Summary
I detta protokoll beskriver vi produktion, rening och titrering av lentivirala vektorer. Vi erbjuder ett exempel på lentivirusvektor-medierad gen leverans i primära odlade nervceller och astrocyter. Våra metoder kan också tillämpas på andra celltyper
Abstract
Effektiv gen leverans i centrala nervsystemet (CNS) är viktigt att studera genfunktioner, modellering neurologiska sjukdomar och utveckla terapeutiska metoder. Lentivirala vektorer är attraktiva verktyg i transduktion av nervceller och andra celltyper i CNS, eftersom de transducera både delande och icke-delande celler, stödja hållbar uttryck av transgener, och har relativt stora förpackningar kapacitet och låg toxicitet 1-3. Lentivirala vektorer har använts med framgång i transduktion av många neurala celltyper in vitro 4-6 och i djur 7-10.
Stora ansträngningar har gjorts för att utveckla lentivirala vektorer med förbättrad biologisk säkerhet och effektivitet för genavgivning. De nuvarande tredje generationens replikationsdefekta och själv-inaktiverande (SIN) lentivirala vektorer visas i figur 1. De nödvändiga elementen för vektor förpackningar är uppdelade i fyra plasmider. I lentivirala tränsFER-plasmiden, är U3-regionen i 5 'långa terminala upprepningen (LTR) ersattes med en stark promotor från ett annat virus. Denna modifiering tillåter transkription av vektorsekvensen oberoende av HIV-1 Tat-protein som normalt krävs för HIV-genexpression 11. Packningssignalen (Ψ) är väsentlig för inkapsidering och den rev-responsiva elementet (RRE) krävs för att producera höga titrar vektorer. Den centrala tarmkanalen polypurin (cPPT) är viktigt för nukleära importen av vektorns DNA, en egenskap som krävs för att omvandla icke-delande celler 12. I 3 'LTR, är de cis-regulatoriska sekvenser fullständigt avlägsnas från U3-regionen. Denna deletion kopieras till 5 'LTR efter omvänd transkription, vilket resulterar i transkriptionell inaktivering av båda LTR. Plasmiden pMDLg / pRRE innehåller HIV-1 gag / pol-gener, vilka ger strukturella proteiner och omvänt transkriptas. pRSV-Rev kodar för rev, som binder till RRE för effektiv RNA-export från kärnan. pCMV-G kodardet vesikulära stomatitvirus glykoprotein (VSV-G) som ersätter HIV-1 env. VSV-G utökar tropism av vektorerna och tillåter koncentration via ultracentrifugering 13. Alla gener som kodar för de accessoriska proteiner, inklusive Vif, Vpr, Vpu, och Nef är uteslutna i förpackningssystemet. Framställning och manipulering av lentivirala vektorer bör utföras enligt NIH riktlinjer för forskning involverar rekombinant DNA ( http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). Ett godkännande från enskilda institutionella Biologisk och kemisk säkerhet kommittén kan krävas innan lentivirala vektorer. Lentivirala vektorer framställs vanligen genom samtransfektion av 293T-celler med lentivirala överföring plasmiden och de plasmider hjälpar som kodar för de proteiner som krävs för vektorn förpackning. Många lentivirala överföring plasmider och plasmider hjälpar kan erhållas från Addgene, en ickeVinstdrivande plasmid arkiv ( http://www.addgene.org/~~V ). Några stabila förpackningar cellinjer har utvecklats, men dessa system ger mindre flexibilitet och deras förpackningar verkningsgrad generellt minskar över tid 14, 15. Kommersiellt tillgängliga transfektion kit kan stödja hög effektivitet i transfektion 16, men de kan bli mycket dyrt för stora förberedelser skala vektor. Kalciumfosfatfällning metoder ger mycket effektiv transfektion av 293T-celler och därmed ge en tillförlitlig och kostnadseffektiv metod för lentivirusvektor produktion.
I detta protokoll, producerar vi lentivirala vektorer genom samtransfektion av 293T-celler med fyra plasmider baserade på kalciumfosfatutfällningsmetoden princip, följt av rening och koncentration med ultracentrifugering genom en 20% sackaros kudde. Vektor titrar bestämdes genom fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) analysis eller genom realtid qPCR. Produktion och titrering av lentivirala vektorer i detta protokoll kan vara klar med 9 dagar. Vi tillhandahåller ett exempel av transducerande dessa vektorer in i murina hjärnbarkens kulturer innehållande både neuroner och astrocyter. Vi visar att lentivirala vektorer stödja höga effektivitet transduktion och celltyp-specifik genexpression i primära odlade celler från centrala nervsystemet.
Protocol
1. Förpackning av lentivirala vektorer
Lentivirala vektorer framställs genom samtransfektion av en lentiviral överföringsvektor och andra plasmider som krävs för förpackning i 293T-celler genom kalciumfosfat-transfektion metod. Vi använder 10 100-mm vävnadsodlingsskålar i detta protokoll. Det kan skalas upp eller ner beroende på tillämpningarna. Den 293T cellinjen bibehölls i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med hög glukoshalt (4500 mg / L), kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 enheter / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin i 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Seed 293T-celler vid 30-40% konfluens och 10 100-mm vävnadsodlingsplattor (3 x 10 6 celler / skål) i odlingsmedium. Återgå cellerna att inkubator.
- Efter 20-24 h-kulturen, kontrollera celltätheten. Cellerna bör vara ca 80% konfluens vid tidpunkten för transfektion.
- Framställ en 50-ml rör. Tillsätt 4,4 ml TE79/10 (1 mM Tris-HCl, 0,1 mMEDTA, pH 7,9) minus den totala volymen av följande plasmid-DNA. Tillsätt 100 | ig lentivirala överföring plasmiden (Figur 1), 58 | ig pMDLg / pRRE, 31 | ig pCMV-G, 25 | ig pRSV-Rev, 600 | il 2 M CaCl2. Blanda försiktigt.
- Förbered en 50-ml rör. Tillsätt 5 ml 2X HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl, 1,5 mM Na2 4 HPO, pH 7,12).
- Ta DNA-CaCl2-blandning av 10-ml pipett och tillsätt till röret innehållande 2 x HBS, droppvis under rotation av röret.
- Hålla utfällningsreaktionen vid rumstemperatur (RT) under 30 minuter.
- Ta bort odlingsskålarna från inkubator. Blanda utfällningsreaktionen väl genom skakning. Tillsätt 1 ml suspension till varje 100 mm-skål innehållande celler. Suspensionen skall tillsättas långsamt, droppvis under försiktig omvirvling mediet i skålen. Återgå dessa rätter till inkubatorn och låt stå i 5 timmar.
- Avlägsna mediet från kulturen. Tillsätt 6 ml färskt odlingsmedium innehållande 6 bu mM natriumtyrate till varje skål. Returnera kulturer inkubator. Efter odling över natten, om det finns en fluorescerande reporter i konstruktionen, kontrollera expressionen reportergen under fluorescensmikroskop. Vanligen över 80% av cellerna uttrycker reportergenen om den är driven av en allestädes närvarande promotor (t.ex. CMV-promotor).
- Två dagar (40-44 h) efter transfektion supernatanten från 10 skålar i 2 50-ml rör (ca 30 ml varje rör). Frys supernatanten vid -80 ° C frys eller gå till nästa steg.
2. Koncentration och rening av vektorerna
- Centrifugera nyligen uppsamlat eller upptinat supernatanten vid 900 g (cirka 2000 rpm) under 10 minuter för att avlägsna eventuella cellrester i supernatanten.
- Fästa en 60-ml spruta till en 0,2 ^ m SFCA sprutfilter. Överför supernatanten från 50-ml rör vid sprutan. Filtrera supernatanten till en polyallomer centrifugrör.
- Ta 5 ml 20% sackaros (framställd i PBS) i en 5-ml pipett. Sättpipetten till botten av centrifugröret innehållande supernatanten. Tillsätt långsamt sackaros lösningen under vektorn supernatanten. Upprepa dessa steg för supernatanten från en annan rör.
- Centrifugera supernatanten vid 11 tusen varv per minut och 4 ° C under 4 h med Beckman SW28 rötor sving.
- Avlägsna supernatanten. Tillsätt 150 pl 4% Laktos (framställd i PBS) till varje centrifugrör. Återsuspendera pelleten.
- Överföra den koncentrerade vektorn från alla centrifugrör till en 1,5 ml-rör. Lämnar röret på is under 15 minuter.
- Blanda vektorn suspensionen genom pipettering. Snurra med mikrocentrifug vid full hastighet (ca 16000 g) under 1 minut.
- Överför supernatanten till ett nytt 1,5-ml rör. Dela den slutliga provet i 20 pl alikvoter och lagrades dem i -80 ° C frys.
3. Titrering av de vektorer
- Frö 5 x 10 4 / brunn av HT1080-celler i 12-brunnars platta i 1 ml DMEM-medium kompletterat med 10% FBS.
- Efter overnight kultur, räknar celler från en brunn och gör det mobilnummer.
- Göra 5-faldig serieutspädning (1:5, 1: 25; 1:125 och 1:625) av den koncentrerade vektorn med odlingsmedium. Lägger jag pl av varje utspätt vektor till separata brunnar. Proverna kan kopieras för att öka noggrannheten.
- Tillsätt 1 pl 4 mg / ml Polybrene (hexadimetrinbromid) i varje brunn innehållande vektorn och in i en brunn utan vektor. Blanda genom att försiktigt skaka plattan. Återgå till inkubatorn under 48 timmar.
- Avlägsna mediet från brunnarna cellodlingssystem. Tvätta varje brunn med PBS. Tillsätt 250 pl 1 x trypsin-EDTA-lösning till cellerna. När cellerna lösgörs (3-5 min), tillsätt 1 ml odlingsmedium. Resuspendera cellerna genom pipettering. Överföra cellsuspension till 1,5 ml centrifugrör.
- Centrifugera vid 900 g under 6 minuter. För vektorer med en fluorescerande reporter gen (t.ex. GFP), gå till steg 3,7 för FACS-analys. För vektorer utan en reporter, går du till steg 3,8 i realtid qPCR.
- För vektorer innehållande en fluorescent reportergen, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten med 300 pl av 3,7% formaldehyd i PBS. Bestämma procenttalet av reporteradaptorerna positiva celler genom FACS-analys. Titern kommer att representeras som transduktion enheter per milliliter koncentrerad vektor (TU / ml).
Till exempel om 1 x 10 5-celler transducerade med 1/25 | il (0,04 | il) vektor och 30% celler är reportern positivt kommer titer vara:
Använd endast de spädningar faller i ett linjärt förhållande mellan andelen positiva celler och mängden av vektor till att beräkna titer. Den slutliga titern bör vara ett medelvärde av de titrar som erhölls från transduktioner med minst 2 olika mängder av vektorn.
- För vektorer utan enfluorescerande reportergen, extrahera DNA från HT1080 celler med hjälp av QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) enligt tillverkarens protokoll. Amplifiera vektor-sekvens i genomiskt DNA med användning av ABI Prism 7000-systemet Sequence Detection (Applied Biosystems) med primrar (i HIV-1 PBS / psi regionen 17) 5'-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 'och 5'-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3', och TaqMan-prob 5 '-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3'. Albumin-gen som är en enkelkopiegen i genomet (2 kopior per cell) tillsattes också amplifieras med primers 5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 'och 5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3', och sonden 5'-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3 "som en intern kontroll. Bestämma antalet kopior av vektorn och albumin genom PCR i 96-brunnars platta enligt tillverkares instruktioner med följande program: 50 ° C under 2 min, 95 ° C under 10 min och 35 cykler av 95 ° C under 15 sek och 60 ° C under 2 min. Tiofaldiga serieutspädningar av plasmider av känd koncentration (representerat som kopiaAntalet) innehållande templatsekvenser bör också amplifieras för att skapa en standardkurva för kvantifiering av okända prover. Titern kommer att representeras som integration enheter per milliliter koncentrerad vektor (IE / ml).
4. Transduktion av hjärnbarkens kulturer
Hjärnbarkens kulturer innehållande både neuroner och glia, framställs från mus cortex med användning av en tvåstegs-plätering förfarande som tidigare beskrivits 18. Neocortices erhållna från fetala möss vid 14-16 dagars havandeskap stryks ut på en tidigare etablerad glia monoskikt i MEM kompletterat med 10% FBS, 20 mM glukos och 2 mM glutamin i 24-brunnars vävnadsodlingsplatta.
- Efter 5 dagar in vitro, tillsätt 10 | iM cytosinarabinosid (Ara-C) i neocortical kultur för att inhibera icke-neuronala celldelning. Fortsätta odla cellerna under 2 dagar.
- Varm odlingsmedium i 37 ° C vattenbad under 5-10 min. Ersätta Ara-C-innehållande mediet med färskt odlingsmedium (500 | il / brunn).
- Tillsätt vektor med önskad MOI (multiplicitet av infektion, är förhållandet mellan antalet vektorpartiklar till antalet målceller) till odlingen. Fortsätta odling under 24 timmar. Vi använder MOI av 1-10 (vanligen 5) i primära kortikala kulturer.
- Ersätta odlingsmediet med färskt medium. Fortsätt kultur. Om det finns en reportergen i vektorkonstruktionen, ta celler under fluorescensmikroskop 2 dagar efter transduktion. Reportergenuttryckning kommer att vara synlig i neuroner 2-7 efter transduktion, beroende på vektorn konstruktion och den använda dosen.
5. Representativa resultat
De titrar av lentivirala vektorer som framställts med detta protokoll område 10 8 -10 10 IU / ml, which är lämplig för transduktion av en mängd olika celltyper från CNS både in vitro och in vivo. Tabell 1 och figur 2 visar ett representativt resultat med användning av de vektorer som produceras av detta protokoll. Vi transducerade murina hjärnbarkens kulturer med lentivirala vektorer som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) som styrs av synapsin (SYN) promotor eller gliafibrillärt surt protein (GFAP)-promotorn. Sju dagar efter transduktion, utförde vi immunfärgning för att märka neuroner och astrocyter med anti-Neun och anti-GFAP-antikroppar, respektive. Såsom visas i tabell 1 och fig.. 2A, efter transduktion med vektorn som bär synapsin promotorn, över 90% av neuronerna (Neun +-celler) uttrycker GFP, och inga astrocyter (GFAP +-celler) uttrycka denna reportergen. När GFAP-promotor används i vektorkonstruktionen (fig. 2B), ca 80% av astrocyter (GFAP +-celler) uttrycks GFP, alla GFP + celler är astrocyter som bekräftas av samlokalisering med GFAP och avsaknaden av GFP uttryck i Neun-märkta celler. Dessa resultat visar att lentivirala vektorer är mycket effektiva för att leverera transgener i celler från CNS och cellspecifik genexpression uppnås när lämpliga promotorer används.
Figur 1. Schematisk representation av HIV-baserade lentivirala vektorer och de plasmider förpackningar. HIV-1-provirus visas längst upp. Elementen för vektorproduktion är separerade i fyra olika plasmider. Den lentivirala överföring Plasmiden innehåller en hybrid 5 'LTR i vilken U3-regionen är ersatt med cytomegalovirus (CMV)-promotorn, packningssignalen (ψ), RRE-sekvensen, den centrala tarmkanalen polypurin (cPPT), en gen av intresse (t.ex. en fluorescerande reporter) tillsammans med en promotor som väljs och den 3 'LTR i vilkencis-regulatoriska sekvenser fullständigt avlägsnas från U3-regionen. pMDLg / pRRE innehåller den gag-och pol-generna och RRE-sekvensen från HIV-1 under kontroll av CMV-promotorn. pRSV-Rev innehåller den kodande sekvensen för Rev-driven av RSV-promotom. pCMV-G innehåller VSV-G-protein-gen under kontroll av CMV-promotorn. PA indikerar polyadenyleringssignalen från human β-globingenen.
Figur 2. Expression av reportergener i mus neokortikal blandad kultur transducerade med lentivirala vektorer som bär celltypsspecifika promotorer. Kulturerna transducerade med LV-SYN-GFP (A) eller LV-GFAP-GFP-vektorer (B) vid en MOI av 5. Sju dagar efter transduktion, cellerna immunfärgades med anti-Neun eller anti-GFAP-antikropp. Övre paneler visar GFP fluorescens, mellersta paneler visar immunfärgning och lägre panelerna är ihop bilder (GFP: grön, Neun eller GFAP: röd).
Tabell 1. Jämförelse av GFP-uttryck i murina hjärnbarkens kulturer omvandlade med lentivirala vektorer som bär olika promotorer en.
a Murina hjärnbarkens kulturer (5 x 10 5 / brunn i 24-brunnars platta) transducerades med LV-SYN-GFP eller LV-GFAP-GFP vid en MOI av 5. Sju dagar efter transduktion, fixerades kulturerna och immunfargades med avseende på Neun eller GFAP. Antalet GFP-och Neun / GFAP-uttryckande celler räknades i bilderna från 10 fält per experimentell betingelse. Värdena representerar den procentuella andelen av neuroner (Neun +-celler) ellerastrocyter (GFAP +-celler) som också uttrycks av genen GFP rapportörgen. De visade värdena är medelvärden ± SD från tre oberoende experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll, har vi visat produktion av lentivirala vektorer och tillämpningen av dessa vektorer i hjärnbarkens kulturer. Vi visat effektiv och celltyp-specifik transduktion med vektorerna som framställts med dessa metoder. När synapsin promotor används, är uttryck av GFP strikt neuronspecifika. När GFAP-promotor används, är GFP-uttryck uteslutande i astrocyter. Om ingen celltyp-specifik expression önskas, kan en allestädes närvarande promotor användas. Vi funnit ubiqutin och fosfoglyceratkinas (PGK) promotorer kan driva hög expressionsnivå genen i hjärnbarkens kulturer 6. Genexpression drivs av lentivirala vektorer kan anpassas för specifika nivåer av uttryck eller celltyper genom val av promotorer (t.ex. överallt eller celltyp-specifika) eller genom att använda olika kuvert proteiner eller pseudotyper vektor för att rikta specifika vävnader eller applikationer. Exempelvis pseudotypning med rabies G-protein eller en fusion av VSV-G-end rabies protein stöder retrograd axonal transport 19,20. Den transienta transfektion protokoll gör vektor förpackningar med olika kuvert proteiner.
Lentivirala vektorer är vanligen koncentreras genom ultracentrifugering utan reningssteg. Dessa orenade vektorer är lämpliga för många celltyper. Emellertid primära neuronala kulturer är känsliga för föroreningar från producerande celler, vilket resulterar i variationen med avseende på cytotoxicitet. Den 20% sackaroskudde reningssteg gör vektorerna genomgående icke-toxiska i primära neuroner. Vi rekommenderar att du använder renade vektorer för transduktion av primära nervceller och injektion i djur. Om större skala eller högre renhet av vektorframställningar erfordras kan andra reningstekniker, såsom affinitetskromatografi 21 och anjonbytarmembran kromatografi 22 användas. Som långsiktig transduktion krävs i allmänhet i primära neuronala kulturerBör särskild försiktighet iakttas för att minimera kontaminering under beredningen av vektorer. Passerar vektorn supernatanten med 0,2 | iM filter och använda autoklaverbara rören polyallomerrör centrifugrör under koncentration av vektorn kommer att tjäna detta ändamål. Flaskan-top-filter kan användas om en stor volym av supernatanten behöver filtreras. Natriumbutyrat har rapporterats att stimulera aktiviteten av promotorer 23. Tillsats av natriumbutyrat till odlingsmediet efter transfektion av de producerande cellerna kan öka vektortiter på mer än 10 veck 24. Polybren (hexadimetrinbromid) har använts i stor omfattning för protokoll genöverförande att öka effektiviteten av retroviral genöverföring genom att neutralisera de negativa laddningarna på så sätt underlätta vektor-cellinteraktion 25. I våra händer är polybren giftigt för nervceller i hjärnbarkens kulturer. Därför bör polybren undvikas i transduktion av primära neuronala kulturer. Om det finnsen fluorescerande reporter i vektorn, är det lämpligt att bestämma den vektortiter genom FACS-analys. När ingen reportern är tillgänglig eller en reporter-gen driven av en vävnadsspecifik promotor, qPCR för detektering integrering av vektorn i målceller bör vara ett bättre val som en integrering av vektorn är oberoende av transgen expression. Titern av specifika vektorer bestäms genom FACS-analys kommer att vara lägre än den hos qPCR eftersom inte alla integrerade kopior av vektorn är funktionell. Vektor titrar kan också bestämmas genom mätning av HIV-p24-proteinet genom Elesa eller vektor genomiskt RNA genom QRT-PCR i vektorframställningar. Men dessa metoder är mindre exakta beror på det stora antalet defekta viruspartiklar oundvikligen genereras under förpackningsprocessen och de funktionella partiklar som inte lyckas transducera målceller 26. De vektorer som genom detta protokoll har använts med framgång i både in vitro och in vivo i rodent hjärnan 27. Utredarna ska testa i sina system för sig, som vektor-medierad genuttryck är inte nödvändigtvis identisk i cellkulturer och in vivo-system även i samma celltyp 6,28. Lentivirala vektorer har använts i stor utsträckning för överuttrycker eller taga isär gener av intresse i en mängd celltyper i CNS. Vår protokoll bör vara till hjälp för neurovetenskap utredarna att utveckla lentivirala vektorer i sina forskningsansökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH Neuroscience Blueprint Kärna bidrag (P30 NS057105, BJS) till Washington University, programprojekt Grant NS032636 (BJS) och av Hope Center för neurologiska sjukdomar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SV3001403 | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CM | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| HT1080 cells | ATCC | CCL-121 | |
| Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 1 x 3 ½ in polyallom–r centrifuge tube | Beckman Coulter Inc. | 326823 | |
| 0.2-micron syringe filter | Corning | 431219 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
References
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).
- Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons. J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).
- Hioki, H. Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters. Gene Ther. 14, 872-882 (2007).
- Li, M. Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells. J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).
- Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
- Blomer, U. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).
- Consiglio, A. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).
- Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).
- Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III). Science. 229, 69-73 (1985).
- Sirven, A. The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood. 96, 4103-4110 (2000).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).
- Farson, D. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).
- Broussau, S. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).
- Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro. J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).
- Mazarakis, N. D. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).
- Kato, S. Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein. Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography. BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).
- Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).
- Gasmi, M. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).
- Palsson, B., Andreadis, S. The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer. Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats. J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).
- Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo. Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).
