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Biology

ラットの脾細胞からT細胞増殖因子の準備

doi: 10.3791/402 Published: October 31, 2007

Summary

我々は、抗原特異的ラットTリンパ球のラインのin vitroでの拡大のために使用されるT細胞増殖因子の調製を記載。

Abstract

培養中の抗原特異的T細胞株やクローンのメンテナンスは、細胞の膨張の1,2の段階で区切られた抗原誘発活性化のラウンドが必要です。拡張フェーズ中に培地にインターロイキン2の添加は細胞死を防止するために必要と短期的なT細胞株を維持するのに十分ですが、Th1の偏光3を高めることが示されている。サイトカインの組み合わせを含むT細胞増殖因子(TCGF)によるインターロイキン2の交換は、in vitro 3に、長期的なT細胞株を維持するためにインターロイキン2よりも効果的です。また、TCGFは、簡単に実験室で大量に用意し、組換えインターロイキン2よりもはるかに安価であることができる。

ここで、我々はラット脾細胞培養上清からTCGFを準備する方法を示します。この手順では、我々は胸腺と血液採取のために安楽死させナイーブLewisラットから脾臓を採取する。我々は、脾臓からの単細胞懸濁液を準備し、浸透圧ショックにより赤血球をlyze、およびシード培地に脾細胞。細胞は、コンカナバリンA、非選択的にサイトカインの産生を誘導する、すべてのラットのTリンパ球を活性化することをマイトジェンで刺激されています。文化supernantantがandexcessコンカナバリン48時間後に収集されるTCGFが追加されるT細胞株を活性化するからそれを防ぐために、アルファメチルマンノシドにバインドされています。 TCGFは、分注し、滅菌濾過し、-20℃で保存

Protocol

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  1. ルイスラットの脾臓(160〜200グラムの間でラット最高のものを)取る。セルストレーナーを使用してPBS +抗生物質(PBS - PS)を含むペトリ皿に氷の上で引き裂く。 50 mlチューブに入れ。 PBS - PSで埋める。
  2. 4℃で10分間スピン° Cの細胞をペレット化する。
  3. 細胞を2回洗浄する。
  4. NH 4 Clを 0.15 M(脾臓あたり5 ml)溶液でペレットを再懸濁します。赤血球を溶解するために氷上で3分間ピペットで静かにかつ継続的に混ぜる。培地でチューブを埋める。
  5. 4℃で10分間スピン° Cの細胞をペレット化する。
  6. 細胞を2回洗浄する。
  7. 細胞を数える。ラットの脾臓は、200〜250000000細胞を与えます。
  8. シード完全培地のMLに200万のセル:75 cm 2のフラスコに50 mlです。
  9. インキュベーターで48時間に成長しましょう​​。
  10. 細胞をペレット化するために4℃で15分間Cを回転させる。
  11. 上清を収集し、セルを廃棄。
  12. 上清に15 mg / mlのメチルマンノシドを追加。充分に混合する。
  13. フィルター(0.2 mm)の
  14. -20℃で分注しストア必要に応じて10日間4℃に保つことができる。

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Discussion

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我々は定期的に血清とthymusの複数形は、in vitroでルイスラットT細胞株を刺激するために収穫するために、この株からナイーブなラットを安楽死させるので、我々は、ルイスラットの脾細胞からTCGFを準備。このTCGFは、他のラット系統からのT細胞系の増殖と生存を促進するために使用することができます。 TCGFは、ラットの他の株から調製することができる。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PBS, 1x, sterile Reagent GIBCO, by Life Technologies 14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x Reagent Sigma-Aldrich P0781 Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter Tool Fisher Scientific 08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl) Reagent Sigma-Aldrich A0171 Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640 Reagent GIBCO, by Life Technologies 21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) Reagent GIBCO, by Life Technologies 16140-071 Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine Reagent Cambrex/BioWhittaker 17-718R PSG
RPMI vitamins, 100x Reagent Sigma-Aldrich R7256
Sodium pyruvate, 100x Reagent Sigma-Aldrich S8636
Non-essential amino acids, 100x Reagent Sigma-Aldrich
Beta-mercapt–thanol Reagent Sigma-Aldrich M7522
alpha methyl mannoside Reagent Sigma-Aldrich M6882
Concanavalin A Reagent Sigma-Aldrich M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A.

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References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
  2. Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
  3. Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
ラットの脾細胞からT細胞増殖因子の準備
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Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).More

Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).

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