Summary
Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.
Abstract
Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende Art von weißen Blutkörperchen. Sie bilden einen wesentlichen Teil des angeborenen Immunsystems ein. Während der akuten Entzündung, Neutrophile sind die ersten Entzündungszellen an der Stelle der Verletzung zu migrieren. Rekrutierung von Neutrophilen an eine verletzte Stelle ist ein schrittweiser Prozess, der erste, Erweiterung der Blutgefäße, um den Blutfluss zu erhöhen beinhaltet, zweitens mikrovaskulären strukturellen Veränderungen und die Flucht von Plasmaproteinen aus der Blutbahn, drittens, Walzgut, Adhäsion und Transmigration der neutrophilen Granulozyten über die Endothel, und eine vierte Akkumulation von Neutrophilen an der Stelle der Verletzung 2,3. Eine Vielzahl von in vivo und in vitro-Methoden entwickelt hat, das Studium dieser Prozesse 4 ermöglichen. Diese Methode konzentriert sich auf die Transmigration neutrophiler über menschliche Endothelzellen.
Eine beliebte Methode zur Untersuchung der molekularen Vorgänge in neutrophilen Transmigration beteiligt nutzt menschliche neutrophils Interaktion mit primären humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) 5. Neutrophile isoliert wurde optisch an anderer Stelle 6 beschrieben, so wird dieser Artikel die Methode zur Isolierung von HUVEC zeigen. Wenn sie einmal isoliert und bis zur Konfluenz werden die aktivierten Endothelzellen, was zur Hochregulierung von Adhäsion und Aktivierung Moleküle. Zum Beispiel, Aktivierung von Endothelzellen mit Cytokinen wie TNF-α zu einer erhöhten E-Selectin und IL-8-Expression 7. E-Selektin vermittelt Abscheidung und-rollen von Neutrophilen und IL-8 vermittelt die Aktivierung und feste Adhäsion von Neutrophilen. Nach Adhäsion Neutrophilen transmigrieren. Transmigration kann paracellularly auftreten (durch Endothelzellverbindungen) oder transzellulär (durch die Endothelzellen selbst). In den meisten Fällen treten diese Wechselwirkungen unter Strömungsverhältnisse im Gefäßsystem 7,8 gefunden.
Die parallele Platte Flusskammer ist ein weit verbreitetes System, dass miMikrofone der hydrodynamische Schubspannungen in vivo gefunden und die Untersuchung der Rekrutierung von Neutrophilen unter Strömungsbedingungen in vitro 9,10. Mehrere Unternehmen produzieren parallele Platte Strömungskammern und haben jeweils Vor-und Nachteile. Wenn Fluoreszenz-Bildgebung erforderlich ist, muss Glas oder einem optisch ähnlichen Polymer verwendet werden. Endothelzellen nicht so wachsen wie auf Glas.
Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode zur Phasenkontrast-, DIC-und Fluoreszenz-Imaging von neutrophilen Transmigration mit einem geringen Volumen ibidi Kanal Rutsche aus einem Polymer, dass die rasche Adhäsion und das Wachstum von humanen Endothelzellen unterstützt und verfügt über optische Eigenschaften, die vergleichbar sind gemacht Glas. Bei diesem Verfahren wurden Endothelzellen wachsen und stimuliert einen ibidi μslide. Neutrophile wurden unter Strömungsbedingungen eingeführt und Transmigration beurteilt. Fluoreszenz-Imaging der Übergänge ein Echtzeit-Bestimmung des Ausmaßes der parazellulären gegenübertranszellulären Seelenwanderung.
Protocol
1. Isolierung und Erhaltung des menschlichen vaskulären Endothelzellen
- Biosafety Level 2 Verfahren müssen bei der Arbeit mit menschlichem Blut und Gewebe werden. Mit einer Schere durchschnitt die Nabelschnur aus der Plazenta und dann genau untersuchen Sie das Kabel für Blutgerinnsel und Schäden, die durch Spannen Sie das Kabel während der Geburt verursacht werden. Schneiden Sie und entsorgen Sie diese Teile des Rückenmarks.
- Ansetzen Kollagenase-Lösung mit 1 mg / ml durch Gießen 50 ml warmem Kabel Puffer in einer Röhre, die 50 mg Collagenase enthält.
- Ändern Sie in sterile Handschuhe und öffnen Sie ein Fach mit autoklavierten Instrument sterilisiert stumpfe Kanülen, Kabel Klemmen, Scheren, Drei-Wege-Hähne und Gaze in einer sterilen Werkbank.
- Identifizieren Sie die zwei Arterien und Venen die einzigen in der Schnur. Die Arterien sind kleiner und sind in der Regel eng eingeschnürt, während die Vene ist groß und leicht zu kanülieren. Um das Blut aus der Vene zu spülen, schieben Sie eine Kanüle mit einem Zwei-Wege-Hahn befestigt, um es zu iNTO einem Ende der Vene und Stelle eine Klammer um Kanüle, um es fest in Position halten. Perfundieren Schnur Puffer durch die Vene. Wiederholen, bis Durchströmung ist klar und dann klemmen die Ende der Schnur.
- Perfundieren Kollagenase in die Vene, den Absperrhahn schließen, legen Sie das Kabel in ein Becherglas mit warmen Schnur Puffer und Inkubation für 10 Minuten. Nach 10 Minuten, entfernen Sie das Netzkabel und sanft massieren Sie das Kabel an Endothelzellen aus dem Lumen der Vene lösen. Entleeren Sie die Lösung in das Röhrchen mit Endothelzellen Medien (ECM). Spülen Sie mit Kordel Puffer zweimal, um verbliebene Zellen zu entfernen. Entleeren Sie die Lösung in das gleiche Rohr.
- Zentrifugation der Zellen bei 350 g für 10 Minuten zu Pellets der Endothelzellen.
- Entfernen Sie den Überstand und 10 ml ECM zu dem Pellet. Erythrozyten vorsichtig resuspendieren in ECM, dann übertragen Sie die Zellen, um eine T75-Flasche vorbeschichtet mit 0,2% Gelatine. Pre-Beschichtung mit Gelatine wurde für mindestens 1 Stunde bei 37 ° C durchgeführt Wachsen der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Am nächsten Tag, sanft geschüttelt zwecks vertreiben keine roten Blutkörperchen entfernen Sie dann den Überstand und waschen mit physiologischer Kochsalzlösung warmen Hank-Lösung (HBSS). Entfernen Sie HBSS und füttern die Zellen mit 10 ml warmem ECM. Die Zellen werden unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die roten Blutkörperchen entfernt wurden. Bewerten Sie den Grad der Zusammenfluss und die Morphologie der Endothelzellen. Endothelzellen in diesem Stadium sollten ohne Anzeichen von Vakuolen verlängert werden.
- Weiter, um die Medien ändern alle drei Tage, bis die Zellen Konfluenz, dann spalten Zellen unter Verwendung eines 0,08%-Lösung von Trypsin mit 1 mM EDTA zu erreichen. Platte Endothelzellen in gewünschten Gerichte mit 0,2% Gelatine vorbeschichtet. Die Zellen sollten Einmündung in 3-6 Tagen erreichen.
- Bei der Verwendung ibidi Kammern, Precoat-jede Kammer mit 0,2% Gelatine. Entfernen Sie das überschüssige Gelatine und Fibronektin und fügen Sie dann 1,5 x 10 6 / ml von Endothelzellen in ECM in die Kammer ausgesetzt. Ändern Sie die Medien jeden zweiten Tag bis confluent. Die Zellen sollten in 2-3 Tagen, je nach Kabel konfluent.
2. Vorbereitung von Neutrophilen
- Neutrophile wurden aus dem peripheren Blut von gesunden Freiwilligen mittels Dichte-Zentrifugation isoliert. Ein detailliertes Protokoll mit einer visuellen Demonstration für neutrophilen Isolation kann in der früheren Ausgabe dieser Zeitschrift 6 zu finden. Einmal isoliert, resuspendieren Neutrophilen bei einer Konzentration von 1x10 6 / ml in HBSS, enthaltend 0,5% Humanalbumin.
3. Einrichten des ibidi Kammer
- Wachsen Endothelzellen in einer Gelatine-beschichteten ibidi Kammer. Untersuchen sie jeden Tag mit Phasenkontrast-Mikroskopie, bis sie dicht konfluent geworden.
- Stimulieren die Endothelzellen die Expression von Adhäsionsmolekülen und Aktivierung Moleküle erhöhen. Für die Zwecke dieses Protokolls wurden Endothelzellen mit 10 ng / ml rekombinantem TNF-α für vier Stunden bei 37 ° C stimuliert und 5% CO
- Bereiten Sie das Mikroskop, und Spritzenpumpe als visuell durch Wiese und seine Kollegen 11 beschrieben, mit einem leeren ibidi Kammer.
- Die wichtigsten Unterschiede zwischen diesem Protokoll und die Wiese Verfahrens gehören Vorfüllen des Schlauchs, um die Exposition der Endothelzellen in die Luft zu verhindern, die Aufrechterhaltung der Puffer bei 37 ° C unter Verwendung eines Wasserbades mit PharMed-Schlauch, um den Puffer vor dem Verlust Temperatur zu halten und mit verschiedenen Ziele auf dem Mikroskop je nachdem, ob Bildgebung mit Phasenkontrast oder Fluoreszenz.
- Sobald das Mikroskop ist eingerichtet und der Schlauch wird mit HBSS, schließen Sie alle Hähne gefüllt und die leere Kammer ibidi.
- Verbinden der Kammer mit ibidi TNF-α stimulierte Endothelzellen an das Rohr.
4. Rekrutierung von Neutrophilen und Transmigration
- Visualisieren Sie die Endothelzell-Monolayer im Mikroskopope mit einem 10x-Phasenkontrast Ziel.
- Stellen Sie die Spritzenpumpe beginnt, sich zurückzuziehen und den Fluss von HBSS bei der gewünschten Scherspannung (typischerweise zwischen 0,5 und 2 dyn / cm 2).
- Auf der Eingangsseite, Schalter aus HBSS zu isolierten neutrophilen Granulozyten (1x10 6 / ml) durch Drehen des Drei-Wege-Hahn.
- Beginnen Aufnahme über eine CCD-Kamera entweder mit einem DVD-Recorder oder direkt an den Computer angeschlossen ist. Starten Sie den Timer, wenn Neutrophilen die Kammer eintreten. Perfundieren Neutrophilen für vier Minuten. Insgesamt 3 ml des Neutrophilensuspension genügt einem einzigen Experiment.
- Nach vier Minuten wechseln Sie wieder in HBSS, um die Anlage von neuen Neutrophilen zu verhindern. Wenn Daten zur gesamten Interaktionen, Rollen und feste Haftung gewünscht werden, mit Bild 6 zufällige Felder für jeweils 10 Sekunden einen 10x Phasenkontrast-Objektiv zwischen 4 und 5 Minuten.
- Wechseln Sie zu einem 40x-Objektiv und Aufzeichnung einer einzigen Sichtfeld zwischen 5 und 10 Minuten. In 10 Minuten, sammelnzwischen 5 und 10 zufällig Sehfelder.
- Stoppen Sie den Durchfluss-und an die nächste Kammer.
5. Fluoreszenz-Imaging unter Flussbedingungen Mit einem ibidi Kammer
- Etikett entweder Endothelzellen oder Neutrophilen mit einer fluoreszierenden Sonde von Interesse. Zum Beispiel kann ein Anti-VE-Cadherin-Antikörper, konjugiert an Alexa-[547] verwendet werden, um Endothelzellverbindungen visualisieren.
- Montieren ibidi Kammer auf einem Mikroskop mit Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) und fluoreszierende Fähigkeiten. Wir verwenden eine FluoView 1000 konfokalen (Olympus) mit einer Klimakammer. Konzentrieren Sie mit einem Ziel für DIC und Fluoreszenz-Arbeit entwickelt.
- Erwerben gleichzeitige DIC und Fluoreszenz-Bilder mit einer Software von Lieferanten geliefert, während nach den zeitlichen Verlauf in Abschnitt 4 beschrieben.
6. Die Analyse der Rekrutierung von Neutrophilen
- Analyse von Wälz-und interagierenden Zellen wird von Wiese et al 11 beschrieben. Um den Prozentsatz der Neutrophilen Rollen auf der Endothelzellen zählen die Anzahl von Neutrophilen, die mehr als eine Zelle bewegt haben Durchmesser in einem Zeitraum von 5 Sekunden zu messen. Teilen Sie diese Zahl durch die Gesamtzahl der Leukozyten im Bereich um den Prozentsatz der rollenden Zellen zu bestimmen. Durch die Erweiterung, werden die restlichen Zellen als fest haftend.
- Messen Sie die Walzgeschwindigkeit von Neutrophilen durch Berechnung des Abstands der Neutrophilen in einer bestimmten Zeitperiode reist und dann geteilt durch diese Zeit in Sekunden.
- Transmigration durch Zählen der Anzahl von Neutrophilen, die ihre Form verändert haben und migriert unterhalb der Monoschicht 10 bestimmt. Diese Neutrophilen werden durch die Tatsache, dass sie andere als helle Phase ändern identifiziert werden, wenn auf der Oberseite der Monoschicht zum Sein Phase dunkel, wenn unterhalb der Monoschicht 10. Die Anzahl der Zellen transmigrierten kann als Prozentsatz der gesamten Zellen in der Blickfeld oder als Ausgangsmaterial ausgedrückt werden betäubtER von transmigrierten Zellen pro Flächeneinheit. In diesem Modellsystem, in der Regel 50% der Neutrophilen nach 10 Minuten transmigrieren.
7. Repräsentative Ergebnisse
Unstimulierten Endothelzellen unterstützen keine Rekrutierung von Neutrophilen. Im Gegensatz dazu stimulieren Endothelzellen mit TNF-α führt zu neutrophilen Rollen, feste Adhäsion und. Ein Beispiel für diese Daten ist in den 1 und 2 gezeigt. 1A zeigt Neutrophilen Interaktion mit TNF-α-stimulierte Endothelzellen hemmt. Diese Wechselwirkungen können quantifiziert werden, offenbart die Gesamtzahl der Neutrophilen die Interaktion mit den Endothelzellen sowie die Zahl der Neutrophilen Walzgut, fest haftende oder transmigrierten (Abbildung 2). Neutrophile Transmigration kann bei Zellverbindungen oder durch die Endothelzellen selbst auftreten. Um zwischen diesen zwei Bedingungen zu unterscheiden, werden endotheliale Zellen mit einem Anti-VE-c gekennzeichnet adherin Antikörper und Transmigration wird als vorkommenden paracellularly oder transzellulär (Abbildung 1B und C) erzielt. In diesem Modell ist praktisch alles parazellulären Transmigration 7.
Abbildung 1. Gleichzeitige DIC und Fluoreszenz-Imaging unter Flussbedingungen mit einem ibidi Kammer. (A) DIC Bild frisch Humanneutrophilen Migration auf menschliche Nabelschnur-Endothelzellen isoliert. Der gelbe Pfeil zeigt eine haftende Neutrophilen, die weiße Pfeilspitze zeigt eine transmigrierende Neutrophilen. (B) Endothelzellverbindungen wurden mit einem anti-VE-Cadherin-Antikörper, konjugiert an Alexa-[547] und abgebildet gefärbt. (C) zeigt Überlagerung von Kanal A und B aufschlussreich, dass praktisch alle transmigrierende in diesem Modell parazellulären ist. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
2. Endothelzellen wurden links unstimuliert oder mit 10 ng / ml TNF-α stimuliert. Nach 4 Stunden wurde eine parallele Platte Strömungskammer montiert und Neutrophile wurden hinüber zu 1 dyn / cm 2 perfundiert. (A) Neutrophilen-Interaktionen untersucht und gemessen mit ImageJ Software von NIH. Die Summe der interagierenden Zellen wurden als (b) Walz, fest haftende oder (C) transmigrierende gekennzeichnet. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM von 3 bis 5 Experimenten. Der Unterschied zwischen Kontroll-und TNF in Abb. A und C war signifikant (p <0,001).
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Discussion
Forscher haben routinemäßig Endothelzellen aus verschiedenen Gefäßbetten zur Rekrutierung von Neutrophilen und Seelenwanderung zu studieren. Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, dermale mikrovaskuläre Endothelzellen 12, Leber sinusoidalen Endothelzellen 13 und Endothelzellen aus menschlichen Nabelvene 10 begrenzt. Unter ihnen HUVEC gewonnen großer Beliebtheit wegen ihrer relativen Einfachheit der Isolation und Verfügbarkeit. HUVEC sind eine starke In-vitro-Modell, das viele Prozesse, die Endothelzellen in vivo auftreten nachahmt. Dieses Modell System zur Identifizierung von Adhäsionsmolekülen und Chemokinen kritischen bei der Rekrutierung von vielen Leukozytenunterklassen und aktiviert detaillierte Analyse, wie diese Prozesse reguliert werden unterstützt. In vitro-Untersuchungen mit HUVEC hat die Grundlage für in vivo Studien, die letztlich zur Verfügung gestellt haben ausgebildet besseres Verständnis und Behandlung von Erkrankungen des Menschen 14.
e_content "> In diesem Beitrag stellen wir ein schnelles und einfaches Verfahren zur Rekrutierung von Neutrophilen in vitro mit Hilfe eines ibidi Flusskammer zu studieren. Diese Art der Kammer hat mehrere Vorteile gegenüber anderen parallelen Platte Kammern weiter oben in diesem Journal 11. ibidi Kammern setzen sich aus gemacht ein Polymer mit optischen Eigenschaften ähnlich wie Glas, die dem Benutzer fluoreszierenden und DIC Bilder sowie Phasen-Kontrast-Bilder aufnehmen kann. Es gibt Kammern, die Deckgläser verwenden, um Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht, aber eine wachsende Endothelzellen auf Glas ist eine Herausforderung, da die Haftung Eigenschaft dieser Zellen erheblich verändern auf Glasoberflächen 15. Endothelzellen haften gut auf Kunststoff-Oberfläche, sondern Fluoreszenz-Imaging auf Kunststoff-Oberfläche ist nicht erreichbar. Mit der μ ibidi gleitet nicht nur beseitigt diese Probleme, aber auch sie benötigen viel weniger Probenvolumen als die anderen Methoden . Diese Folien ermöglichen auch die gleichzeitige parallele Versuche mit nur geringen Änderuation.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Pina Colarusso und das Live Cell Imaging Facility für ihre Unterstützung bei der Bildgebung und Bildanalyse; Frau Lailey für ihre technische Hilfe; und Einheit 51 an den Ausläufern Hospital in Calgary, AB für die Bereitstellung von menschlichen Nabelschnur. Dr. KD Patel ist eine Alberta Innovates: Health Solutions Scientist. Diese Arbeit wurde durch einen Betriebskostenzuschuss von der kanadischen Institutes for Health Research und Ausrüstung und Infrastruktur Zuschüsse von der kanadischen Stiftung für Innovation und dem Alberta Behörde für Wissenschaft und Forschung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
