Summary
I denne artikel beskrives først en procedure til isolering af humane endotelceller fra navlestrengen vener og derefter viser, hvordan man bruger disse celler til at undersøge neutrofil transmigration under strømningsforhold. Ved anvendelse af en lav-volumen strømningskammeret fremstillet af en polymer med de optiske egenskaber af glas, er levende celle fluorescerende afbildning af sjældne cellepopulationer også mulige.
Abstract
Neutrofiler er de mest udbredte form af hvide blodlegemer. De udgør en væsentlig del af det medfødte immunsystem 1. Under akut inflammation, er neutrofile de første inflammatoriske celler at migrere til stedet for skaden. Rekruttering af neutrofiler til en skade site er en trinvis proces, der omfatter først, udvidelse af blodkarrene til at øge blodgennemstrømningen, for det andet, mikrovaskulære strukturelle ændringer og flygte af plasmaproteiner fra blodbanen, for det tredje, valsning, adhæsion og transmigration af neutrofil på tværs af endothelium, og den fjerde akkumulering af neutrofiler på læsionsstedet 2,3. En lang række in vivo og in vitro fremgangsmåder er udviklet til at undersøgelsen af disse processer 4. Denne metode fokuserer på neutrofil transmigration tværs af humane endotelceller.
En populær metode til at undersøge de molekylære processer involveret i neutrofil transmigration udnytter menneskelige neutrophils interagerer med primære humane navlevene-endotelceller (HUVEC) 5. Neutrofil isolation er blevet beskrevet visuelt andetsteds 6, og dermed denne artikel vil vise en metode til isolering af HUVEC. Når først isoleret og dyrket til konfluens, endotelceller aktiveres resulterer i opregulering af adhæsionsmolekyler og aktivering molekyler. F.eks. Aktivering af endothelceller med cytokiner såsom TNF-a resulterer i forøget E-selectin og IL-8 ekspression 7 E-selectin medierer opsamling og valsning af neutrofiler og IL-8 medierer aktivering og faste adhæsion af neutrofiler. Efter vedhæftning neutrofile transmigrate. Transmigration kan forekomme paracellularly (gennem endotelceller junctions) eller transcellularly (gennem endotelcelle selv). I de fleste tilfælde forekommer disse interaktioner under strømningsbetingelser fundet i vaskulaturen 7,8.
Den parallelle plader strømningskammeret er en almindeligt anvendt system, mimikrofoner den hydrodynamiske forskydningsspændingerne fundet in vivo og muliggør studiet af neutrofilrekruttering under strømningstilstand in vitro 9,10. Flere selskaber producerer parallelle plade strømningskamre og har hver deres fordele og ulemper. Hvis fluorescerende billeddannelse er nødvendig, glas eller en optisk lignende polymer skal anvendes. Endotelceller ikke vokser godt på glas.
Her udgør en let og hurtig fremgangsmåde til fasekontrast, DIC og fluorescerende afbildning af neutrofil transmigration anvendelse af en lav mængde ibidi kanal glider fremstillet af en polymer, der understøtter den hurtige adhæsion og vækst af humane endotelceller og har optiske egenskaber, der er sammenlignelige glas. I denne fremgangsmåde blev endotelceller dyrket og stimuleret med en ibidi μslide. Neutrofiler blev indført under flowbetingelser og transmigration blev vurderet. Fluorescerende afbildning af knudepunkter aktiveres tidstro bestemmelse af omfanget af paracellulær versustranscellulære sjælevandring.
Protocol
1. Isolering og vedligeholdelse af humane vaskulære endotelceller
- Niveau 2 biosikkerhed procedurer skal anvendes når man arbejder med humant blod og væv. Brug saks klippe ledningen fra moderkagen og derefter nøje undersøge ledningen for blodpropper og skader forårsaget af klemme i ledningen under fødslen. Klip ud og kassere disse dele af ledningen.
- Fremstil frisk collagenaseopløsning ved 1 mg / ml ved at hælde 50 ml varm ledningen buffer til et rør, der indeholder 50 mg collagenase.
- Skift til sterile handsker og åbne en autoklaveret instrument skuffe, der indeholder steriliseret stumpe kanyler, ledning klemmer, sakse, tre-vejs stop-haner og gaze i en laminær strømning.
- Identificere de to arterier og det indre vene til stede i ledningen. Arterier er mindre og har en tendens til at være tæt indsnævret, hvorimod venen er stort og let at kanyle. At skylle blodet fra venen, forsigtigt indsætte en kanyle med en to-vejs stophane knyttet til det inFor ene ende af venen og sted en klemme rundt kanyle for at holde den fast på plads. Perfundere ledningen puffer gennem venen. Gentages, indtil strømmen gennem klart og derefter spænde ende af ledningen.
- Perfundere kollagenase ind i venen, skal du lukke stophanen, skal du placere ledningen i et bægerglas indeholdende varm ledning buffer og inkuber i 10 minutter. Efter 10 minutter, fjern snoren og forsigtigt massere ledningen til at løsne endotelceller fra lumen af venen. Dræne opløsningen ind i røret indeholdende endothelceller cellemedier (ECM). Skyl med ledning buffer to gange for at fjerne tilbageværende celler. Dræne opløsningen i det samme rør.
- Centrifugeres cellerne ved 350 x g i 10 minutter til pelletering af endotelceller.
- Fjern supernatanten og der tilsættes 10 ml af ECM til pelleten. Forsigtigt resuspender cellerne i ECM, som derefter overføres cellerne til en T75 kolbe præ-overtrukket med 0,2% gelatine. Præ-coating med gelatine er blevet gjort i mindst 1 time ved 37 ° C. Dyrke cellerne ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Den næste dag forsigtigt rystes for at fjerne eventuelle røde blodlegemer derefter fjerne supernatanten og vask med varm Hanks balancerede saltopløsning (HBSS). Fjerne HBSS og foder cellerne med 10 ml varm ECM. Undersøge cellerne under mikroskop for at sikre, at de røde blodlegemer blev fjernet. Vurdere graden af konfluens og morfologien af endotelceller. Endotelceller på dette stadium bør langstrakt uden tegn på vakuoler.
- Fortsætte med at ændre mediet hver tredje dag, indtil cellerne når konfluens, og derefter delt celler under anvendelse af en 0,08% opløsning af trypsin indeholdende 1 mM EDTA. Plade endotelceller i ønskede skåle præ-coatet med 0,2% gelatine. Cellerne skal nå sammenflydning i 3-6 dage.
- Ved anvendelse ibidi kamre, præ-coating hvert kammer med 0,2% gelatine. Fjernes overskydende gelatine og fibronectin og derpå tilsættes 1,5 x 10 6 / ml endotel-celler suspenderet i ECM ind i kammeret. Skift medierne hver anden dag, indtil confluent. Cellerne skal være sammenflydende i 2-3 dage afhængig af ledningen.
2. Fremstillinq af Neutrofiler
- Neutrofiler blev isoleret fra perifert blod fra raske humane frivillige ved anvendelse densitetscentrifugering. En detaljeret protokol med en visuel demonstration for neutrofil isolation kan findes i den tidligere nummer af dette tidsskrift 6. Efter isolering Resuspender neutrofiler ved en koncentration på 1x10 6 / ml i HBSS indeholdende 0,5% human albumin.
3. Opsætning af Ibidi Afdeling
- Vokser endotelceller i en gelatineovertrukket ibidi kammer. Undersøg dem hver dag ved hjælp af et fasekontrast mikroskopi, indtil de bliver stramt sammenflydende.
- Stimulerer endotelceller at forøge ekspressionen af adhæsionsmolekyler og aktivering molekyler. Med henblik på denne protokol blev endotelceller stimuleret med 10 ng / ml rekombinant TNF-α i fire timer ved 37 ° C og 5% CO
- Forbered mikroskop, og sprøjtepumpe som visuelt beskrevet af Wiese og kolleger 11 ved hjælp af en tom ibidi kammer.
- Vigtigste forskelle mellem denne protokol og Wiese, omfatter præ-fylde slangen for at forhindre eksponering af endotelceller til luft, opretholdelse af buffer ved 37 ° C under anvendelse af et vandbad ved hjælp PharMed rør for at holde bufferen mister temperatur og ved hjælp af forskellige målsætninger for mikroskopet, afhængigt af om billedbehandling med fasekontrast eller fluorescens.
- Når mikroskopet er sat op, og slangen er fyldt med HBSS og lukke alle stophaner og fjern den tomme ibidi kammer.
- Forbinde ibidi kammer indeholdende TNF-α stimulerede endotelceller til røret.
4. Neutrofil Rekruttering og sjælevandring
- Visualisere endotelcelle monolag i Microscope anvendelse af en 10x fasekontrast mål.
- Indstille sprøjtepumpen at trække og begynde strømmen af HBSS ved det ønskede forskydningsspænding (typisk mellem 0,5 til 2 dyn / cm 2).
- På indgangssiden, skifte fra HBSS til isolerede neutrofile (1x10 6 / mL) ved at dreje på tre-vejs stop-hane.
- Begynd optagelse ved hjælp af et CCD-kamera er tilsluttet enten til en DVD-optager eller tilsluttes direkte til computeren. Start timeren, når neutrofile ind i kammeret. Perfundere neutrofile i fire minutter. I alt 3 ml af den neutrofile suspension er tilstrækkelig til et enkelt eksperiment.
- Efter fire minutter, skifte tilbage til HBSS at forhindre fastgørelse af nye neutrofile. Hvis data for den samlede interaktioner, rullende og fast vedhæftning ønskes, Billede 6 tilfældige felter i 10 sekunder hver med en 10x fasekontrast mål mellem minutter 4 og 5.
- Skift til et 40x objektiv og indspille en single synsfelt mellem 5 og 10 minutter. Efter 10 minutter, indsamlemellem 5 og 10 tilfældige synsfelter.
- Stop flow og flytte til næste kammer.
5. Fluorescerende Imaging Under strømningsforhold Brug en Ibidi Afdeling
- Mærke enten endotelceller eller neutrofiler med en fluorescerende probe af interesse. For eksempel kan en anti-VE-cadherin antistoffet konjugeret til Alexa-[547] anvendes til at visualisere endotelceller junctions.
- Samle ibidi kammeret på et mikroskop med differentiel interferenskontrast (DIC) og fluorescerende egenskaber. Vi bruger en FluoView 1000 konfokal (Olympus) med et miljømæssigt kammer. Koncentreres under anvendelse af en objektiv udformet til DIC og fluorescerende arbejde.
- Anskaf samtidige DIC og fluorescerende billeder ved hjælp af software, der leveres af sælgeren, når du følger tidsforløbet beskrevet i afsnit 4.
6. Analyse af neutrofilrekruttering
- Analyse af rulning og interagerende celler er beskrevet af Wiese et al 11. At måle procentdelen af neutrofiler rullende på endotelmonolaget tæller antallet af neutrofiler, der har bevæget sig mere end en celle diameter i et tidsrum på 5 sekunder. Dividere dette tal med det samlede antal leukocytter i området for at bestemme procentdelen af rullende-celler. I forlængelse heraf er de resterende celler betragtes som fast tilhænger.
- Måle rullende hastigheden af neutrofil ved at beregne afstanden neutrofil tilbagelagt i en bestemt tidsperiode, og derefter dividere med den tid i sekunder.
- Transmigration bestemmes ved at tælle antallet af neutrofiler, der har ændret form og migrerede under monolaget 10. Disse neutrofiler identificeres ved det faktum, at de ændrer sig fra at være fase lyse, når oven på monolaget at være fase mørke ved under monolaget 10. Antallet af transmigrated celler kan udtrykkes som en procentdel af de totale celler i synsfeltet eller som en rå følelsesløsis i transmigrated celler per arealenhed. I dette modelsystem, transmigrate typisk 50% af neutrofile celler efter 10 minutter.
7. Repræsentative resultater
Ikke-stimulerede endothelceller understøtter ikke neutrofil rekruttering. I modsætning hertil. Stimulering endotelceller med TNF-a resulterer i neutrofil rullende, faste adhæsion og transmigration Et eksempel på disse data er vist i figur 1 og 2.. Figur 1A viser neutrofiler interagerer med TNF-α-stimulerede endotelceller. Disse interaktioner kan kvantificeres, afslører totale antal neutrofiler vekselvirker med endotelceller såvel som antallet af neutrofiler rullende, fast vedhængende eller transmigrated (figur 2). Neutrofil transmigration kan forekomme ved celle vejkryds eller gennem endotelceller selv. At skelne mellem disse to betingelser er endotelceller mærket med et anti-VE-c adherin antistof og transmigrering scores som forekommer paracellularly eller transcellularly (fig. 1B og C). I denne model er stort set alle transmigration paracellulær 7.
Figur 1. Samtidig DIC og fluorescens billedbehandling under strømningsforhold ved hjælp af en ibidi kammer. (A) DIC billede frisk isolerede humane neutrofiler, der migrerer hen humane navlevene-endotelceller. Den gule pilespids viser en klæbende neutrofil, det hvide pilespidsen viser en transmigrating neutrofil. (B) endotelceller junctions blev farvet med et anti-VE-cadherin antistoffet konjugeret til Alexa-[547] og afbildes. (C) viser overlay af kanal A og B afslører, at stort set alle transmigrating i denne model er paracellulær. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Endotelceller blev efterladt ustimuleret eller blev stimuleret med 10 ng / ml TNF-α. Efter 4 timer blev en parallel plade strømningskammer samles og neutrofiler blev perfunderet over på en dyn / cm 2. (A) Neutrocyt interaktioner blev undersøgt og målt ved hjælp af ImageJ software fra NIH. De samlede interagerende celler blev karakteriseret som (B) valsning, fast vedhængende eller (C) transmigrating. Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM af mellem 3 og 5 eksperimenter. Forskellen mellem kontrol-og TNF i panelerne A og C var signifikant (p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskere har rutinemæssigt anvendt endotelceller fra forskellige kar til at studere neutrofilrekruttering og sjælevandring. Eksempler omfatter, men er ikke begrænset til, dermale mikrovaskulære endotelceller 12, lever sinusformede endotelceller 13 og endotelceller fra human navlevene 10. Blandt dem HUVEC vundet bred popularitet på grund af deres relativt lette isolering og tilgængelighed. HUVEC er en stærk in vitro modelsystem, som efterligner mange endotelceller processer, der forekommer in vivo. Denne model system har hjulpet i identifikationen af adhæsionsmolekyler og kemokiner kritiske i rekrutteringen af mange leukocytter underklasser og aktiverede detaljeret analyse af, hvordan disse processer er reguleret. In vitro arbejdet med HUVEC har dannet grundlag for in vivo undersøgelser, der i sidste ende har givet en bedre forståelse og behandling af sygdom hos mennesker 14.
e_content "> I dette papir præsenterer vi en hurtig og enkel metode til at studere neutrofilrekruttering in vitro under anvendelse af en ibidi strømningskammeret. Denne type af kammeret har adskillige fordele frem for andre parallelle plader kamre er beskrevet tidligere i denne tidsskrift 11. Ibidi kamre består af en polymer med optiske egenskaber, der svarer til glas, der gør det muligt for brugeren at tage fluorescerende og DIC billeder som supplement til fase-kontrast billeder. Der er kamre, der bruger glasdækglas at aktivere fluorescerende billedbehandling, men stigende endotelceller på glas er en udfordring, da vedhæftningen egenskab af disse celler ændrer sig væsentligt på glasoverflader 15. Endothelceller klæber godt til plastik overflade, men fluorescensimagografi på plastik overfladen ikke er opnåeligt. Brug af ibidi μ glider ikke kun eliminerer disse problemer, men også de kræver meget mindre prøvevolumen end de andre metoder . Disse glider også gøre det muligt samtidige parallelle eksperimenter med kun lidt modification.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Pina Colarusso og Live Cell Imaging facilitet for deres hjælp med billedbehandling og image analyse; Ms Lailey for hende teknisk bistand og enhed 51 ved foden Hospital i Calgary, AB for at give mennesker navlestrenge. Dr. KD Patel er en Alberta innoverer: Health Solutions Scientist. Dette arbejde blev støttet af et driftstilskud fra canadiske Institutes for Health Research og udstyr og infrastruktur tilskud fra den canadiske Institut for Innovation og Alberta videnskab og forskning Authority.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
