Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av humana navelvenendotelceller och deras användning i studier av neutrofilinhibitorfaktor Transmigration Under flödesförhållanden

doi: 10.3791/4032 Published: August 8, 2012

Summary

Den här artikeln beskriver först ett förfarande för att isolera humana endotelceller från navel vener och visar sedan hur man använder dessa celler för att undersöka neutrofila själavandring i flöde. Genom att använda en låg volym flödeskammare tillverkad av en polymer med de optiska egenskaperna hos glas är levande cellen fluorescerande avbildning av sällsynta cellpopulationer också möjlig.

Abstract

Neutrofiler är den mest förekommande typ av vita blodkroppar. De utgör en väsentlig del av det medfödda immunförsvaret 1. Under akut inflammation, neutrofiler är de första inflammatoriska celler att migrera till stället för skadan. Rekrytering av neutrofiler till ett skadeställe är en stegvis process som innefattar första, dilation av blodkärl för att öka blodflödet, för det andra mikrovaskulära strukturella förändringar och utströmning av plasmaproteiner från blodomloppet, tredje, valsning, adhesion och den neutrofila över endotelet; och fjärde ackumulering av neutrofiler vid stället för skada 2,3. Ett brett spektrum av in vivo och in vitro-metoder har utvecklats för att möjliggöra studium av dessa processer 4. Denna metod är inriktad på neutrofil transmigration över humana endotelceller.

En populär metod för att undersöka de molekylära processer som är involverade i neutrofila själavandring använder humant Neutrophils interagerar med primära humana navelvenendotelceller (HUVEC) 5. Neutrofil isolering har beskrivits visuellt håll 6, alltså den här artikeln kommer att visa metoden för isolering av HUVEC. När den väl isolerats och odlades till konfluens, är endotelceller aktiveras resulterar i uppreglering av adhesionsmolekyler och aktivering molekyler. Exempelvis aktivering av endotelceller med cytokiner såsom TNF-a resulterar i ökad E-selektin och IL-8-uttryck 7. E-selektin medierar infångnings-och valsning av neutrofiler och IL-8 medierar aktivering och fast vidhäftning av neutrofiler. Efter vidhäftning neutrofiler transmigrera. Transmigration kan inträffa paracellularly (genom endotelceller föreningspunkter) eller transcellularly (genom endotelceller i sig). I de flesta fall är dessa interaktioner sker enligt flödesbetingelser som finns i kärlsystemet 7,8.

Den parallella plattan flödeskammare är en allmänt använd system som miMikrofonerna den hydrodynamiska skjuvpåkänningar återfinnes in vivo och möjliggör studiet av neutrofil rekrytering enligt flödestillstånd in vitro 9,10. Flera företag producerar parallella kamrar platta flöde och var och en har fördelar och nackdelar. Om fluorescerande avbildning behövs måste glas eller en optiskt liknande polymer kan användas. Endotelceller växer inte bra på glas.

Här presenterar vi en enkel och snabb metod för fas kontrast, DIC och fluorescerande avbildning av neutrofiler själavandring med en låg volym ibidi CHANNEL gjord av en polymer som stöder den snabba vidhäftning och tillväxt av humana endotelceller och har optiska egenskaper som är jämförbara med glas. I denna metod var endotelceller odlades och stimulerades i en ibidi μslide. Neutrofiler infördes i flödesförhållanden och transmigration bedömdes. Fluorescerande avbildning av övergångarna aktiverat i realtid bestämning av omfattningen av paracellulära kontratranscellulär transmigration.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Isolering och underhåll av humana vaskulära endotelceller

  1. Nivå 2 biosäkerhet rutiner måste tillämpas vid arbete med humant blod och vävnad. Med sax klippa sladden från moderkakan och sedan noga undersöka sladd för blodpropp och skador orsakade av att klämma sladden under förlossningen. Klipp ut och kassera dessa delar av sladden.
  2. Framställ färsk kollagenaslösning vid 1 mg / ml genom att hälla 50 ml varm sladd buffert till ett rör som innehåller 50 mg kollagenas.
  3. Byt till sterila handskar och öppna en autoklaverad instrument fack som innehåller steriliserade trubbiga kanyler, klämmor sladd, saxar, tre-vägs slutar-tuppar och gasväv i ett laminärt flöde huva.
  4. Identifiera de två artärer och den enda venen som finns i sladden. Artärerna är mindre och tenderar att vara tätt sammandragna, medan ven är stor och lätt att kanylera. Att spola blod från venen, för försiktigt in en kanyl med en två-vägs kran fäst vid den iNTO ena änden av venen och plats en klämma runt kanyl för att hålla den stadigt på plats. Perfundera sladden buffert genom venen. Upprepa tills flödet genom är klar och sedan klämma i slutet av sladden.
  5. Perfundera kollagenas in i venen, stäng kranen, placera sladden i en bägare med varmt sladden buffert och inkubera i 10 minuter. Efter 10 minuter, ta bort sladden och försiktigt massera sladden för att lossa endotelceller från lumen venen. Dränera lösningen in i rör innehållande endotelceller medium (ECM). Spola med sladd buffert två gånger för att ta bort kvarvarande celler. Dränera lösningen i samma rör.
  6. Centrifugera cellerna vid 350 x g under 10 minuter för att pelletera endotelceller.
  7. Avlägsna supernatanten och tillsätt 10 ml av ECM till pelleten. Försiktigt resuspendera cellerna i ECM och sedan överföra cellerna till en T75-flaska förbelagd med 0,2% gelatin. Förbeläggning med gelatin har gjorts under minst 1 timme vid 37 ° C. Odla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2.
  8. Nästa dag, försiktigt skaka kolven att flytta eventuella röda blodkroppar avlägsna supernatanten och tvätta med varm Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Ta HBSS och mata cellerna med 10 ml varm ECM. Undersöka cellerna under mikroskop för att se till att de röda blodkropparna har avlägsnats. Utvärdera graden av sammanflytning och morfologin hos de endoteliala cellerna. Endotelceller i detta skede bör vara långsträckt utan några tecken på vakuoler.
  9. Fortsätt att ändra media var tredje dag tills cellerna når sammanväxning, så delade celler med hjälp av en 0,08% lösning av trypsin innehållande 1 mM EDTA. Plattan endotelceller i önskade skålar förbelagts med 0,2% gelatin. Cellerna bör nå samman i 3-6 dagar.
  10. När du använder ibidi kamrar, pre-coat varje kammare med 0,2% gelatin. Avlägsna överskott av gelatin och fibronektin och tillsätt sedan 1,5 X 10 6 / mL endoteliala celler suspenderade i ECM in i kammaren. Ändra media varannan dag fram till confluent. Cellerna bör vara sammanhängande i 2-3 dagar beroende på sladden.

2. Framställning av neutrofiler

  1. Neutrofiler isolerades från perifert blod från friska frivilliga försökspersoner med användning densitetscentrifugering. En detaljerad protokoll med en visuell demonstration för neutrofil isolering kan hittas i tidigare nummer av denna tidskrift 6. När den väl isolerats, återsuspendera neutrofiler vid en koncentration av 1x10 6 / ml i HBSS innehållande 0,5% humant albumin.

3. Ställa in Ibidi avdelningen

  1. Växa endotelceller i en gelatin-belagda ibidi kammaren. Undersök dem varje dag med faskontrastmikroskopi tills de blir ordentligt sammanflytande.
  2. Stimulera endotelceller för att öka uttrycket av adhesionsmolekyler och aktivering molekyler. Vid tillämpningen av detta protokoll har endotelceller stimulerades med 10 ng / ml rekombinant TNF-α i fyra timmar vid 37 ° C och 5% CO
  3. Förbered mikroskop och sprutpump som visuellt beskrivs av Wiese och kollegor 11 med hjälp av en tom ibidi kammare.
  4. Viktiga skillnader mellan detta protokoll och Wiese förfarandet omfatta före fyllning slangen för att förhindra exponering av endotelcellerna till luft, hålla bufferten vid 37 ° C med hjälp av ett vattenbad, med hjälp av PharMed slang för att hålla bufferten från att förlora temperatur och med olika mål för mikroskop, beroende på om avbildning med faskontrast eller fluorescens.
  5. När mikroskopet sätts upp och slangen fylls med HBSS, nära alla kranar och ta bort tomma ibidi kammaren.
  6. Ansluta ibidi kammare som innehåller TNF-α stimulerade endotelceller till röret.

4. Neutrofil Rekrytering och Transmigration

  1. Visualisera den endoteliala cellmonoskikt i Microscopa med en 10x objektiv faskontrast.
  2. Ställa in en sprutpump för att dra tillbaka och påbörja flöde av HBSS vid den önskade skjuvspänning (typiskt mellan 0,5 till 2 dyn / cm 2).
  3. På inloppssidan, byte från HBSS till isolerade neutrofiler (1x10 6 / ml) genom att vrida tre-vägs avstängningskranen.
  4. Börja inspelning med en CCD-kamera som är ansluten antingen till en DVD-brännare eller ansluten direkt till datorn. Starta timern när neutrofiler in i kammaren. Perfundera neutrofiler för fyra minuter. Totalt 3 ml av den neutrofila suspensionen är tillräckligt för en enda experiment.
  5. Efter fyra minuter, gå tillbaka till HBSS för att förhindra fastsättning av nya neutrofiler. Om data för total interaktioner, valsning och fasta vidhäftning önskas, bild 6 slumpmässiga fält för 10 sekunder vardera med en 10x objektiv faskontrast mellan min 4 och 5.
  6. Byt till ett 40x objektiv och spela in en singel synfält mellan 5 och 10 minuter. Vid 10 min uppsamladesmellan 5 och 10 slumpmässiga synfält.
  7. Stoppa flödet och flytta till nästa kammare.

5. Fluorescent Imaging under flöde betingelser med användning av en Ibidi avdelningen

  1. Label antingen endotelceller eller neutrofiler med en fluorescerande sond av intresse. Till exempel kan en anti-VE-cadherin-antikropp konjugerad till Alexa-[547] användas för att visualisera endotelcell korsningar.
  2. Montera ibidi kammare på ett mikroskop med differential interferens kontrast (DIC) och fluorescerande egenskaper. Vi använder en FluoView 1000 konfokalt (Olympus) med en miljökammare. Fokusera med ett objektiv avsedda för DIC och fluorescerande arbete.
  3. Skaffa samtidiga DIC och fluorescerande bilder med hjälp av programvara från leverantören när du följer tidsförloppet beskrivs i avsnitt 4.

6. Analys av neutrofilrekrytering

  1. Analys av valsning och samverkande celler beskrivs av Wiese et al 11. Att mäta den procentuella andelen av neutrofiler som rullar på den endoteliala monoskiktet räkna antalet neutrofiler som har flyttat mer än en cell diameter i en period av 5 sekunder. Dividera detta tal med det totala antalet leukocyter i området för att bestämma den procentuella andelen av rullande celler. I förlängningen är de återstående cellerna behandlade fast förbunden.
  2. Mät rullande hastighet neutrofil genom att beräkna avstånd neutrofila färdades i en viss tidsperiod och sedan dividera det med den tiden i sekunder.
  3. Transmigration bestäms genom räkning av antalet neutrofiler som har ändrats form och migrerade under monoskiktet 10. Dessa neutrofiler identifieras genom det faktum att de förändras från att vara i ljus fas när ovanpå monoskikt till att vara fas mörk när undersidan monoskiktet 10. Antalet transmigrated celler kan uttryckas som en procentandel av de totala cellerna i synfältet eller som en rå steler av transmigrated celler per ytenhet. I detta modellsystem, typiskt 50% av neutrofilerna transmigrera efter 10 minuter.

7. Representativa resultat

Ostimulerade endotelceller stöder inte neutrofil rekrytering. I motsats härtill stimulerar endotelceller med TNF-a resulterar i neutrofil rullning, starka adhesion och. Ett exempel på dessa data visas i figurerna 1 och 2. Visar neutrofiler interagerar med TNF-α-stimulerade endotelceller Figur 1A. Dessa interaktioner kan kvantifieras, vilket avslöjar det totala antalet neutrofiler som interagerar med de endoteliala cellerna och antalet neutrofiler rullande, fast förbunden eller transmigrated (figur 2). Neutrofil transmigration kan ske vid cell korsningar eller genom de endoteliala cellerna själva. Att skilja mellan dessa två villkor är endotelceller märkt med en anti-VE-c adherin antikropp och transmigrering är skårad som inträffar paracellularly eller transcellularly (figur 1B och C). I denna modell är nästan alla transmigration paracellulära 7.

Figur 1
Figur 1. Samtidig DIC och fluorescens avbildning i flöde med hjälp av en ibidi kammare. (A) DIC bild isolerades färskt humana neutrofiler som migrerar över humana navelvenendotelceller. Den gula pilspets visar en vidhäftande neutrofil; den vita pilspetsen visar en transmigrating neutrofil. (B) Endotelcellkulturer föreningspunkterna färgades med en anti-VE-cadherin-antikropp konjugerad till Alexa-[547] och avbildas. (C) visar överlagring av kanal A och B avslöjar att praktiskt taget allt transmigrating i denna modell är paracellulära. Klicka här för att visa en större bild .

_content "> Figur 2
Figur 2. Endotelceller kvar ostimulerade eller stimulerades med 10 ng / ml av TNF-α. Efter 4 timmar tillsattes en parallell platta flödeskammare monteras och neutrofiler perfunderades tvärs över 1 dyn / cm 2. (A) neutrofila interaktioner undersöktes och mättes med hjälp ImageJ programvara från NIH. De totala samverkande cellerna karakteriserades som (B) rullande, fast vidhäftande eller (C) transmigrating. Data representerar medelvärde + SEM av mellan 3 och 5 experiment. Skillnaden mellan kontroll-och TNF i panelerna A och C var signifikant (p <0,001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Forskare har rutinmässigt används endotelceller från olika kärlbäddar att studera neutrofil rekrytering och själavandring. Exempel innefattar, men är inte begränsade till, dermala mikrovaskulära endotelceller 12, lever sinusformade endotelceller 13 och endotelceller från mänsklig navelven 10. Bland dem HUVEC vunnit stor popularitet på grund av deras relativa lätthet av isolering och tillgänglighet. HUVEC är ett kraftfullt in vitro-modellsystem som härmar många endotel processer som sker in vivo. Detta modellsystem har hjälpt till att identifiera adhesionsmolekyler och kemokiner kritiska vid rekrytering av många leukocyt underklasser och aktiverade detaljerad analys av hur dessa processer regleras. In vitro arbetet med HUVEC har legat till grund för in vivo-studier som i slutändan har gett en bättre förståelse och behandling av mänsklig sjukdom 14.

e_content "> I denna uppsats presenterar vi en snabb och enkel metod för att studera neutrofilrekrytering in vitro med en ibidi flöde kammare. Denna typ av kammaren har flera fördelar jämfört med andra parallella plattor kamrar beskrivs tidigare i denna tidskrift 11. Ibidi avdelningar består av en polymer med optiska egenskaper som liknar glas som gör det möjligt för användaren att ta fluorescerande och DIC bilder förutom fas-kontrast bilder. Det finns avdelningar som använder täckglas att fluorescerande avbildning, men växande endotelceller på glas är en utmaning som vidhäftningen egenskap hos dessa celler förändras väsentligt på glasytor 15. Endotelceller fäster bra på plast ytan men fluorescensavbildning på plast ytan inte är möjligt. Använda ibidi μ glider inte bara eliminerar dessa problem, men även de kräver mycket mindre provvolym än de andra metoderna . Dessa bilder gör det också möjligt samtidigt parallella experiment med endast lätt modification.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar Dr Pina Colarusso och levande cell imaging anläggning för deras hjälp med avbildning och bildanalys, Ms Lailey för henne tekniskt stöd, och enhet 51 vid foten sjukhuset i Calgary, AB för att ge människor navelsträngar. Dr KD Patel är ett Alberta innovativt: Health Solutions Scientist. Detta arbete stöddes av driftsbidrag från den kanadensiska Institutes for Health Research och utrustning och infrastruktur bidrag från den kanadensiska stiftelsen för Innovation och Alberta vetenskap och forskning myndigheten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase Type 1 Worthington 4197
Cord buffer Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4
Endothelial Cell Media (ECM) M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml
M199 GIBCO 31100-035
Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) Invitrogen 10378-016
Ibidi chambers Ibidi 80606
TNF-α Prepro Tech 300-01A
Human Albumin 20% solution Gemini Bioproducts 800120050
HBSS without Ca2+ and Mg2+ Sigma H2487-10X
HBSS with Ca2+ and Mg2+ Sigma H1387-10X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  2. Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
  3. Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  4. Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
  5. Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
  6. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  7. Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
  8. Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
  9. Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
  10. Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
  11. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
  12. Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
  13. Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
  14. Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
  15. Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
Isolering av humana navelvenendotelceller och deras användning i studier av neutrofilinhibitorfaktor Transmigration Under flödesförhållanden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).More

Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter