Summary
이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.
Abstract
Neutrophils는 백혈구 중 가장 풍부한 타입입니다. 그들은 타고난 면역 시스템 1의 필수적인 부분을 형성합니다. 급성 염증 동안, neutrophils는 부상의 사이트로 마이 그 레이션하는 최초의 염증 세포가 있습니다. 전체 호중구의 세 번째 압연, 접착력과 윤회이고 두 번째는 microvascular 구조적 변화와 혈류에서 혈장 단백질 탈출, 부상 사이트에 neutrophils의 채용은 혈액 흐름을 증가 혈관이 먼저 팽창을 포함 stepwise 과정입니다 내피, 부상 2,3의 사이트에 neutrophils의 및 네 번째 축적. 생체내 및 시험 관내 방법의 다양한는 이러한 프로세스 4의 연구를 활성화하는 진화하고있다. 이 방법은 인간의 내피 세포에 걸쳐 호중구 윤회에 초점을 맞추고 있습니다.
호중구 윤회에 관련된 분자 프로세스를 검사 하나는 인기있는 방법은 인간의 N을 활용기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 5 상호 작용 eutrophils. 호중구 격리는 다른 여섯 시각적으로 설명하고, 따라서이 문서는 HUVEC의 격리를 위해 방법을 보여줍니다. 일단 격리와 합류로 성장, 내피 세포 부착 및 활성화 분자의 upregulation 결과적으로 활성화됩니다. 예를 들어, 증가 E-selectin 및 IL-8 표현 7의 TNF-α 결과 같은 크린 시토킨와 내피 세포의 활성화. E-selectin의 mediates neutrophils과 IL-8 mediates 활성화와 neutrophils의 확고한 유착의 캡처 및 압연. 유착 neutrophils은 윤회하다 후에. 윤회가 (내피 세포 자체를 통해) transcellularly paracellularly 발생 (내피 세포 분기점을 통해) 또는 수 있습니다. 대부분의 경우 이러한 상호 작용은 vasculature 7,8에서 발견 유동 조건에서 발생합니다.
병렬 플레이트 흐름 챔버는 널리 사용되는 시스템입니다 MI유체 전단은 생체내에서 발견하고 체외 9,10에서 유동 조건하에 호중구 채용의 학습을 가능하게합니다. 강조 마이크 몇몇 기업들은 병렬 플레이트 흐름 챔버를 생성하고 각각 장점과 단점이 있습니다. 형광 이미징이 필요한 경우, 유리 또는 광학 유사한 폴리머가 사용해야합니다. 내피 세포는 유리에 잘 성장하지 않습니다.
여기 급속한 접착력과 인간 내피 세포의 성장을 지원하며 비교할 수있는 광학 자질이 있는지 폴리머로 만들어진 낮은 볼륨 ibidi 채널 슬라이드를 사용하여 호중구 윤회의 위상 대비, DIC 및 형광 이미징을위한 쉽고 빠른 방법을 제시 유리. 이 방법에서는 내피 세포 성장되었으며 ibidi의 μslide에 자극. Neutrophils는 유동 조건에서 소개되었으며 윤회가 평가되었다. 분기점의 형광 이미징은 대 paracellular의 범위에 실시간 결정을 활성화transcellular 윤회.
Protocol
1. 인간 혈관 내피 세포의 분리 및 유지 보수
- 인간의 혈액과 조직과 함께 작업할 때 수준 2 biosafety 절차를 사용해야합니다. 이용 가위는 태반에서 탯줄을 절단하고 긴밀하게 혈전 및 납품 중에 코드를 클램핑하여 발생한 손상에 대해서는 코드를 검사합니다. 잘라 및 코드의이 부분을 버리고.
- 50 MG의 collagenase를 포함 튜브로 따뜻한 코드 버퍼의 50 ML을하고 있는걸 1 밀리그램 / ML에서 신선한 collagenase 용액을 준비한다.
- 멸균 장갑으로 변경하고 소독 무딘 cannulas, 코드 클램프, 가위, 세 방식 중지 - 자지와 층류 후드에 거즈를 포함하는 autoclaved 악기 트레이를 엽니다.
- 두 동맥과 탯줄에있는 단일 정맥 선물을 식별합니다. 동맥은 소규모이며 정맥이 크고 cannulate하기 쉬운 반면, 꽉 죄이고 경향이 있습니다. 정맥에서 혈액을 플러시하려면 부드럽게에 연결된 양방향 꼭지로 정맥을 삽입 전위치에 단단히 붙잡아 정맥 주위에 클램프 정맥 및 장소 니면 한쪽 끝을. 정맥을 통해 코드 버퍼를 Perfuse. 을 통해 흐름이 명확해질 때까지 반복하고 코드의 끝을 클램프.
- 정맥에 Perfuse collagenase는 꼭지를 닫고 10 분 정도 따뜻한 코드 버퍼와 부화를 포함 비커에 코드를 넣습니다. 십분 후에 코드를 제거하고 부드럽게 혈관의 루멘에서 내피 세포를 느슨하게하기 위해 코드를 마사지. 내피 세포 미디어 (ECM)를 포함하는 튜브에 솔루션을 드레인. 두번 남아있는 세포를 제거하는 코드를 버퍼로 플러시. 같은 튜브에 솔루션을 드레인.
- 펠렛까지 10 분 내피 세포 350 XG에 세포를 원심 분리기.
- 표면에 뜨는를 제거하고 펠릿으로 ECM의 10 ML에 추가합니다. 부드럽게 ECM에서 세포를 resuspend 다음, 0.2 % 젤라틴으로 미리 코팅 T75 플라스크에 세포를 전송합니다. 젤라틴과 사전 코팅은 37 ° C.에 최소 1 시간 동안 완료되었습니다 37에서 세포를 성장 ° C에서 5% 2를 공동.
- 다음날 부드럽게하는 적혈구 그때 뜨는을 제거하고 따뜻한 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)로 씻어 꺼내려 플라스크를 흔들. HBSS를 제거하고 따뜻한 ECM의 10 ML과 세포를 먹이. 적혈구가 제거되었는지 확인하기 위해 현미경으로 세포를 검사합니다. 내피 세포의 합류 조직 형태의 정도를 평가하십시오. 이 단계에서 내피 세포 vacuoles의 흔적으로 늘어나지해야합니다.
- 세포가 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 트립신의 0.08 % 용액을 사용 confluency 후 분할 세포에 도달할 때까지 매 사흘 미디어를 변경하려면 계속합니다. 원하는 요리 플레이트 내피 세포는 0.2 % 젤라틴으로 미리 코팅. 세포 3~6일에 합류에 도달해야합니다.
- 0.2 % 젤라틴으로 각각의 챔버 ibidi 챔버, 프리 코트를 사용하는 경우. 제거를 초과 1.5 X 챔버에 ECM에 정지 내피 세포의 10 6 / ML을 추가 후 젤라틴과 fibronectin합니다. 매일 미디어를 변경합니다 일까지onfluent. 세포는 코드에 따라 2~3일에 합류해야합니다.
2. Neutrophils의 작성
- Neutrophils는 밀도 원심 분리를 사용하여 건강한 인간 자원 봉사자의 말초 혈액으로부터 격리되었다. 호중구 격리를위한 시각적인 시범 자세한 프로토콜은이 저널 6 이전 문제에서 찾을 수 있습니다. 0.5 % 인간 알부민을 포함하는 HBSS에 1x10 6 / ML의 농도 한번에 절연, resuspend neutrophils.
3. Ibidi 회의소 설정하기
- 젤라틴 코팅 ibidi 챔버에서 내피 세포 성장. 그들은 밀접하게 합류되기 전까지의 위상 콘트라스트 현미경을 사용하여 매일 그들을 검사합니다.
- 접착 및 활성화 분자의 표현을 높이기 위해 내피 세포를 자극. 이 프로토콜의 목적을 위해 내피 세포는 37에서 4 시간 동안 10 NG / 재조합 TNF-α의 ML과 자극했다 ° C와 5 % CO
- 현미경, 그리고 시각적으로 빈 ibidi 챔버를 사용 Wiese 및 동료 11 시까지 설명된대로 주사기 펌프를 준비합니다.
- 이 프로토콜과 Wiese 절차 사이의 주요 차이점은 사전 충전, 공기에 대한 내피 세포의 노출을 막기 위해 튜브를 37 버퍼를 유지 ° C 온도를 잃는에서 버퍼를 유지하기 PharMed 튜빙을 사용하고 사용하여 물 목욕을 사용하여 다른 포함 위상 대조 또는 형광 이미징과 함께 여부에 따라 현미경의 목표.
- 현미경이 설치되고 튜브가 가까이 HBSS 모든 stopcocks 가득되며 빈 ibidi 챔버를 제거하면.
- TNF-α를 포함하는 ibidi 챔버가 튜브에 내피 세포를 자극 연결합니다.
4. 호중구 모집과 윤회
- microsc의 내피 세포 단일층를 떠올10X 위상 대비 목표를 사용 ope.
- 원하는 전단 응력의 HBSS의 흐름을 (일반적으로 0.5-2 dyn / cm 2 사이) 철회하고 시작 주사기 펌프를 설정합니다.
- 세 방향 정류장 - 거시기를 전환하여 절연 neutrophils (1x10 6 / ML)에 HBSS에서 유입 측면에서 전환합니다.
- DVD 레코더에 하나 연결하거나 컴퓨터에 직접 연결 CCD 카메라를 사용하여 녹음을 시작합니다. neutrophils는 챔버를 입력하면 타이머를 시작합니다. 4 분 neutrophils를 Perfuse. 호중구 정지 3 ML 총 한 실험을위한 충분합니다.
- 4 분 뒤 새로운 neutrophils의 부착을 방지하기 위해 HBSS 다시 전환합니다. 총 상호 작용, 압연 및 확고한 접착을위한 데이터를 원하는 경우에는 10 초 각각의 이미지 6 무작위 필드는 분 4와 5 사이에 10 배 위상 대비 목표를 사용합니다.
- 40x 목적으로 전환 5 10 분 사이에보기의 단일 필드를 기록합니다. 십분에서 수집보기의 무작위 분야 5 사이 10.
- 흐름을 중지하고 다음 챔버로 이동합니다.
5. Ibidi 회의소를 사용하면 흐름 조건에서 형광 이미징
- 관심 형광 프로브와 라벨 중 내피 세포 또는 neutrophils. 예를 들어, 알렉사-[547]에 대한 복합 백신 VE-cadherin 항체는 내피 세포 분기점을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
- 미분 간섭 대비 (DIC) 및 형광 기능을 갖춘 현미경에 ibidi 챔버를 조립. 우리는 환경 챔버와 함께 FluoView 1000 공촛점 (올림푸스)을 사용합니다. DIC와 형광 작업을 위해 설계 목표를 사용하는 데 중점을 둡니다.
- 섹션 4에서 설명한 시간 코스를 따라하면서 공급 업체에서 제공하는 소프트웨어를 사용하여 동시 DIC 및 형광 영상을 얻은 겁니다.
6. 호중구 채용 분석
- 세포를 압연 및 상호 작용의 분석은 Wiese 외 11 시까지 설명되어 있습니다. 내피 단일층 오초의 시대에 하나 이상의 셀 직경 이사 neutrophils의 숫자를 계산에 압연 neutrophils의 비율을 측정. 롤링 세포의 비율을 결정하기 위해 필드에 leukocytes의 총 숫자가이 번호를 나누십시오. 확장하여 나머지 세포는 단단히 자기편으로 간주됩니다.
- 호중구가 특정 기간에 여행 후 초 단위로 그 시간으로 나누어 거리를 계산하여 호중구의 회전 속도를 측정합니다.
- 윤회는 모양을 변경하고 단일층 열 아래에 마이그레이션한 neutrophils의 수를 계수에 의해 결정됩니다. 이러한 neutrophils들은 위상되는 밝고으로 변경했다는 사실에 의해 식별됩니다 때 단일층 10 아래 위상 어두운 격 단일층 위에. transmigrated 세포의 숫자는 전망이 분야의 총 세포의 비율로 또는 원시 감각으로 표현하실 수 있습니다단위 면적 당 transmigrated 세포의 어. 이 모델 시스템에서 neutrophils의 일반적으로 50 % 십분 후에 윤회하다.
7. 대표 결과
Unstimulated 내피 세포는 호중구 채용을 지원하지 않습니다. 대조적으로, 호중구 압연, 확고한 접착력과 윤회의 TNF-α 결과 내피 세포를 자극. 이러한 데이터의 예제는 그림 1과 2에 표시됩니다. 그림 1A는 TNF-α-자극된 내피 세포와 상호 작용하는 neutrophils를 보여줍니다. 이러한 상호 작용은 내피 세포와 상호 작용 neutrophils의 총계뿐만 아니라 (그림 2) 확고하게 자기편이나 transmigrated, 압연 neutrophils의 수를 공개, 계량하실 수 있습니다. 호중구 윤회는 세포 분기점이나 내피 세포 자체를 통해 발생할 수 있습니다. 이 두 조건을 구별하기 위해 내피 세포는 반 VE-C로 분류하고 있습니다 adherin 항체와 윤회는 (그림 1B와 C) paracellularly 또는 transcellularly 발생으로 채점됩니다. 이 모델에서는 거의 모든 윤회 7 paracellular입니다.
그림 1. ibidi 챔버를 사용하여 유동 조건 하에서 동시 DIC와 형광 이미징. () DIC 이미지와 신선한 인간 제대 정맥 내피 세포를 통해 이주하는 인간 neutrophils을 분리. 노란 화살촉은 자기편 호중구를 보여줍니다; 흰 화살촉은 transmigrating 호중구를 보여줍니다. (B) 내피 세포 분기점은 알렉사-[547]와 몇 군데의 복합 백신 VE-cadherin 항체 물들일되었다. (C) 채널 A와 B는이 모델의 거의 모든 transmigrating가 paracellular임을 밝히의 오버레이를 표시합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
그림 2. 내피 세포 unstimulated 남았다 또는 TNF-α의 10 NG / ML로 자극했다. 사시간 후, 병렬 플레이트 흐름 챔버는 조립되어 neutrophils은 1 dyn / cm 2 시에 걸쳐 perfused되었다. () 호중구 상호 작용은 검사와 NIH에서 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정되었다. 총 상호 작용하는 세포는 (B) 압연, 단단히 자기편 또는 (C) transmigrating로 특성화했다. 데이터는 3시 사이에 5 실험 평균 + SEM을 나타냅니다. 패널 및 C의 제어 및 TNF의 차이는 의미였다 (P <0.001).
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Discussion
연구자는 정기적으로 호중구 모집하고 윤회를 공부하기 위해 다른 혈관 침대에서 내피 세포를 사용 하였다. 예는 있지만, 피부 microvascular 내피 세포 12, 인간 제대 정맥에서 10 간 sinusoidal 내피 세포를 13 내피 세포에 제한되지 않습니다. 그들 중에는 HUVEC 때문에 고립과 가용성 그들의 상대적 용이성의 넓은 인기를 얻었다. HUVEC은 생체내에서 발생하는 많은 내피 과정을 모방한 것이었 체외 모델 시스템에서 강력하다. 이 모델은 시스템. 많은 백혈구 하위 클래스와 이러한 프로세스를 규제하는 방법 중 활성화된 상세한 분석의 채용에 중요한 접착 분자 및 chemokines의 식별에 주었있다 HUVEC 함께 체외 작업에서는 궁극적으로 정보를 제공했고, 생체내 연구에 대한 기초를 형성 하였다 이해와 인간의 질병 14 치료.
본 논문에서는 e_content "> 우리는 ibidi 흐름 챔버를 사용하여 체외에서 호중구 모집을 공부하기 위해 신속하고 간단한 방법을 제시한다. 챔버 이것은 일종의이 저널 11에서 설명한 다른 병렬 플레이트 실 이상의 몇 가지 장점이 있습니다. Ibidi의 챔버가 구성되어 있습니다 사용자가 위상 콘트라스트 이미지 이외에 형광 및 DIC 이미지를 데리고있게 유리와 유사한 광학 특성을 가진 중합체.이 형광 이미징을 사용하려면 유리 coverslips를 사용하여 챔버가 있지만 유리에 내피 세포 성장은 유착과 같은 도전입니다 이러한 세포의 속성. 유리 표면 15 일에 대폭 변경 내피 세포는 플라스틱 표면에 잘 준수하지만, 플라스틱 표면에 형광 이미징은 달성되지 않습니다. ibidi의 μ를 사용하면 이러한 문제를 제거뿐만 아니라 슬라이드뿐만 아니라 그들은 다른 방법보다 훨씬 적은 샘플 량을 필요로 .이 슬라이드도서만 약간의 modific와 동시 병렬 실험을 가능하게ation.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
그녀의 기술 지원 양 Lailey;과 인간의 탯줄 코드를 제공하는 캘거리, AB의 산기슭 병원의 단위 51 우리는 박사 피나 Colarusso 및 이미징 및 이미지 분석과 그들의 도움을 라이브 셀 이미징 시설 감사드립니다. 박사 KD 파텔은 앨버타 혁신이다 : 건강 솔루션 과학. 이 작품은 혁신과 앨버타 과학 연구 기관에 대한 캐나다 재단 보건 연구 장비 및 인프라 조성을위한 캐나다 연구소에서 운영 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
References
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