इन विट्रो में लंबी अवधि के टी सेल लाइनों को बनाए रखने में इंटरल्यूकिन दो से अधिक प्रभावी है. इसके अलावा, TCGF आसानी से प्रयोगशाला में बड़ी मात्रा में तैयार किया जा सकता है और पुनः संयोजक 2 इंटरल्यूकिन की तुलना में बहुत सस्ता है.

यहाँ, हम बताते हैं कैसे चूहे splenocyte संस्कृति supernatants से TCGF तैयार करने के लिए. इस प्रक्रिया के लिए, हम भोले लुईस thymus और रक्त संग्रह के लिए euthanized चूहों से spleens फसल. हम तैयार spleens से एकल कक्ष निलंबन, आसमाटिक सदमे से लाल रक्त कोशिकाओं lyze, और बीज संस्कृति माध्यम में splenocytes. कोशिकाओं concanavalin एक, एक mitogen है कि गैर चुनिंदा सभी चूहे टी lymphocytes सक्रिय साइटोकिन्स का उत्पादन उत्प्रेरण के साथ प्रेरित कर रहे हैं. संस्कृति supernantant 48 घंटे बाद एकत्र andexcess concanavalin अल्फा मिथाइल mannoside के लिए बाध्य है यह टी सेल लाइनों जो TCGF जोड़ा जाएगा को सक्रिय करने से रोकने के. TCGF तो बाँझ फ़िल्टर, aliquoted, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत

Protocol

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  1. लुईस चूहे spleens (160 200g के बीच चूहों सर्वोत्तम) ले लो. पीबीएस + (पीबीएस पी एस) एंटीबायोटिक दवाओं के एक सेल झरनी का उपयोग युक्त एक पेट्री डिश में बर्फ पर Dilacerate. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखो. पीबीएस - पुनश्च साथ भरें.
  2. 4 में 10 मिनट के लिए स्पिन ° गोली कोशिकाओं सी.
  3. कोशिकाओं में दो बार धोएं.
  4. राष्ट्रीय राजमार्ग में गोली 4 सीएल 0.15 एम (तिल्ली 5 प्रति मिलीलीटर) Resuspend. धीरे और लगातार 3 मिनट के लिए बर्फ पर एक pipet के साथ मिक्स एरिथ्रोसाइट्स lyse . मध्यम के साथ ट्यूब भरें.
  5. 4 में 10 मिनट के लिए स्पिन ° गोली कोशिकाओं सी.
  6. कोशिकाओं में दो बार धोएं.
  7. कोशिकाओं की गणना. एक चूहे तिल्ली 200-250 मिलियन कोशिकाओं देता है.
  8. बीज पूरा मध्यम में 2 मिलियन प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं: 75 सेमी 2 फ्लास्क प्रति 50 मिलीलीटर.
  9. इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए बढ़ती.
  10. गोली कोशिकाओं में 15 मिनट 4 ° C स्पिन.
  11. सतह पर तैरनेवाला लीजिए; कोशिकाओं त्यागने.
  12. सतह पर तैरनेवाला 15 मिलीग्राम / एमएल मिथाइल mannoside जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स.
  13. फ़िल्टर (0.2 मिमी)
  14. विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान 4 ° C में यदि आवश्यक हो तो 10 दिनों के लिए रखा जा सकता है है.

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Discussion

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हम TCGF लुईस चूहे splenocytes से तैयार के बाद से हम नियमित रूप से यह सीरम और thymi इन विट्रो में लुईस चूहे टी सेल लाइनों को प्रोत्साहित करने के लिए फसल तनाव से अनुभवहीन चूहों euthanize. इस TCGF के लिए और अन्य चूहा उपभेदों से टी सेल लाइनों के विकास के अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. TCGF भी चूहों के अन्य उपभेदों से तैयार किया जा सकता है.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PBS, 1x, sterile Reagent GIBCO, by Life Technologies 14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x Reagent Sigma-Aldrich P0781 Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter Tool Fisher Scientific 08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl) Reagent Sigma-Aldrich A0171 Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640 Reagent GIBCO, by Life Technologies 21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) Reagent GIBCO, by Life Technologies 16140-071 Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine Reagent Cambrex/BioWhittaker 17-718R PSG
RPMI vitamins, 100x Reagent Sigma-Aldrich R7256
Sodium pyruvate, 100x Reagent Sigma-Aldrich S8636
Non-essential amino acids, 100x Reagent Sigma-Aldrich
Beta-mercapt–thanol Reagent Sigma-Aldrich M7522
alpha methyl mannoside Reagent Sigma-Aldrich M6882
Concanavalin A Reagent Sigma-Aldrich M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A.

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References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
  2. Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
  3. Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
चूहा Splenocytes से टी सेल ग्रोथ फैक्टर की तैयारी
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Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).More

Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).

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