Summary
In dit artikel wordt eerst een procedure voor het isoleren van humane endotheelcellen van de navelstreng aderen en dan laat zien hoe deze cellen te gebruiken om neutrofielen transmigratie onderzoeken op stromingscondities. Door een laag volume stromingskamer gemaakt van een polymeer met de optische eigenschappen van glas levende cellen fluorescerende beeldvorming zeldzame celpopulaties is ook mogelijk.
Abstract
Neutrofielen zijn de meest voorkomende type witte bloedcel. Ze vormen een belangrijk deel van het aangeboren immuunsysteem 1. Tijdens de acute ontsteking van de neutrofielen, zijn de eerste inflammatoire cellen om te migreren naar de plaats van verwonding. Aanwerving van neutrofielen een blessure site is een stapsgewijs proces dat eerste, verwijding van de bloedvaten om de bloedstroom te verhogen omvat, ten tweede, microvasculaire structurele veranderingen en te ontsnappen van de plasma-eiwitten uit de bloedbaan, ten derde, walsen, adhesie en transmigratie van de neutrofielen over de endotheel en vierde accumulatie van neutrofielen op de plaats van schade 2,3. Een breed scala van in vivo en in vitro-methoden heeft ontwikkeld tot de studie van deze processen 4 mogelijk te maken. Deze methode richt zich op neutrofielen transmigratie in humane endotheelcellen.
Een populaire methode voor de behandeling van de moleculaire processen die betrokken zijn bij neutrofielen transmigratie maakt gebruik van de menselijke neutrophils interactie met primaire humane umbilicale ader endotheel cellen (HUVEC) 5. Neutrofielen isolatie is visueel elders 6 beschreven; dus dit artikel zal de methode aan te tonen voor isolatie van HUVEC. Eenmaal geïsoleerd en gekweekt tot confluentie worden endotheelcellen geactiveerd waardoor de regulatie van adhesie en activering moleculen. Bijvoorbeeld activering van endotheelcellen met cytokines, zoals TNF-α resulteert in hogere E-selectine en IL-8 expressie 7. E-selectine bemiddelt vangen en rolling van neutrofielen en IL-8 bemiddelt activering en stevige hechting van neutrofielen. Na hechting neutrofielen transmigreren. Transmigratie kan paracellularly voorkomen (door middel van endotheelcellen knooppunten) of transcellularly (via de endotheelcellen zelf). In de meeste gevallen zijn deze interacties plaatsvinden onder stroom staat in het vaatstelsel 7,8.
De parallelle plaat flow kamer is een veel gebruikt systeem dat mimics de hydrodynamische schuifspanningen gevonden in vivo en in staat stelt de studie van de neutrofielen rekrutering onder stroom staat in vitro 9,10. Verschillende bedrijven produceren parallelle plaat flow kamers en hebben elk voor-en nadelen. Als fluorescerende beeldvorming nodig is glas of een soortgelijk optisch polymeer moet worden gebruikt. Endotheelcellen niet goed groeien op glas.
Hier presenteren we een eenvoudige en snelle methode voor fase-contrast, DIC en fluorescerende beeldvorming van neutrofielen transmigratie het gebruik van een laag volume ibidi kanaal glijbaan van een polymeer die ondersteuning biedt voor de snelle hechting en de groei van menselijke endotheelcellen en heeft optische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met glas. In deze methode werden endotheelcellen gekweekt en gestimuleerd een ibidi μslide. Neutrofielen werden geïntroduceerd onder stromingscondities en transmigratie werd beoordeeld. Fluorescerende beeldvorming van de knooppunten in staat real-time bepaling van de omvang van paracellulaire versustranscellulair transmigratie.
Protocol
1. Isolatie en onderhoud van de Mens vasculaire endotheelcellen
- Niveau 2 bioveiligheid procedures moeten worden gebruikt bij het werken met menselijk bloed en weefsel. Met een schaar knippen de stekker uit de placenta en dan nauw aan het snoer te onderzoeken voor de vorming van bloedstolsels en schade veroorzaakt door het klemmen van het snoer tijdens de bevalling. Knip en gooi deze gedeelten van het snoer.
- Bereid collagenase oplossing bij 1 mg / ml door het gieten van 50 ml warme snoer buffer in een buis die 50 mg collagenase bevat.
- Verander in steriele handschoenen en open een geautoclaveerd instrument lade met gesteriliseerd stompe canules, koord klemmen, scharen, drie-weg stop-hanen en gaas in een laminaire stroming kap.
- Identificeer de twee slagaders en de gemeenschappelijke ader in de kabel. De slagaders zijn kleiner en hebben de neiging om strak ingesnoerd, terwijl de ader is groot en makkelijk te canule. Om het bloed te spoelen uit de ader, leg deze dan zachtjes een canule met een twee-weg kraantje in bijlage aan het iNTO het ene uiteinde van de ader en plaats een klem rond canule te stevig vasthoudt op zijn plaats. Perfuseren koord buffer door de ader. Herhaal dit totdat de stroom door helder is en vervolgens vast te klemmen aan het einde van het snoer.
- Perfuseren collagenase in de ader, sluit de kraan, plaatst u de stekker in een bekerglas met warm snoer buffer en incubeer gedurende 10 minuten. Na 10 minuten, verwijder het snoer en zachtjes masseren van de kabel aan endotheelcellen los te maken van het lumen van de ader. Giet de oplossing in de buis met endotheelcellen media (ECM). Spoel met koord buffer twee keer om de resterende cellen te verwijderen. Giet de oplossing in dezelfde buis.
- Centrifugeer de cellen op 350 xg gedurende 10 minuten tot pellet de endotheelcellen.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 10 ml van ECM aan de pellet. Voorzichtig de cellen opnieuw in suspensie in ECM, vervolgens over de cellen van een T75 fles pre-coated met 0,2% gelatine. Pre-coating met gelatine is gedaan ten minste 1 uur bij 37 ° C. Groei de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2.
- De volgende dag, schud de kolf te verjagen alle rode bloedcellen dan het supernatans verwijderen en wassen met gebalanceerde zoutoplossing warme Hank's (HBSS). Verwijder HBSS en voeden de cellen met 10 ml warm ECM. Onderzoek van de cellen onder de microscoop dat de rode bloedcellen werden verwijderd. Evalueer de mate van samenloop en de morfologie van de endotheelcellen. Endotheelcellen dit stadium worden verlengd met geen spoor van vacuolen.
- Ga verder naar de media te veranderen om de drie dagen tot cellen te bereiken confluentie, dan splitsen cellen met behulp van een 0,08% oplossing van trypsine met 1 mM EDTA. Plaat endotheelcellen gewenste schotels vooraf bekleed met 0,2% gelatine. De cellen moeten komen samenvloeiing in 3-6 dagen.
- Bij gebruik ibidi kamers, voorlaag elke kamer met 0,2% gelatine. Verwijder het teveel aan gelatine en fibronectine en voeg dan 1,5 x 10 6 / ml van endotheliale cellen gesuspendeerd in ECM in de kamer. Wijzig de media om de andere dag tot confluent. De cellen moeten confluerende in 2-3 dagen, afhankelijk van het snoer.
2. Voorbereiding van Neutrofielen
- Neutrofielen werden geïsoleerd uit het perifere bloed van gezonde vrijwilligers met dichtheid centrifugeren. Een gedetailleerd protocol met een visuele demonstratie voor neutrofielen isolatie zijn te vinden in de eerder nummer van dit tijdschrift 6. Eenmaal geïsoleerd hersuspenderen neutrofielen in een concentratie van 1x10 6 / ml in HBSS met 0,5% menselijk albumine.
3. Het instellen van de Ibidi Kamer
- Groei endotheelcellen in een gelatine beklede ibidi kamer. Onderzoek ze elke dag met behulp van fase-contrast-microscopie tot ze stevig confluent.
- Stimuleren endotheelcellen de expressie van adhesie en activering moleculen te verhogen. Voor de toepassing van dit protocol werden endotheelcellen gestimuleerd met 10 ng / ml recombinant TNF-α gedurende vier uur bij 37 ° C en 5% CO
- Bereid de microscoop, en spuit pomp als visueel beschreven door Wiese en collega's 11 met gebruik van een lege ibidi kamer.
- Belangrijkste verschillen tussen dit protocol en de Wiese procedure onder meer het vooraf invullen van de slang om de blootstelling van de endotheelcellen aan de lucht te voorkomen, het handhaven van de buffer bij 37 ° C met behulp van een waterbad, met behulp van PharMed slang aan op de buffer te houden van het verliezen van de temperatuur en het gebruik van verschillende doelstellingen met betrekking tot de microscoop, afhankelijk van de vraag of beeldvorming met fase-contrast of fluorescentie.
- Zodra de microscoop is ingesteld en de slang is gevuld met HBSS, sluit u alle kranen en verwijder de lege ibidi kamer.
- Sluit de ibidi kamer met TNF-α endotheelcellen gestimuleerd om de slang.
4. Neutrofielen Werving en Transmigratie
- Visualiseer de endotheelcellen monolaag in de Microscopa met een 10x fasecontrast doelstelling.
- Stel de spuitpomp te trekken en beginnen de stroom van HBSS op de gewenste schuifspanning (typisch tussen 0,5 tot 2 dyn / cm 2).
- Aan de inlaatzijde, overstap van HBSS naar geïsoleerde neutrofielen (1x10 6 / ml) door te draaien aan de drie-weg stop-pik.
- Begin met opnemen met behulp van een CCD-camera ofwel aangesloten op een DVD-recorder of rechtstreeks aangesloten op de computer. Start de timer als neutrofielen in te voeren de kamer. Perfuseren neutrofielen gedurende vier minuten. Een totaal van 3 ml van de neutrofielen vering is voldoende voor een enkel experiment.
- Na vier minuten, ga terug naar HBSS naar de bijlage van nieuwe neutrofielen te voorkomen. Indien gegevens voor de totale interactie, rollen en stevige adhesie gewenst zijn, afbeelding 6 willekeurige velden voor 10 seconden met een 10x fase-contrast tussen objectieve minuten 4 en 5.
- Schakel over naar een 40x objectief en neem een gezichtsveld tussen de 5 en 10 minuten. Op 10 minuten, het verzamelen vantussen 5 en 10 willekeurig gezichtsveld.
- Stop de stroom en ga naar de volgende kamer.
5. TL-beeldvorming onder Flow omstandigheden met behulp van een Ibidi Kamer
- Label een endotheelcellen of neutrofielen een fluorescerende van belang. Bijvoorbeeld kan een anti-VE-cadherine antilichaam geconjugeerd aan Alexa-[547] worden gebruikt endotheelcellen knooppunten visualiseren.
- Monteer ibidi kamer op een microscoop met differentieel interferentie contrast (DIC) en fluorescerende mogelijkheden. We gebruiken een FluoView 1000 confocale (Olympus) met een klimaatkamer. Focus volgens een objectieve ontworpen DIC en fluorescerende werk.
- Acquire gelijktijdige DIC en tl-beelden met behulp van software van leverancier, terwijl na het tijdsverloop beschreven in hoofdstuk 4.
6. Analyse van de neutrofielen Recruitment
- Analyse van de rol-en interactie-cellen wordt beschreven door Wiese et al. 11. Het percentage neutrofielen rollen op endotheel monolaag tellen van het aantal neutrofielen meer dan een celdiameter zijn verplaatst in een periode van 5 seconden gemeten. Deel dit getal door het totaal aantal witte bloedcellen in het veld om het percentage van het rollend cellen te bepalen. Bij uitbreiding, worden de resterende cellen beschouwd stevig aanhanger.
- Meet het rollen snelheid van neutrofielen door het berekenen van de afstand die de neutrofielen aflegt in een bepaalde periode en dan delen door dat de tijd in seconden.
- Transmigratie wordt bepaald door het aantal van neutrofielen die veranderd vorm en migreren onder de monolaag 10. Deze neutrofielen worden geïdentificeerd door het feit dat zij veranderen van fase helder wanneer op de monolaag op dat fase donker wanneer onder de monolaag 10. Het aantal transmigrated cellen uitgedrukt als percentage van de totale cellen in het beeldveld of als grondstof verdoofder van transmigrated cellen per oppervlakte-eenheid. In dit model systeem typisch 50% van neutrofielen transmigreren na 10 minuten.
7. Representatieve resultaten
Ongestimuleerde endotheelcellen bieden geen ondersteuning voor neutrofielen rekrutering. In tegenstelling, het stimuleren van endotheelcellen met TNF-α resulteert in neutrofielen rollende, stevige adhesie en transmigratie. Een voorbeeld van deze gegevens in de figuren 1 en 2. Figuur 1A toont neutrofielen interactie met TNF-α-gestimuleerde endotheelcellen. Deze interacties worden gekwantificeerd, waaruit het aantal neutrofielen interactie met de endotheelcellen en het aantal rollen neutrofielen, stevig aanhanger of transmigrated (figuur 2). Neutrofiel transmigratie kan op cel kruispunten of via de endotheelcellen zelf. Om onderscheid tussen deze twee voorwaarden worden endotheelcellen voorzien van een anti-VE-c adherin antilichaam en transmigratie wordt gescoord als zich paracellularly of transcellularly (Figuur 1B en C). In dit model vrijwel alle transmigratie is paracellulaire 7.
Figuur 1. Gelijktijdig DIC en fluorescentie beeldvorming onder stromingscondities met behulp van een ibidi kamer. (A) DIC beeld vers geïsoleerde menselijke neutrofielen migreren over humane navelstreng endotheelcellen. De gele pijl toont een aanhanger neutrofielen, de witte pijlpunt toont een verhuizende neutrofielen. (B) endotheelceldichtheid verbindingen werden gekleurd met een anti-VE-cadherine antilichaam geconjugeerd aan Alexa-[547] en afgebeeld. (C) Toont overlay van kanaal A en B waaruit blijkt dat vrijwel alle verhuizende in dit model paracellulaire is. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Endotheelcellen werden ongestimuleerd gelaten of gestimuleerd werden met 10 ng / ml TNF-α. Na 4 uur werd een parallel flow chamber plaat gemonteerd en neutrofielen werden geperfuseerd over op een dyn / cm 2. (A) Neutrophil interacties werden onderzocht en gemeten met behulp van ImageJ software van NIH. De totale interactie cellen werden gekarakteriseerd als (B) rollen, goed hechtende of (C) verhuizende. Gegevens stellen het gemiddelde + SEM van 3 tot 5 experimenten. Het verschil tussen de controle en TNF in panelen A en C was significant (p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onderzoekers hebben routinematig gebruikt endotheelcellen van verschillende vasculaire bedden tot neutrofielen werving en transmigratie te bestuderen. Voorbeelden omvatten, maar zijn niet beperkt tot, dermale microvasculaire endotheliale cellen 12, lever sinusoïdale endotheelcellen 13 en endotheelcellen van humane umbilicale ader 10. Onder hen HUVEC opgedaan grote populariteit vanwege hun relatieve gemak van isolatie en beschikbaarheid. HUVEC zijn een krachtig in vitro model systeem dat veel endotheliale processen die zich in vivo nabootst. Dit model systeem heeft bijgedragen tot de identificatie van adhesiemoleculen en chemokinen cruciaal in de werving van een groot aantal leukocyten subklassen en enabled gedetailleerde analyse van hoe deze processen worden geregeld. In vitro werk met HUVEC vormde de basis voor in-vivo studies die uiteindelijk hebben een beter begrip en behandeling van menselijke ziekten 14.
e_content "> In dit artikel presenteren wij een snelle en eenvoudige methode om neutrofielen rekrutering in vitro met behulp van een ibidi stroomkamer te bestuderen. Dit soort kamer heeft een aantal voordelen ten opzichte van andere parallelle plaat kamers die eerder in dit tijdschrift 11. Ibidi kamers zijn opgebouwd uit een polymeer met optische kenmerken die vergelijkbaar zijn met glas dat in staat stelt de gebruiker in fluorescerende en DIC foto's te nemen in aanvulling op fase-contrast beelden. Er zijn kamers die dekglaasjes gebruiken om fluorescerende beeldvorming mogelijk te maken, maar groeiende endotheelcellen op glas is een uitdaging als de hechting eigendom van deze cellen te veranderen sterk op een glazen ondergrond 15. Endotheelcellen goed aan kunststof oppervlak, maar fluorescentie beeldvorming op plastic oppervlak is niet haalbaar. Met behulp van de ibidi μ schuift niet alleen een einde aan deze problemen, maar ook zij vereisen veel minder monster volume dan de andere methoden . Deze dia's ook in staat stellen gelijktijdig parallelle experimenten met slechts geringe modificatie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Dr Pina Colarusso en de live cell imaging faciliteit voor hun hulp bij beeldvorming en beeldanalyse, mevrouw Lailey voor haar technische bijstand, en eenheid 51 aan de voet Hospital in Calgary, AB voor het verstrekken van de menselijke navelstrengen. Dr KD Patel is een Alberta innoveert: Health Solutions Scientist. Dit werk werd ondersteund door een exploitatiesubsidie van de Canadese Institutes for Health Research en uitrusting en infrastructuur subsidies van de Canadese Stichting voor Innovatie en de Alberta Wetenschap en Onderzoek Autoriteit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
