Summary
我们提供一个简单的，半定量的方法来研究生物膜的形成
Abstract
生物膜，或封装在细胞外基质的细胞表面连接社区，代表了许多细菌的共同生活方式。细菌细胞内生物膜，往往表现出改变的生理，包括增强抗病能力，抗生素和其它环境压力1。此外，生物膜可以在宿主 - 微生物相互作用中发挥重要作用。生物膜细菌过渡时从个别发展，浮游细胞形成复杂的多细胞的社区2。在实验室，生物膜研究评估具体生物膜表型的发展。一种常见的生物膜表型涉及的皱纹或皱纹固体琼脂培养基菌落形成。皱落形成提供了一个特别简单的和有用的手段，识别和描述参展改变生物膜表型的菌株，并探讨影响生物膜形成的环境条件。 WRInkled集落形成作为生物膜形成的各种细菌，包括革兰氏阳性菌，如枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌，如霍乱弧菌 ， 副溶血性弧菌 ， 绿脓杆菌 7 6 5，指示灯， 弧菌鲵 8。
海洋细菌五鲵已成为一个模型对生物膜形成由于主机殖民化过程中生物膜的关键作用：生物膜产生五。鲵促进其殖民夏威夷短尾的鱿鱼Euprymna scolopes 8-10。重要的是， 在体外观察到的生物膜表型相关的五能力鲵细胞有效殖民宿主动物，：障株在体外生物膜形成具有殖民缺陷9,11，而株参展增加生物膜表型增强殖民8,12。 五。鲵 ，因此提供了一个简单的模型系统评估机制，细菌调节生物膜的形成和生物膜影响主机殖民。
在这份报告中，我们描述了一个半定量的方法来评估生物膜形成使用五鲵作为一个模型系统。这种方法涉及小心细菌培养，发现在规定的浓度和固体琼脂培养基上卷;花斑文化是一个单一的细菌菌落的代名词。可以利用这个'斑疹文化技术比较单一的，特定的时间点（终点法）总额的生物膜表型，或通过识别和表征生物膜发展和菌落直径测量过程检测微妙的生物膜表型，这是由生物膜形成的影响。因此，这种技术提供了一个生物膜形成的半定量分析，每mitting评价的时机和皱纹殖民地的发展和发展结构，超出了简单的整体形态特征的相对大小的图案。
Protocol
1。初步表征和注意事项
- 生物膜的形成是受细胞密度和增长率。因此，有必要确定增长率（光密度值（OD值）随着时间的推移增加）利益应变（S）和产量（最后的手机号码），通过执行简单的生长曲线和细胞电镀检测。在增长，或OD和细胞数量之间缺乏相关的缺陷，分析发现实验结果时，必须考虑到。
- 评估时形成皱纹的殖民地，作为小板到板的变化可能会影响生物膜的发展，包括在同一板块上的适当的阳性和阴性对照。
- 确定发现的最好的条件，即那些揭示之间的控制和突变（S）的利益，最明显的差异。生长在不同条件下，如不同的媒体或温度，液体培养菌株，不同阶段增长（指数或固定相）事先向斑点。文化点10μL，在适当的介质上的各种细胞密度，在所需的温度下，孵化直至菌落形态显现。
- 端点检测涉及评估皱纹的集落形成斑点（即48小时）后，在预定的时间点。这项评估是有益的菌株，展览（或拟参展）在生物膜形成的严重缺陷。
- 时间课程实验评估过了一段时间（即每隔一小时）后发现，集落形成皱纹。此法允许的生物膜形成的半定量评估，允许皱纹殖民地的形成和发展格局，过了一段时间开始的决心。对于一个给定的时间当然采集点的数量和实验的持续时间应确定在初步实验。
- 可以轻松地保持跟踪时间后发现，设置在IMER以计数。
2。 五皱菌落形态的微观评估鲵
- 接种五。到5毫升LB盐（LBS）的培养基13（1％W / V]蛋白胨，0.5％W / V]酵母提取物，2％W / V氯化钠，50毫米的Tris-HCl [ 鲵细胞pH值7.5），其中包含任何必要的抗生素和孵育，摇晃，一夜之间在28°C。在早晨，用1:100稀释的细胞传代到5毫升的新鲜磅中型和在同等条件下孵育，直到细胞已达到所需的600外径（例如，外径600 = 0.2或0.5）。
- 吸取1毫升到离心管和离心机最大速度为一分钟的离心集文化。删除愿望上清。洗细胞重新悬浮颗粒在1毫升70％的无菌人工海水（ASW）的（35毫米硫酸镁4 7H 2 O 7毫米氯化钙，以消除残余媒体和外组件2-2H 2，210毫米氯化钠，氯化钾7毫米），重复离心。水洗颗粒悬浮在1毫升70％反潜。
- 确保每个样品中含有相同数量的细胞，在600 nm的OD估计。额外的70％，屈臣氏集团更浓缩的样品稀释与任何必要的调整。在初步实验中，当场文化在不同的初始OD值，以确定一个最佳的起点外径为给定株或条件。得到最好的结果为五鲵从文化与外径约0.2点。
- 发现10μL洗细胞上的LBS板包含任何必要的抗生素。当察觉到文化的一个板块，确保稳定的正上方的琼脂表面移液器（用手指）。发现垂直，而不是在一个角度，慢慢弹出的光斑均匀分布的液体。通常每一株被发现一次，每盘（每盘长达6点），机智h动板（2-3），每个实验。
- 以确保均匀分布的斑点文化遗存，允许当场晾干后方可移动板的孵化器。反转板，培养他们在28°C。
- 在接种后12-15小时监测的增长点每小时开始的形态。我们用相机附件（PROGRES C10的平台 ）和PROGRES CapturePro和ImageJ的软件程序，观察和记录菌落形态和评估皱集落形成的开始和进展解剖范围（蔡司STEMI 2000-C的）。
- 在步骤2.5中列出的具体设置，从下面照射点与CL 1500 EC冷光源通过透明的玻璃舞台，而从上面捕获的图像。此设置是最佳成像皱纹殖民地发展，因为五鲵殖民地（点）是半透明的。
- 在ST中列出的特定设备的情况下2.5 EP，显示器皱纹菌落形态，使用任何解剖显微镜，允许全殖民地观看和有可调光源，最好，一个附加的相机。如果有必要，也可以利用数码相机在没有附加的相机，但是这是不是最佳的。
- 到最好的可视化皱纹殖民地的发展，这是必要的调整等，就可以看出端倪的三维形态的发展生物膜的细菌菌落下方的照明强度和反射角。确定最佳的照明条件下提供之间的强烈对比发现菌落周围的琼脂背景，这样的殖民地架构（皱纹）清晰可辨。
- 斑点殖民地色彩，在某些情况下，还必须考虑到，作为殖民地色彩的改变生物膜的形成过程中可能出现。调整光源的强度和角度揭示这些微妙的色彩变化。一旦达到相应的设置，在实验期间，他们保持。
- 多少时间的流逝，从接种时间的皱纹菌落形成启动每一株或条件时注意。定义为图案和三维结构的形成（即条纹形成的外缘或'涟漪'发生在中心）是第一个明显的时间点开始形成皱纹殖民地。突变的细胞可能会出现下降或增加皱纹的集落形成的起始时间（例如， 图2）。
- 通过捕捉适当的数字图像文件开始皱纹的集落形成和发展。收集整个实验过程中的图像时，重要的是要使用相同的放大倍率。切换从显微镜目镜的电脑屏幕上，使用位于相机背面的杠杆。当开关之间的目镜和电脑屏幕上观看，调整意见，并相应地对焦。
- 前成像斑文化，培养皿的盖子通常删除，以提供清晰的图像。然而，这是一个可选的步骤，可以通过使用设置步骤2.5和2.6中列出的盖子成像斑点文化。
- 皱纹的集落形成的开始，在每个时间点，请注意皱纹殖民地发展的格局。架构可能由内而外的发展，或外面。这个评估提供了一种机制来区分不同品系或不同条件下形成的生物膜。
- 在每个时间点测量发展菌落直径。这可以手工完成，或数字使用相关的软件程序。如果实现数字化，使用的PROGRES CapturePro的软件程序，并首次在实验中使用的具体倍率校准的标尺。包括在每个拍摄的图像的比例尺。
- 使用ImageJ的软件程序来计算菌落直径，打开每个图像文件。规范比例尺如下：选择“直线”选项“从工具栏。覆盖具有相同的长度和宽度的直线嵌入的比例尺。选择标记的标签“设置量表”，“分析”。在“已知的距离”框中，插入相应的长度（从原来的比例尺确定，也就是说，2毫米），并选择“OK”。
- 使用“直线”选项插入一个水平线上，整个现场。分析“选项卡下，选择”办法“。在新成果的窗口，将提供计算长度。通过插入垂直线跨当场获得第二次测量。重新计算直径。记录两次测量的平均值。图中每个点的平均直径在每个时间点使用的软件程序，如Excel。
- 实验结束时，无论是在指定的时间点，或当没有进一步生物膜的发展。一旦最终达成，合并成一个数字（S）的可视化发展的格局，超过时间使用软件程序，如PowerPoint的图像。
3。代表结果
在这些实验中，我们用五鲵作为一种模式生物，研究生物膜的形成，通过评估固体琼脂表面上的皱纹殖民地的发展。 五生物膜生产菌株具有广泛的三维建筑鲵形式的殖民地，40小时内（ 图1），8,9,14。当过一段时间课程研究，很明显的，通过控制应变的皱纹殖民地形成启动早约12小时后接种（上的具体情况而定）（ 图2）9。相比之下，有代表性的突变形成生物膜延迟约4小时，直到约16小时后接种9启动。 repea这些实验的TS建议的时机是比较一致的，这一评估半定量9。第二个半定量生物膜形成的措施，随着时间的推移发展殖民地的直径变化。正如图所示。 3A，具有代表性的的生物膜主管应变形成的殖民地，在相对 有代表性的菌株，并不构成生物膜的复杂性和直径增加。仔细测量发现，超过时间，这两个菌株形成的菌落直径的的生物膜主管殖民地的大小，在一个更大的比生物膜负的殖民地率增加，结束时间点在两个不同近2 - 倍（ 图3B）。因此，虽然后期有代表性的时间或“终点”的菌落形态的图像经常在文学，另外，半定量的数据可以被收集，将更好地了解允许生物膜缺陷的。
图1。终点检测。这个数字是一个终点检测，使用非生物膜形成（左）和生物膜形成（右）代表五株鲵 。在40小时后，发现这些图像采集。这些图像生成与野生型五鲵含矢量控制（非生物膜的形成）或RSCS过度质粒（生物膜的形成），并为Morris 等人，2011年收集的数据的一部分。
图2。时间课程实验。上游面板包含由生物膜主管的控制应变生物膜形成的代表图像五鲵在选定的时间过程。在12小时启动生物膜的形成是显而易见的。较低的面板包含代表我法师的一个五，突变株鲵 ，展品中的集落形成的皱纹随着时间的推移开始延误（4小时），在接种后16小时开始形成生物膜，。请注意，在40个小时的菌株看起来类似的强度和生物膜形成的图案，而这些菌株之间的细微差别仅在较早的时间点观察。这些图像生成与RSCS过度野生型和突变sypE五的鲵细胞和数据集收集Morris 等人。，2011。
图3。菌落直径为生物膜形成的半定量分析。 （一）代表生物膜形成（上图）和非生物膜的形成（下） 五株生物膜形成的时间过程鲵 。需要注意的是生物膜形成的应变表现出更大的增长随着时间的推移，相对非生物膜形成应变的直径。这些图像生成与野生型五鲵含有RSCS过度质粒（生物膜形成）或矢量控制（非生物膜形成）和部分数据设置为Morris 等人，2011年收集的。 （B）面板A.使用ImageJ的Excel软件生成这些数据在协议中所述的两个菌株在菌落直径随着时间的推移增加的图形表示。
Discussion
在这项工作中，我们描述了一个半定量的方法来评估生物膜形成使用V。鲵作为一种模式生物。具体来说，我们利用解剖显微镜用相机附件监视随着时间的推移皱纹殖民地形成了坚实的琼脂表面生物膜的形成和发展。在这个协议中，我们勾勒出两种方法，我们通常使用评估皱的集落形成的特定类型。首先是终点检测，这使我们能够在选定的“最终”的时间点观察最终的，整体的3D架构，图案，和花斑文化直径。这种方法是最有用的突变株或条件，导致生物膜形成中的戏剧性缺陷评估。然而，这种方法不区分更细微的差别在选定的终点前发生的时间点。为了更密切监察皱纹的集落形成，我们使用一个时间过程的检测，这使我们能够识别的W开始rinkled集落形成，随着时间的推移，看其发展。由于这种方法的结果，更细微的差别，集落形成皱纹，3D架构和模式的时机可以鉴别。我们利用这个时间当然法生成两个半定量检测生物膜的形成。首先，应变开始开发3D建筑的时间可以比对照菌株。我们发现，在生物膜形成一个特定的突变，在同等条件下的延迟是相当一致。例如，在图中显示的数据。 2，突变的一贯表现，约4小时延时启动生物膜的形成。半定量生物膜形成的第二个措施是皱的殖民地（点）的直径大小的变化。我们发现，皱纹菌落直径逐步不同于非生物膜殖民地的是，达到约2倍的差异，在结束时间点（ 图3 五霍乱一些皱纹菌落菌落直径在大幅增加的结果，而有的则没有15。仍然直径的变化，随着时间的推移评估可以帮助表征潜在的生物膜突变和/或提供额外的突变体的定量措施，延误发展。生物膜形成的两项措施（时间和直径），确定皱纹的集落形成的开始，是较为敏感，但也更主观，确定点的直径比。即便如此，这两项措施提供了一个表型的半定量的评估，这是非常有用的生物膜的研究人员，但不容易服从到quantificatioN。
当进行培养实验发现，重要的是要考虑在其中发现的菌株培养的环境条件。皱纹殖民地的形成往往受各种环境条件，包括养分供应，温度和湿度。为了减少实验之间的变异性，它是有助于规范这些条件尽可能多的可能（即规范平板一套体积和培养发现菌株在温度控制）。要进一步控制斑点实验之间的变异性，是重要的，包括在每一组实验中适当的控制株。最后，在解释这些实验数据，它是要执行任何一个实验多次（3 +），尤其是当评估在皱纹的集落形成的细微差别（例如，在生物膜形成延迟或图案的差异）。本协议的一些限制：1）确定ING细胞是否有增长的缺陷，可能很难：液体培养细胞的生长，可能无法准确反映固体培养基上，增长率和增长生物膜形成的细胞，这可能会粘在一起，可能无法准确测定; 2）菌株的生长缺陷问题的分析; 3）它可能无法区分菌株的直径与微妙的生物膜表型的差异;同心环在不长的4株），它可能无法准确地测量在直径变化; 5），而图案可以观察生物膜形成过程中，有没有办法量化，导致生物膜的图案; 6）有没有办法来衡量这个实验设置了生物膜的Z维。尽管有这些限制，但这个协议提供了一种手段获得的数值数据，以帮助评估皱落形成。
在这个协议中，我们利用一个特定的成像系统（即，蔡司解剖显微镜和PROGRES CapturePro成像软件）来观察和评估皱纹的集落形成。这里描述的是成像系统强大：检测皱纹的集落形成的开始，因此，同一个时间过程的方法评估发展的能力，通过解剖显微镜的使用大大增强。然而，如果这项技术是不可用的，该协议可以适用于其他设备的使用，包括一个简单的数码相机变焦焦点。虽然这个协议上的皱纹殖民地发展评估的重点，它也可以被修改，以评估薄膜的形成，生物膜的形式，发展当细胞生长在液体培养静态。该协议也可能被证明有用的评估生物膜形成的其他指标，包括纳入特定染料的生物膜发展过程中的斑点殖民地。这些措施包括，但不仅限于，染料，如刚果红和calcoflu的或可以绑定到纤维素的细菌生物膜的共同组成部分16。此外，该协议中，虽然使用与五鲵 ，并不仅限于这种微生物，但可以是广义的研究在许多不同的生物，如枯草芽孢杆菌 ， 霍乱弧菌 ， 副溶血性弧菌 6， 绿脓杆菌 7，所有展品皱集落形成，生物膜形成。最后，它也可以适应研究有一个发展模式，如可能， 绿脓杆菌 18增长17 黏细菌和天线结构的发展过程中出现的图案，其他菌落形态。因此，这个协议是微生物和生物膜的研究人员一般使用。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由健保局以R01授予GM59690授予索尼KLV支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | 45505300000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
| ProgRes C10PLUS | JENOPTIK Optical Systems GmbH | 017953-602-26 | Camera attachment (obtained through Lukas Microscope) |
| CL 1500 EC Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | 4355400000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
| ProgRes CapturePro | JENOPTIK Optical Systems GmbH | Free software with registered camera | Computer program for image capture |
| Image J | National Institutes of Health | Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | Computer program for diameter measurements |
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