Summary
Neste protocolo descrevemos produção, purificação e titulação de lentivirais. Nós fornecemos um exemplo de entrega do gene lentiviral vetor mediada em primárias neurônios cultivados e astrócitos. Nossos métodos podem também se aplicam a outros tipos de células
Abstract
De entrega de genes eficiente no sistema nervoso central (SNC) é importante no estudo funções de genes, modelando doenças neurológicas e desenvolvimento de abordagens terapêuticas. Lentivirais são ferramentas atraentes na transdução de neurónios e outros tipos de células no SNC como eles transdução ambas as células em divisão e não-dividindo, a expressão de transgenes apoio sustentado, e têm uma capacidade relativamente grande de embalagem e baixa toxicidade 1-3. Lentivirais têm sido usados com sucesso na transdução muitos tipos de células neurais in vitro e em animais 4-6 7-10.
Grandes esforços têm sido feitos para desenvolver lentivirais com segurança biológica melhorada e eficiência para entrega de genes. As correntes de terceira geração replicação defeituosa e auto-inativadora (SIN) lentivirais estão representados na Figura 1. Os elementos necessários para embalagem vetor são divididos em quatro plasmídeos. No trans lentiviralfer plasmídeo, a região U3 na repetição do 5 'terminal longa (LTR) é substituído com um promotor forte de outro vírus. Esta modificação permite a transcrição da sequência de vector independente do HIV-1 da proteína Tat que é normalmente necessária para a expressão do gene HIV 11. O sinal de empacotamento (Ψ) é essencial para a encapsidação e do elemento de Rev-responsivo (RRE) é necessária para a produção de vectores de título elevado. A central polypurine trato (CPPT) é importante para a importação nuclear do ADN do vector, uma característica necessária para transduzir células não-divisórias 12. No LTR 3 ', as sequências de cis-reguladoras são completamente removidos a partir da região U3. Esta supressão é copiado para LTR 5 'após a transcrição reversa, resultando em inactivação transcricional de ambos os LTRs. PMDLg plasmídeo / pRRE contém HIV-1 gag / pol genes, que fornecem as proteínas estruturais e transcriptase reversa. pRSV-Rev codifica rev, que se liga ao RRE para exportação de ARN eficiente a partir do núcleo. pCMV-G codificaa glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G), que substitui o HIV-1 env. VSV-G expande o tropismo dos vectores e permite a concentração por meio de ultracentrifugação 13. Todos os genes que codificam as proteínas acessórias, incluindo vif, vpr, Vpu, e Nef são excluídos no sistema de embalagem. A produção e manipulação de lentivirais deve ser realizada de acordo com as orientações do NIH para pesquisa envolvendo DNA recombinante ( http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). Uma aprovação do Comitê de Segurança Institucional indivíduo Biológica e Química pode ser necessária antes de usar lentivirais. Lentivirais são geralmente produzidas por co-transfecção de células 293T com transferência lentiviral plasmídeo e os plasmídeos auxiliares que codificam as proteínas necessárias para a embalagem vector. Muitos plasmídeos de transferência lentivirais e plasmídeos auxiliares pode ser obtido a partir de Addgene, um nãoFins lucrativos repositório plasmídeo ( http://www.addgene.org/~~V ). Algumas linhas celulares estáveis de embalagem têm sido desenvolvidos, mas esses sistemas proporcionam menos flexibilidade e sua eficiência de embalagem geralmente decresce ao longo do tempo 14, 15. Os kits de transfecção comercialmente disponíveis podem suportar uma elevada eficiência de transfecção 16, mas podem ser muito caro para preparações de vector de grande escala. Métodos de cálcio precipitação de fosfato de fornecer transfecção altamente eficiente de células 293T e, assim, proporcionar uma abordagem confiável e de custo eficaz para a produção de vetor lentiviral.
Neste protocolo, que produzem lentivirais por cotransfecção de células 293T com quatro plasmídeos baseados no princípio precipitação com fosfato de cálcio, seguido de purificação e concentração com ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose a 20%. Os títulos de vector são determinados por fluorescência-activated separação de células (FACS) analYsis ou por qPCR tempo real. A produção e titulação de lentivirais neste protocolo pode ser terminado com 9 dias. Nós fornecemos um exemplo de transdução esses vetores em murinos culturas neocorticais que contenham ambos os astrócitos e neurônios. Nós demonstramos que lentivirais suporte de elevada eficiência de transdução e expressão génica em células de tipo específico de células primárias de cultura a partir de CNS.
Protocol
1. Embalagem de lentivirais
Lentivirais são produzidos por co-transfecção de um vector de transferência lentiviral e outros plasmídeos necessários para a embalagem em células 293T pelo cálcio método de transfecção de fosfato. Usamos 10 100-mm pratos de cultura de tecidos neste protocolo. Ele pode ser escalado para cima ou para baixo dependendo de aplicações. A linha de células 293T é mantida em Dulbecco modificado por Eagles (DMEM) com glucose elevada (4500 mg / L), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 unidades / penicilina ml, estreptomicina 100 ug / ml em 37 ° C incubadora com 5% de CO 2.
- Semente 293T células em confluência de 30-40% a 10 100-mm pratos de cultura de tecidos (3 x 10 6 células / prato) em meio de cultura. Retornar as células a incubadora.
- Após 20-24 h de cultura, verificar a densidade celular. As células devem ser de cerca de 80% de confluência no momento da transfecção.
- Preparar um tubo de 50 ml. Adicionar 4,4 ml TE79/10 (1 mM TrisHCl, 0,1 mMEDTA, pH 7,9) menos o volume total do DNA de plasmídeo seguinte. Adicionar 100 ug de transferência lentiviral plasmídeo (Figura 1), 58 ug pMDLg / pRRE, ug de pCMV-G 31, 25 ug pRSV-Rev, 600 uL 2M de CaCl2. Misture delicadamente.
- Preparar um outro tubo de 50 ml. Adicionar 5 ml 2x HBS (HEPES 0,05 M, 0,28 M de NaCl, 1,5 mM de Na 2 HPO 4, pH 7,12).
- Tomar a DNA-CaCl 2 por mistura de 10 ml pipeta e adicionar ao tubo contendo 2 x HBS, gota a gota, enquanto o tubo de vórtice.
- Mantenha a reacção de precipitação à temperatura ambiente (RT) durante 30 min.
- Remover os pratos de cultura de incubadora. Misturar a reacção de precipitação bem em vórtice. Adicionar 1 ml de suspensão de células a cada 100-mm prato contendo. A suspensão deve ser adicionado lentamente, gota a gota enquanto suavemente agitando o meio no prato. Retornar estes pratos para a incubadora e deixar durante 5 h.
- Remover o meio a partir da cultura. Adicionar 6 ml meio de cultura fresco, contendo 6 mM de sódio butyrate para cada prato. Retornar as culturas de incubadora. Após cultura durante a noite, se houver um repórter fluorescente no construto, verificar a expressão do gene repórter sob microscópio de fluorescência. Geralmente, mais de 80% das células expressam o gene repórter, se for conduzido por um promotor ubíqua (por exemplo, promotor de CMV).
- Dois dias (40-44 h) após a transfecção, recolher o sobrenadante a partir de 10 pratos em 2 50 ml tubos (cerca de 30 ml cada tubo). Congelar o sobrenadante em -80 ° C congelador ou ir para a próxima etapa.
2. Concentração e purificação dos Vectores
- Centrifugar a recentemente colhido ou descongelado sobrenadante a 900 g (cerca de 2000 rpm) durante 10 min para remover todos os detritos de células no sobrenadante.
- Anexar uma seringa de 60 ml de uma 0,2-uM filtro de seringa SFCA. Transferir o sobrenadante a partir de 50-ml tubo para a seringa. Filtrar o sobrenadante para um tubo de centrífuga de polialómero.
- Tome 5 ml de sacarose a 20% (preparada em PBS) para cima em uma pipeta de 5 ml. Inserira pipeta para o fundo do tubo de centrífuga contendo sobrenadante. Lentamente, adicionar a solução de sacarose sob o sobrenadante vetor. Repita essas etapas para o sobrenadante de outro tubo.
- Centrifugar o sobrenadante a 11.000 rpm e 4 ° C durante 4 h com rotor Beckman SW28 balanço.
- Remover o sobrenadante. Adicionar 150 uL Lactose 4% (preparado em PBS) a cada tubo de centrífuga. Ressuspender as peletes.
- Transferir o vector concentrado a partir de todos os tubos de centrifugação para um tubo de 1,5 ml. Deixar o tubo em gelo durante 15 min.
- Misture a suspensão vetor por pipetagem. Girar com microcentrífuga a toda a velocidade (cerca de 16.000 g) durante 1 min.
- Transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml nova. Divida a amostra final em alíquotas de 20 ul e guardou no congelador -80 ° C.
3. Titulação dos Vectores
- Semente 5 x 10 4 / poço de células HT1080 em 12 poços da placa em meio DMEM 1 ml suplementado com FBS 10%.
- Depois overnight cultura, contagem de células de um bem e marcar o número de células.
- Fazer 5-vezes diluição em série (1:5, 1: 25; 1:125; e 1:625) do vector concentrada com meio de cultura. Adicionar I uL de cada vector diluído aos poços separados. As amostras podem ser repetido para aumentar a precisão.
- Adicionar 1 ml de 4 mg / ml de polibrene (Hexadimetrina Brometo) em cada poço contendo vector e para dentro de um poço sem vector. Misturar agitando a placa. Retornar à incubadora durante 48 h.
- Remover meio dos poços de cultura de células. Lavar cada poço com PBS. Adicionar 250 uL 1x solução tripsina-EDTA para as células. Quando as células são separadas (3-5 min), adicionar 1 ml meio de cultura. Ressuspender as células por pipetagem. Transferir suspensão de células a 1,5 ml de tubos de centrifugação.
- Centrifugar a 900 g durante 6 min. Para vetores com um gene repórter fluorescente (GFP, por exemplo), vá para o passo 3.7 para análise FACS. Para vetores sem um repórter, vá para o passo 3,8 para qPCR em tempo real.
- Para vectores contendo um fluogene repórter fluorescentes, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 300 uL de formaldeído de 3,7% em PBS. Determinar a percentagem das células positivas repórter por análise de FACS. O título será representado como unidades de transdução por mililitro concentrada vector (TU / ml).
Por exemplo, se 1 x 10 5 células foi transduzida com 1/25 uL (0,04 uL) vector e células de 30% são repórter positivo, a título será:
Apenas utilizar as diluições cair em uma relação linear entre a percentagem de células positivas ea quantidade de vector adicionado para calcular título. O título final deve ser uma média de os títulos obtidos a partir de transduções de pelo menos 2 diferentes quantidades do vector.
- Para vectores semgene repórter fluorescente, extrair o ADN genómico de células HT1080, utilizando QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. Amplificar sequência do vector no DNA genómico usando ABI Prism 7000 Sistema de Detecção de Sequência (Applied Biosystems) com primers (em HIV-1 região PBS / psi 17) 5'-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 'e 5'-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3', e TaqMan sonda 5 '-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3'. Gene de albumina que é um gene de cópia única no genoma (2 cópias / célula) foi também amplificado com os iniciadores 5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 'e 5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3', e sonda 5'-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3 "como um controle interno. Determinar os números de cópias do vector e de albumina por PCR em placa de 96 poços de acordo com as instruções do fabrico com o seguinte programa: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, e 35 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 2 min. Dez diluições em série de plasmídeos de concentração conhecida (representado como cópianúmero) contendo as sequências do molde deve também ser amplificado para criar uma curva padrão para quantificação de amostras desconhecidas. O título será representado como unidades de integração por mililitro concentrada vector (UI / ml).
4. Transdução de Culturas neocortical
Culturas neocorticais contendo ambos os neurónios e glia são preparados a partir de córtices rato usando um processo de revestimento de dois passos, como descrito anteriormente 18. Neocórtices obtidos a partir de ratos fetais em 14-16 dias de gestação são plaqueadas sobre uma monocamada previamente estabelecido glial em MEM suplementado com 10% de FBS, 20 mM de glucose e 2 mM de glutamina em 24 poços da placa de cultura de tecidos.
- Após 5 dias in vitro, adicionam-se 10 uM de citosina arabinósido (Ara-C) no neoccultura ortical para inibir não neuronais a divisão celular. Continuar a cultura das células durante 2 dias.
- Meio de cultura quente em 37 ° C banho de água durante 5-10 min. Substituir Ara-C contendo o meio com meio de cultura fresco (500 ul / poço).
- Adicionar vector com desejado MOI (multiplicidade de infecção; a razão entre o número de partículas de vector com o número de células alvo) à cultura. Continuar a cultura durante 24 h. Usamos MOI de 1-10 (geralmente 5) em culturas primárias corticais.
- Substituir o meio de cultura com meio fresco. Continuar a cultura. Se houver um gene repórter na construção vector, vá células sob microscópio fluorescente 2 dias após a transdução. A expressão do gene repórter será visível em neurónios 2-7 após a transdução, dependendo do desenho vector e da dose utilizada.
5. Os resultados representativos
Os títulos de lentivirais produzidos com esta gama de protocolo 10 8 -10 10 UI / ml, which são adequados para a transdução de uma variedade de tipos de células a partir de CNS tanto in vitro como in vivo. Tabela 1 ea Figura 2 mostram um resultado representativa, utilizando os vectores produzidos por este protocolo. Nós transduzidas murinos culturas neocorticais com lentivirais expressando a proteína verde fluorescente (GFP), controlada pela sinapsina promotor (SYN) ou proteína glial fibrilar ácida promotor (GFAP). Sete dias após a transdução, foi realizada a imunocoloração para neurónios do rótulo e astrócitos com anticorpos anti-NeuN e anti-GFAP, respectivamente. Como mostrado na tabela 1 e fig. 2A, após a transdução com o vector portador do promotor de sinapsina, mais de 90% dos neurónios (NeuN + células) expressa GFP e nenhum astrócitos (GFAP + células) expressar o gene repórter. Quando promotor GFAP é usado na construção vector (Fig. 2B), cerca de 80% de astrócitos (GFAP + células) express GFP; todos GFP + de células são astrócitos como confirmado por colocalização com GFAP e à ausência de expressão da GFP em células NeuN-rotulados. Estes resultados demonstram que lentivirais são muito eficientes para entregar transgenes para as células de CNS e célula-específica expressão do gene pode ser alcançada quando promotores apropriados são utilizados.
Figura 1. Representação esquemática do HIV baseados lentivirais e os plasmídeos de empacotamento. O HIV-1 provírus é mostrado na parte superior. Os elementos para a produção de vector são separados em quatro diferentes plasmídeos. A transferência lentiviral plasmídeo contém um LTR 5 'híbrido no qual a região U3 é substituído com o citomegalovírus (CMV) promotor, o sinal de empacotamento (ψ), a sequência RRE, o tracto polypurine central (CPPT), um gene de interesse (por exemplo um repórter fluorescente), juntamente com um promotor de escolha, ea LTR 3 'na qual osequências reguladoras cis são completamente removidos a partir da região U3. pMDLg / pRRE contém as proteínas gag e pol e genes sequência RRE de HIV-1 sob o controlo do promotor de CMV. pRSV-Rev contém a sequência de codificação de Rev conduzida pelo promotor RSV. pCMV-G contém o gene da proteína VSV-G sob o controlo do promotor de CMV. PA indica o sinal de poliadenilação do gene β-globina humana.
Figura 2. Expressão de genes repórter em cultura mista rato neocortical transduzidas com vectores que transportam lentivirais de células específicas do tipo promotores. As culturas foram transduzidas com LV-SYN-GFP (A) ou LV-GFAP-GFP vectores (B) com uma MOI de 5. Sete dias após a transdução, as células foram imunocoradas com um anticorpo anti-NeuN ou anti-GFAP. Os painéis superiores mostram fluorescência da GFP, os painéis mostram média de imunocoloração e painéis inferiores são mescladas imagens (GFP: verde; NeuN ou GFAP: vermelho).
Tabela 1. Comparação de expressão da GFP em murinos culturas neocorticais transduzidas com vectores que transportam lentivirais diferentes promotores de um.
um culturas murinos neocorticais (5 x 10 5 / poço em placas de 24 poços) foram transduzidas com LV-SYN-GFP ou LV-GFAP-GFP a uma MOI de 5. Sete dias após a transdução, as culturas foram fixadas e imunocoradas para NeuN ou GFAP. O número de GFP e NeuN / GFAP células que expressam foram contados em imagens a partir de 10 campos por condição experimental. Os valores representam a percentagem de neurónios (NeuN + células) ouastrócitos (GFAP + células) que também expressaram o gene repórter da GFP. Os valores apresentados são médias ± DP de três experimentos independentes.
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Discussion
Neste protocolo, nós mostramos a produção de lentivirais e aplicação destes vectores em culturas neocorticais. Nós demonstramos eficiente e de células de transdução de tipo específico com os vectores produzidos por estes métodos. Quando o promotor sinapsina é usado, a expressão da GFP é estritamente neurónio específico. Quando o promotor GFAP é usado, expressão da GFP é exclusivamente em astrócitos. Se nenhuma célula expressão de tipo específico é requerido, um promotor ubíqua pode ser usado. Encontramos tanto ubiqutin e fosfoglicerato quinase (PGK) promotores podem conduzir a expressão de genes de alto nível em culturas neocorticais 6. A expressão do gene dirigida por lentivirais pode ser personalizado para níveis específicos de tipos de expressão ou célula por escolha de promotores (por exemplo, ubíqua ou célula de tipo específico) ou usando diferentes proteínas de envelope ou pseudotipos vector para atingir tecidos específicos ou aplicações. Por exemplo, pseudotyping com a proteína G da raiva ou uma fusão de VSV-G umad proteína raiva suporta o transporte axonal retrógrado 19,20. O protocolo de transfecção transiente permite embalagem vector com diferentes proteínas de envelope.
Lentivirais são comumente concentrada por ultracentrifugação sem passos de purificação. Estes vectores não purificados são adequados para muitos tipos de células. No entanto, culturas primárias neuronais são sensíveis aos contaminantes a partir de células produtoras, resultando em variação entre lotes para a citotoxicidade. A 20% de sacarose passo de purificação almofada faz com que os vectores de forma consistente não-tóxico em neurónios primários. Recomendamos o uso de vetores purificados para a transdução de neurônios primários e injeção em animais. Se escala maior ou maior grau de pureza de preparações de vector são necessários, técnicas de purificação, tais como cromatografia de afinidade e 21 de permuta de aniões da membrana cromatografia 22 pode ser utilizado. Como de longo prazo de transdução é geralmente necessária em culturas primárias neuronais, Cuidado especial deve ser tomado para minimizar a contaminação durante a preparação dos vetores. Passando o sobrenadante vetor com filtro de 0,2 mM e usando tubos de centrífuga autoclaváveis polialómero durante a concentração do vetor vai servir a esse propósito. Garrafa-top filtros podem ser usados se um grande volume de sobrenadante necessita de ser filtrada. Butirato de sódio tem sido relatado para estimular a actividade de promotores 23. A adição de butirato de sódio ao meio de cultura após a transfecção das células produtoras pode aumentar o título de vector de mais de 10 pregas 24. Polybrene (Hexadimetrina brometo) tem sido largamente utilizado para protocolos de transferência de genes para aumentar a eficiência da transferência de genes retroviral por neutralizar as cargas negativas, facilitando assim o vector para células de interacção 25. Em nossas mãos, polibrene é tóxico para os neurônios em culturas neocorticais. Portanto, polibreno deve ser evitado em transdução de culturas primárias neuronais. Se não houverum repórter fluorescente no vector, é conveniente para determinar o título de vector por análise de FACS. Quando não está disponível ou repórter um gene repórter é accionado por um promotor específico qPCR tecido, para a detecção de integração do vector nas células alvo deve ser uma melhor escolha como a integração do vector é independente da expressão do transgene. O título de vectores específicos determinados por análise de FACS será menor do que a de qPCR como nem todas as cópias integradas do vector são funcionais. Os títulos vector pode ser também determinada por medição do HIV proteína p24 por Elesa ou genómico vector de ARN por qRT-PCR em preparações de vector. No entanto, estes métodos são menos precisas, devido ao número significativo de partículas virais defeituosos inevitavelmente gerados durante o processo de embalagem e as partículas funcionais que não com êxito transduzir células alvo 26. Os vectores feitas por este protocolo ter sido usado com sucesso em ambos in vitro e in vivo em rocérebro dente 27. Investigadores deve testar nos seus sistemas individualmente, como vector de expressão do gene mediada por não é necessariamente idênticas em culturas de células e em sistemas in vivo, mesmo no mesmo tipo de célula 6,28. Lentivirais têm sido amplamente utilizados para superexpressão ou derrubando genes de interesse em uma variedade de tipos de células no sistema nervoso central. O protocolo deve ser útil para os investigadores da neurociência para desenvolver lentivirais em aplicações de pesquisa.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH Neuroscience Blueprint Núcleo de subvenção (P30 NS057105, BJS) para Washington University, programa, projeto Grant NS032636 (BJS) e pelo Centro de esperança para distúrbios neurológicos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SV3001403 | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CM | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| HT1080 cells | ATCC | CCL-121 | |
| Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 1 x 3 ½ in polyallom–r centrifuge tube | Beckman Coulter Inc. | 326823 | |
| 0.2-micron syringe filter | Corning | 431219 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
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