Summary
우리는 항원에 특정한 T 림프구 쥐 라인의 체외 확장에 사용되는 T 세포 성장 인자의 준비를 설명합니다.
Abstract
문화의 항원에 특정한 T 세포 라인 클론의 유지 보수 세포 확장의 1,2 단계로 구분하여 항원 유발 활성화 순찰이 필요합니다. 확장 단계 동안 문화 미디어에 인터루킨 2의 추가는 세포 죽음을 방지하기 위해 필요한 단기 T 세포 라인을 유지하기 위해 충분한하지만 Th1 분극 3 증가 표시되었습니다. 크린 시토킨의 혼합을 포함 T 세포 성장 인자 (TCGF)에서 인터루킨 2의 교체가 체외 3 장기적인 T 세포 라인을 유지하는 인터루킨이보다 효과적입니다. 또한, TCGF 쉽게 실험실에서 다량으로 준비하고 재조합 인터루킨 2보다 훨씬 저렴하실 수 있습니다.
여기, 우리는 쥐의 splenocyte 문화 supernatants에서 TCGF를 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 절차에 대한, 우리는 thymus과 혈액 수집 euthanized 순진한 루이스 쥐에서 spleens를 수확. 우리는 문화 매체에 splenocytes을 spleens에서 단일 셀 suspensions을 준비 삼투 충격에 의해 적혈구를 lyze하고, 씨앗. 세포 concanavalin A, 비 선택 크린 시토킨의 생산을 유도, 모든 쥐 T의 lymphocytes을 활성화하는 mitogen로 자극하고 있습니다. 문화 supernantant가 andexcess concanavalin 48시간 후에 수집가 TCGF가 추가됩니다 T 세포 라인을 활성화하지 못하도록하기 위해 알파 메틸 mannoside에 바인딩됩니다. TCGF 다음, 살균 - 여과 aliquoted하고, -20 ° C.에 저장됩니다
Protocol
- 루이스 쥐 spleens (1백60-2백g 사이에 쥐 최고)를 가져가라. 셀 스트레이너를 사용하여 PBS + 항생제 (PBS - PS)이있는 배양 접시에 얼음 Dilacerate. 50 ML 튜브에 넣어. PBS - PS와 함께 입력합니다.
- 4 10 분 스핀 ° C를 펠릿 세포 수 있습니다.
- 세포를 두 번 씻으십시오.
- NH의 펠렛 4 망할 CIA 0.15 M을 (비장 당 5 ML) Resuspend. 적혈구를 lyse에 얼음 3 분 pipet과 함께 부드럽게 지속 섞는다. 매체와 튜브를 입력합니다.
- 4 10 분 스핀 ° C를 펠릿 세포 수 있습니다.
- 세포를 두 번 씻으십시오.
- 세포를 계산합니다. 쥐 비장은 200-250000000 세포를 제공합니다.
- 전체 매체 ML 당 2,000,000에 씨앗은 셀 : 75cm 2 플라스크 50 ML.
- 인큐베이터에서 48 시간 성장하자.
- 펠렛 세포 4 15 분 ° C를 스핀.
- 뜨는를 수집, 전지를 폐기하십시오.
- 뜨는 15 MG / ML 메틸 mannoside를 추가합니다. 완전히 섞는다.
- 필터 (0.2 ㎜)
- -20 ° C.에서 나누어지는 및 저장 십일 필요한 경우 4 ° C에 보관하실 수 있습니다.
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Discussion
우리가 정기적으로 혈청과 thymi은 체외에서 루이스 쥐 T 세포 라인을 자극하기 위해 수확이 변형에서 순진한 쥐를 안락사 이후 우리는 루이스 쥐 splenocytes에서 TCGF을 준비합니다. 이 TCGF 다른 쥐 종자에서 T 세포 라인의 성장과 생존을 촉진하는 데 사용할 수 있습니다. TCGF는 또한 쥐가 다른 변종에서 준비하실 수 있습니다.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14040-182 | |
| Penicillin / Streptomycin 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | P0781 | Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS |
| Cell strainer, 70 um diameter | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Reagent | Sigma-Aldrich | A0171 | Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold |
| RPMI 1640 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 21870-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | Heat-inactivated |
| Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine | Reagent | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | PSG |
| RPMI vitamins, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | R7256 | |
| Sodium pyruvate, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Non-essential amino acids, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Beta-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| alpha methyl mannoside | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A. | ||||
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
- Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
