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Biology

Preparando-se Fator de Crescimento de Células T esplenócitos Rat

doi: 10.3791/402 Published: October 31, 2007

Summary

Descrevemos a preparação de fator de crescimento de células T utilizado para a expansão in vitro de antígeno-específica de linfócitos T linhas rato.

Abstract

Manutenção de antígeno-específicas linhas de células T ou clones na cultura exige rodadas de antígeno-induzida ativação separados por fases de 1,2 expansão celular. Adição de interleucina 2 para o meio de cultura durante a fase de expansão é necessária para evitar a morte celular e suficiente para manter a curto prazo linhas de células T, mas foi mostrado para aumentar a polarização Th1 3. Substituição de interleucina 2 pelo fator de crescimento de células T (TCGF), que contém uma mistura de citocinas é mais eficaz do que a interleucina 2 na manutenção a longo prazo linhas de células T in vitro 3. Além disso, TCGF pode ser facilmente preparado em grandes quantidades no laboratório e é muito mais barato do que a interleucina 2 recombinante.

Aqui, vamos mostrar como preparar TCGF sobrenadantes de esplenócitos de ratos cultura. Para este procedimento, colhemos baços de ratos Lewis ingênuo sacrificados para timo e coleta de sangue. Nós preparamos uma única célula suspensões de baço, Lyze as células vermelhas do sangue por choque osmótico, ea semente da esplenócitos em meio de cultura. As células são estimuladas com concanavalina A, um mitógeno que os não-seletivamente ativa todos os linfócitos T de ratos, induzindo a produção de citocinas. A cultura é supernantant coletadas 48 horas depois concanavalina A andexcess é obrigado a alfa metil mannoside para impedi-lo de ativar linhas de células T para que TCGF será adicionado. O TCGF é então filtrado estéril, aliquotado e armazenado a -20 ° C.

Protocol

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  1. Tome baços de ratos Lewis (ratos entre 160-200g são os melhores). Dilacerar no gelo numa placa de Petri contendo PBS + antibióticos (PBS-PS) usando um filtro de células. Coloque em um tubo de 50 ml. Preencher com PBS-PS.
  2. Giro por 10 min a 4 ° C para agregar as células.
  3. Lave as células duas vezes.
  4. Ressuspender o sedimento em NH 4 Cl 0,15 M (5 ml por baço). Misture delicadamente e de forma contínua com uma pipeta de 3 min no gelo para lisar as hemácias. Encha o tubo com o meio.
  5. Giro por 10 min a 4 ° C para agregar as células.
  6. Lave as células duas vezes.
  7. Contagem das células. Um baço de rato dá 200-250000000 células.
  8. A semente células em 2 milhões por ml em meio completo: 50 ml por frasco de 75 cm 2.
  9. Deixe crescer por 48 horas na incubadora.
  10. Rodada 15 min a 4 ° C para agregar as células.
  11. Recolher o sobrenadante; descartar as células.
  12. Adicionar 15 mg / ml mannoside uma metila para o sobrenadante. Misture bem.
  13. Filtro (0,2 mm)
  14. Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Pode ser mantido a 4 ° C por 10 dias, se necessário.

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Discussion

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Nós preparamos TCGF de esplenócitos de ratos Lewis, uma vez que regularmente euthanize ratos ingênuos a partir desta cepa para a colheita de soro e thymi para estimular ratos Lewis linhas de células T in vitro. Este TCGF pode ser usado para promover o crescimento ea sobrevivência de linhagens de células T das estirpes outro rato. TCGF também podem ser preparados a partir de outras linhagens de ratos.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PBS, 1x, sterile Reagent GIBCO, by Life Technologies 14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x Reagent Sigma-Aldrich P0781 Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter Tool Fisher Scientific 08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl) Reagent Sigma-Aldrich A0171 Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640 Reagent GIBCO, by Life Technologies 21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) Reagent GIBCO, by Life Technologies 16140-071 Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine Reagent Cambrex/BioWhittaker 17-718R PSG
RPMI vitamins, 100x Reagent Sigma-Aldrich R7256
Sodium pyruvate, 100x Reagent Sigma-Aldrich S8636
Non-essential amino acids, 100x Reagent Sigma-Aldrich
Beta-mercapt–thanol Reagent Sigma-Aldrich M7522
alpha methyl mannoside Reagent Sigma-Aldrich M6882
Concanavalin A Reagent Sigma-Aldrich M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A.

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References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
  2. Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
  3. Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
Preparando-se Fator de Crescimento de Células T esplenócitos Rat
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Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).More

Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).

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