Summary
Aqui descrito é uma técnica na qual lipopolissacárido é injectado na glândula mamaria de rato lactante através do bocal para simular a mastite, uma condição geralmente causada por infecção bacteriana. Resultados lipopolissacarídeos injeção em maior fator nuclear kappa B (NF-kB) de sinalização, visualizado através de imagem de bioluminescência de um rato repórter NF-kB luciferase.
Abstract
Os modelos animais de doenças humanas são necessárias a fim de estudar rigorosamente as fases de progressão da doença e os mecanismos associados, e, finalmente, como modelos pré-clínicos para testar intervenções. Nestes métodos, é descrita uma técnica na qual os lipopolissacáridos (LPS) é injectado na glândula mamaria de rato lactante através do bocal, de forma eficaz a mastite modelagem, ou a inflamação, da glândula. Isto resulta de infecção simulados em maior fator nuclear kappa B (NF-kB) de sinalização, como visualizado através de imagem de bioluminescência de um rato repórter NF-kB luciferase 1.
Nosso objetivo final no desenvolvimento desses métodos foi estudar a inflamação associada com mastite na glândula lactantes, que muitas vezes inclui vermelhidão, inchaço, e infiltração de células imunes 2,3. Por isso, estavam completamente cientes de que a incisão ou a qualquer tipo de ferimento da pele, do mamilo ou da glândula de modo a introduzir os LPS poderianão ser utilizado nos nossos métodos desde que a abordagem provavelmente confundir a leitura de inflamação. Nós também desejou um método simples e direto que não exige feitos especialmente desenhados à mão pipetas ou o uso de micromanipuladores para manter essas ferramentas especializadas no lugar. Assim, determinou-se a utilizar uma seringa de insulina comercialmente disponíveis e para injectar o agente dentro do ducto mamário de um mamilo intacta. Este método foi bem sucedida e permitiu-nos estudar a inflamação associada com a injecção de LPS, sem quaisquer efeitos adicionais sobrepostos pelo processo de injecção. Além disso, este método também utilizado um NF-kB luciferase repórter transgénico do rato e bioluminescentes tecnologia de imagem para mostrar visualmente e quantitativamente aumentar a sinalização de NF-kB na glândula LPS injectada 4.
Estes métodos são de interesse para pesquisadores de várias disciplinas que desejam doença modelo dentro da glândula mamária em lactação, em última análise, a técnicaaqui descrita pode ser utilizada para a injecção de um certo número de substâncias, e não está limitado a apenas a LPS.
Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal Care Vanderbilt University Institucional e Comitê de uso.
1. Preparando Ratos transgênicos
- Ratinhos fêmea, positivo para o (N-kB F-G-L uciferase FP) repórter NGL transgene (descrito anteriormente 1) são utilizadas para este procedimento. Quando as fêmeas são pelo menos 6 semanas de idade, eles acasalar com um macho tipo FVB selvagem. Harem criação podem ser utilizadas (até 4 fêmeas em uma gaiola com um macho). (Nota: ratos da estirpe FVB foram utilizados para o estudo ratos mais escuras, tais como da estirpe C57BL6 podem também ser usados, mas estes ratos deve ser raspada antes da imagiologia.).
- A partir de 15 dias pós-acasalamento, as fêmeas verificar regularmente para detectar sinais de gravidez (girth salientes grande). Cada fêmea deve ser separada uma vez grávida eo homem retirado da gaiola de criação uma vez que a última fêmea fica grávida.
- Assista as fêmeas separados umd anotar a data de nascimento, quando aparece uma maca. A ninhada de pelo menos 6 crias é necessária para a lactação adequada. Oito dias após o nascimento da ninhada, prosseguir com o protocolo (ver Figura 1 para um esquema timeline).
2. Preparação para Injeção
- Dissolve-se o E. LPS de E. coli em PBS para uma concentração final de 0,1 ug / uL. 50 ul desta solução, ou um total de 5 ug, irá ser injectado na glândula mamária. Preparar um segundo tubo de PBS por si só deve ser usado para a injecção de controlo.
- Definir-se um escopo de dissecação e de anestesia isoflurano. Um aparelho de nariz-cone deve ser fixado à fase do escopo de dissecação em que o rato será colocado. Uma boa fonte de luz, seja do âmbito próprio ou de holofotes extras também deve estar preparado.
- Uma vez que o set-up é completa, iniciar a máquina isoflurano e fluxo de ar.
3. Injeção intraductal de LPS
- Carregar a seringa agulha curta com 50 ul da solução de LPS. Defina este lado.
- Anestesiar o mouse para ser injetado pela primeira colocação do sexo feminino em uma caixa cheia de isoflurano e, depois, a respiração é lenta, ela passar para o palco e colocar o nariz dentro do nariz cone. Use uma pitada de igual para confirmar o mouse é totalmente anestesiado. Monitorizar a respiração do rato ao longo do processo e ajustar o nível de isoflurano em conformidade. A gaiola contendo a ninhada de filhotes que a fêmea tem sido tomadas a partir deve ser cuidadosamente retiradas até que a barragem pode ser devolvido após o procedimento.
- Use uma pequena gota de etanol de 70% para fazer o casaco e colocar o plano para ajudar a visualizar o mamilo ligados à direita # 4 glândula mamária inguinal no abdômen inferior do mouse.
- Concentre-se no âmbito de dissecação para uma visão ideal do mamilo. Com cuidado, use um conjunto de pinça fina para continuar a desenhar o mamilo longe da pele, mas não punção ou ferir o mamilo de forma alguma. Ofórceps nunca devem ser apertados em conjunto, quando da manipulação do tecido, mas utilizado com um porão de luz que requer uma quantidade mínima de tensão na mamilo.
- Use a pinça na mão esquerda para segurar delicadamente o mamilo no lugar. Lentamente trazer a seringa pré-carregada no campo de visão usando a mão direita. A seringa deve ser mantido de modo a que nenhum reposicionamento tem que ocorrer de forma a injectar o conteúdo.
- Uma vez que a seringa está em vista, procurar com cuidado na abertura pequena ductal dentro do centro do bocal, e inserir a seringa.
- Sem reposicionar a mão, injecta o conteúdo da seringa e remover a agulha do mamilo.
- Carregar uma segunda seringa com 50 ul de PBS para o controlo de injecção. Reposicionar o mouse sobre o palco e para a melhor vista da esquerda mamilo glândula mamária inguinal º 4 do outro lado do abdômen inferior do mouse. Repita os passos 3,4-3,7 utilizando a seringa PBS-carregado.
- Uma vez que ambas as injeções são complEte, descontinuar a anestesia e mova o mouse para uma gaiola de recuperação. Monitorar a fêmea para assegurar que ela se torna móvel dentro de 5 min. Permitir que o rato para permanecer na gaiola de recuperação durante 1 hora. Depois de 1 hora de recuperação, coloque as costas feminino na gaiola com sua ninhada de filhotes. Ratos devem ser monitorizados periodicamente por 6 horas após a injecção antes de proceder à imagem. Em nossa experiência, não há conseqüências adversas foram observadas em qualquer fêmea ou os filhotes durante o período entre a injeção e de imagem. No entanto, se os sinais de perigo são observadas no sexo feminino (por exemplo, a postura arqueada, mordendo ou guarda do local de injecção, letargia geral) ou os filhotes (sem movimento, cor azulada da pele) a experiência deve ser interrompida.
4. Bioluminescent Imaging para Visualize NF-kB Atividade
- Uma vez que ratos foram transportados para a unidade de imagem, iniciar o procedimento de imagem, abrindo o software e inicializar a máquina. Ligue o éoflurane máquina e do fluxo de ar, assegurando que a anestesia é a fluir para ambos a caixa e a câmara de geração de imagens.
- Posicione o mouse sob anestesia isoflurano na caixa de anestesia claro. Uma vez que a respiração desacelerou, use uma pitada de igual para confirmar o mouse é totalmente anestesiado. Em seguida, injecta-se 100 uL de substrato de luciferina no rato por injecção de retro-orbital 5 usando uma seringa estéril.
- Transferir imediatamente o mouse para a câmara de imagem e colocar o nariz sob o isoflurano nariz-cone localizado lá. O mouse deve ser supina. Fixe cada pé para o palco com fita.
- Entrada as configurações apropriadas para o software IVIS para tomar tanto uma imagem de luz branca fotográfico e uma imagem da atividade bioluminescente. O tempo de exposição deve ser de 10 segundos. Obter a imagem.
- Uma vez que as imagens tenham sido adquiridos, permitem o mouse para se recuperar e, em seguida, colocá-la de volta na gaiola com seus filhotes e monitorar periodicamente.
- A fotográfico e luminescentesas imagens são sobrepostas e automaticamente apresentada no ecrã, como na Figura 2. Analisar as imagens adquiridas, colocando região de interesse ou "ROI" círculos de igual tamanho em cada lado do abdômen inferior do mouse (um sobre a glândula PBS-injetado e um sobre a glândula LPS-injetados). Defina a leitura para fótons. Um número deve ser exibido indica a luminescência detectada dentro de cada ROI (ver Figura 2B). Utilize este número em análise estatística.
- Para exibir a imagem ideal, ajustar ainda mais o limiar do sinal exibido. Isso não vai alterar a luminescência total de Leitura, mas irá permitir que você remova sinal de fundo e visualizar as diferenças entre o controle e LPS-tratados glândula. Diminuir a quantidade de luminescência mostrado até a glândula PBS-injetada é livre de sinal de fundo. Isso deve deixar o sinal aumentado na glândula LPS-tratado ainda aparente na imagem, como pode ser visto na Figura 2.
- AdditionaAnálise l, incluindo os ensaios de proteína e ARN, pode ser preenchido com tecido mamário recolhida da fêmea post-mortem 6.
5. Resultados representativos
Para se obter resultados interpretáveis destes métodos, LPS (ou PBS) devem ser infundido apenas para as condutas mamárias, deixando o tecido adjacente intacta. A injecção no tecido subcutâneo envolvente do bocal irá resultar em inflamação devido a uma lesão em vez da infecção simulada. Injecção de corante azul de tripano diluído em PBS é útil quando a aprendizagem da técnica. Figura 3A mostra uma glândula com sucesso injectado infundidos com 100 ul de azul de tripano em PBS. Como se mostra, apenas a árvore ductal deve ser cheio com a solução injectada, e não deve haver nenhuma bolus no local da injecção. A "bolus", neste contexto, é uma acumulação de líquido injectado no bocal ou no tecido que envolve o bocal sem infusão para a árvore ductal. Este é shprópria na Figura 3B. Por favor note que as injecções de prática mostrado na Figura 3 foram completadas em uma fêmea no dia 21 da lactação. Durante o pico de lactação (dias 8-10, a fase em que é injectado por LPS utilizando o protocolo de corrente), o leite é abundante, e é difícil de visualizar as condutas e determinar se a injecção ter sido concluída correctamente. Portanto, os pontos depois do tempo em lactação são melhores para injeções de prática.
Injeção bem sucedida de LPS nos resultados mamárias dutos em aumento de NF-kB atividade dentro da glândula. Isso deve ser evidente no rato repórter sobre IVIS de imagem, e a glândula LPS injectada deve ter substancialmente a actividade de luciferase mais elevada (medido por contagem de fotões) que a glândula PBS-injectado, conforme mostrado na Figura 2 (em média, a glândula LPS lê 200% do sinal de controlo de PBS). Um aumento estatisticamente significativo da luminescência nas glândulas LPS-tratadas como amostraared ao controle contralateral foi feito através da realização de um grupo de 4 ratos 4. Um estudo adicional também utilizados para injeção mamária intraductal de qualquer E. coli ou LPS em transgênicos repórter NF-kB. Semelhante ao nosso próprio trabalho, esses autores viu um aumento significativo na atividade de repórter hr 6 depois E. coli injeção 2.
Por favor note, devido à atividade de NF-kB constitutivo no cérebro e outros órgãos abdominais, as cabeças e abdômen de ratos nosso repórter mostram consistentemente um sinal quando fotografada, mesmo na linha de base antes de qualquer manipulação. Assim, este sinal deverá ser ignorado no que diz respeito a esta experiência. Um sinal evidente deve permanecer dentro da glândula mamaria LPS injectada após a leitura de imagem é ajustado para minimizar a luminescência fundo na glândula PBS. Figura 2 mostra as imagens com o fundo reduzido.
Injeção mal sucedida da glândula vontademais provável resultado em dano ao mamilo. Isto fará com que assinalou, a inflamação da pele-nível que será evidente em cima da imagem latente. Este tipo de sinal de ferimento será muito forte e confinado à área do bocal em que o dano tenha ocorrido, não emana toda a glândula, como pode ser visto depois de uma injecção de LPS de sucesso para as condutas.
Figura 1. Esquemática de Procedimento.
Figura 2. Os resultados representativos de IVIS bioluminescente de imagem. (A) Adquirida imagem com fundo reduzido, revelando o aumento da atividade da luciferase na glândula LPS-injetados. (B) imagem de uma região com juros de quantificações acrescentou. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3 injecção Practice:.. Glândula mamária injectados com corante via injecção intraductal Para testar a exactidão do fornecimento através do bocal, um ratinho no dia 21 da lactação foram injectados com 100 uL de corante azul de tripano diluído em PBS. Após o sacrifício, a glândula foi exposto para visualização. (A) a injecção de sucesso e (B) em bolus de corante no mamilo.
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Discussion
Aqui nós utilizamos um rato transgênico repórter NF-kB e uma técnica de injeção otimizado à mastite modelo, inflamação do tecido da mama mais comumente causada por infecção bacteriana. O passo mais importante neste processo é a injeção intraductal si.
Na prática, é normalmente aparente se a injecção intraductal tem sido bem sucedida. A injecção dos agentes (LPS ou PBS) deve sentir-se fluido e não deve haver pouca ou nenhuma resistência, como a seringa é esvaziado. A armadilha mais comum é o dano ao mamilo levando a passagem obstruída na glândula. Isto pode ser visualizado ao olhar para o bico através do escopo de dissecação. Os danos podem ser evitados pela prática suficiente, quando da manipulação de delicadeza do mamilo, e assegurando que apenas a menor das agulhas (31G ou superior) é utilizada para realizar o procedimento. Além disso, se a agulha não estiver posicionado corretamente, ou se ele desliza injeção de meio, uma compilação-Se de LPS ou PBS pode formar no local da injecção e o líquido não se espalhará pelos ductos. Se isso acontecer, você pode tanto visualmente ver o acúmulo de líquido na pele ao redor do mamilo, ou a injeção não vai sentir fluido. Embora esta armadilha não podem ser totalmente eliminados, ocorrências podem ser evitadas em grande parte pela prática e através da utilização de ferramentas adequadas.
A técnica aqui utilizada para a injecção foi crítico para esta experiência particular. Alguns métodos publicados para a injeção intraductal na glândula mamária exigem corte / remoção do bocal e / ou incisão através da pele 7,8. Neste caso, como o ponto final primário do estudo foi o de determinar o NF-kB inflamação relacionada dentro da glândula, incisões ou perturbação da pele ou do mamilo foram indesejável, que pode induzir um sinal inflamatório devido à lesão dos tecidos que se confundem o sinal induzido por LPS.
Além disso, o nossoinjecção foi completada com uma seringa de insulina comercialmente disponíveis e sem a utilização de uma micropipeta ou micromanipuladores desenhado, como em várias outras metodologias para a injecção, que não utilizam a remoção bocal 9, 10. Nós acreditamos que este era apenas viável porque o mamilo lactantes é ligeiramente alargada e um pouco mais fácil para injetar que um jovem mamilo mouse, virgem. Para injetar camundongos virgens, as ferramentas mais rigorosos podem ser necessários.
É evidente a partir da Figura 2, que se for correctamente executada, a injecção de LPS nas condutas da glândula mamaria de rato provoca inflamação localizada como visualizado por um aumento na actividade de NF-kB repórter luciferase. Outros analisaram mais amplamente este modelo de mastite aguda, quer através de E. coli ou de injecção de LPS na glândula mamaria e subsequente análise do tecido 2-3, 8, 10-14. Entre muitas descobertas, estes estudos demonstram que a resposta inflamatória is modulados por interacções com CD14, e que resulta num influxo de neutrófilos regulada por mamárias macrófagos alveolares. Como sugerido em ambos os nossos trabalhos anteriormente publicados 4, bem como a dos outros dois neste modelo de mastite pode ser ainda utilizada para estudar os mecanismos e agentes terapêuticos relevantes em humanos, onde até 3-33% de mulheres que amamentam sofrem desta infecção dolorosa (percentagem varia com base na metodologia de estudo) 15. Ele também pode ser uma ferramenta de pesquisa útil para aqueles na indústria de laticínios, onde a mastite é uma doença dispendiosa levando a perdas significativas na produção de leite a cada ano 16.
Finalmente, os ratinhos NGL repórter transgénicos utilizados aqui e os que funcionam de forma semelhante ratos repórter HLL 17 têm sido utilizados em vários estudos para verificar, quantificar e controlar a regulação para cima ou para baixo de actividade de NF-kB numa variedade de modelos de doença e de desenvolvimento incluindo a aguda pulmãolesões de câncer de pulmão, vias aéreas morfogênese ramificação, resistência à insulina, obesidade e infarto do miocárdio 1, 17-21. Este modelo constitui um exemplo adicional da utilidade destes transgénicos repórter.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão CA113734 concedido a F Yull e do Departamento de Assuntos de Veteranos (TS Blackwell).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
| Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
| Dissecting scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
| Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
| D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
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