Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En human æggelederen Model til undersøgelse af Published: August 11, 2012 doi: 10.3791/4036
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,4
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

Summary

Beskriver vi en

Abstract

Genitale infektioner med Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) er den hyppigste overføres seksuelt hos kvinder på verdensplan. Ineffektiv clearance eller persistens af patogener, som kan føre til opad infektioner i de øvre genitale område og formodes at forårsage kronisk inflammatorisk beskadigelse inficeret væv 1,2. Som en konsekvens heraf, kan det give alvorlige kliniske følgetilstande som pelvic inflammatory disease (PID), æggelederne okklusion og infertilitet forekomme 3,4.

Det meste af forskningen med C. trachomatis er udført i epiteliale cellelinjer (fx HEp-2 celler og HeLa-229) eller i mus. Som med celle-kultur-modeller, har de ikke afspejler fysiologi native væv eller patofysiologien af C. trachomatis genitale infektioner in vivo 5. Yderligere begrænsninger er givet ved det faktum, at de centrale signaleringskaskader (f.eks IFN-γ mediatED JAK / STAT signalering pathway), der kontrollerer intracellulære chlamydia vækst fundamentalt forskellig fra mus og mennesker 6,7. Vi og andre derfor etableret et helt organ æggelederen model til at undersøge direkte vekselvirkninger mellem C. trachomatis og humane æggelederen celler ex vivo 8,9.

Til dette formål blev humane æggeledere fra kvinder, der gennemgår hysterektomi indsamlet og inficeret med C. trachomatis serovar D Inden 24 timer efter infektion, model hvor analyseret ved anvendelse af scanningselektronmikroskopi (SEM) og transmissionselektronmikroskopi (TEM) til at detektere Chlamydia trachomatis medieret epitelbeskadigelse samt C. trachomatis optagelse dannelse af æggeledervæv.

Protocol

1. Fremstillinq af Chlamydia trachomatis-serovar D Stock

  1. Inficere konfluente 175 cm2 cellekultur kolbe indeholdende HeLa-229-celler med 4 ml C. trachomatis D i SPG buffer.
  2. Inkuberes i en time ved 37 ° C under konstant omrystning.
  3. Tilsættes 20 ml DMEM med 10% FCS og 240 pi cycloheximid.
  4. Inkuber i en befugtet inkubator i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
  5. Tilsæt 5 ml sterile glasperler, stærke ryste aftages og ødelægge C. trachomatis huser HeLa-229-celler.
  6. Samle bundfald, og der tilsættes yderligere 5 ml steril glasperler.
  7. Rock tre gange i 1 minut for at destruere alle HeLa-229-celler og frigivelse C. trachomatis.
  8. Centrifuge i 5 minutter ved 1000 RPMI og 4 ° C for at slippe af cellerester.
  9. Opsamle supernatanten til infektion fra 8 til 10 175 cm2 celledyrkningskolber sammenflydende grown med HeLa 229-celler.
  10. Inkuber hver kolbe med 4 ml SPG-puffer og 4 ml supernatant fra tidligere infektion i en time ved 37 ° C med konstant omrystning.
  11. Efter en time tilsættes 15 ml DMEM med 10% FCS og 230 pi cycloheximid efterfulgt af 48 timers inkubation ved 37 ° C og 5% CO2.
  12. Tilsæt 5 ml sterile glasperler, ryst at frigøre og ødelægge C. trachomatis huser HeLa-229-celler.
  13. Opsamle supernatanten, og der tilsættes yderligere 5 ml steril glasperler.
  14. Rock tre gange i 1 minut for at destruere alle HeLa-229-celler og frigivelse C. trachomatis.
  15. Centrifuge i 5 minutter ved 1000 RPMI ved 4 ° C for at slippe af cellerester.
  16. Opsamle supernatanten.
  17. Fylde 40 ml af supernatanten i 50 ml Falcon-rør og centrifugeres i 99 minutter med 11 tusind RPMI.
  18. Efter centrifugering supernatanten og vask centrifugebundfaldet med 1 ml SPG buffer.
  19. HomogeniserePelleten i 1 ml SPG og aliquot 20 gl i en 1, 5 ml eppendorfrør, opbevares ved -70 ° C indtil anvendelse. Biologisk aktivitet af det fremstillede bestanden blev bekræftet i en fast HeLa-229 celle-infektion model.

2. Fremstillinq af human æggelederen

  1. Detaljerede humane æggelederne (HFT) fra kvinder, som gennemgår hysterektomi umiddelbart efter kirurgi i RPMI indeholdende 5% FCS uden antibiotika i 4 ° C indtil præparatet. Protokollen blev godkendt af etisk komité ved University of Lübeck (09-153). Kvinder, der indgår i undersøgelsen (34 år indtil 53) havde ikke tidligere er C. trachomatis infektion. Væv i æggelederne blev opsamlet ved peripartum sterilisering af maternel anmodning under kejsersnit eller under hysterektomier grund symptomatiske uterusfibromer i den luteale fase. Alle HFT blev testet negativ for C. trachomatis ved hjælp af PCR.
  2. Dissekere HFT i en petriskål indeholdende RPMI med5% FCS uden antibiotika. Under hele behandlingen af ​​vævet skal nedsænkes i mediet for at forhindre udtørring.
  3. Afskåret og kassér bindevæv og væv ødelægges under kirurgi.
  4. Efter dissektion åbne HFT forsigtigt med en lille skalpel.
  5. For yderligere eksperimenter fremstille stykker af væv i størrelse på 0,5 cm x 0,5 cm til 1 cm x 1 cm.
  6. Til infektion lager HFT prøve i 1 ml RPMI indeholdende 5% FCS uden antibiotika. HFT prøver blev inficeret med 5.5x10 5 IFU (integration dannende enheder) af C. trachomatis.
  7. Inkuber HFT prøve i 37 ° C, 5% CO2 og 21% O2 og i 37 ° C, 5% CO2 og 2% O2 i 24 timer.
  8. Efter inkubationstid indsamle prøven, og opbevar det i Montis fiksativ i mindst tre dage ved 4 ° C indtil SEM / TEM præparatet.

3. Udarbejdelse af HFT Specimen for TEM

  1. ForTEM fjerne prøven fra Montis fiksativ og skæres 2 x 2 mm til 4 x 5 mm stykker. Det resterende væv kan anvendes til SEM.
  2. Vaskes stykker med natrium cacodylat puffer, pH 7,35 i 1 time.
  3. Inkuber i 1% (w / v) osmiumtetroxid i destilleret vand. natten.
  4. Fjernes overskydende osmiumtetroxid ved vask 6x5 minutter i natrium cacodylat puffer, pH 7,35.
  5. Fjerne vand ved inkubering i stigende koncentrationer af ethanol i vand (v / v) (30% i 2 timer, 40% i 2 timer, 50% i 2 timer, 60% i 2 timer, 70% i løbet af natten, 80% for 2 h, 90% i 1 time, 95% i 1 h, 100% i 1 time.
  6. Udvaske ethanol i 2 x 15 minutter i propylenoxid og derefter overføres til en blanding af 50% (v / v) frisk fremstillet Araldite (herunder alle komponenter) i propylen og inkuber natten over.
  7. Overførsel til frisk tilberedt Araldite (inklusive alle komponenter) i mindst 1 time.
  8. Overførsel til flade forankring forme og fylde med Araldite.
  9. Lad Araldite hærdemindst 48 timer ved 60 ° C
  10. Efter trimning af indlejret prøve skæres semi tynde sektioner (700 nm) på en ultramikrotom bruge glas knive eller en histo diamant kniv og plette med Richardsons pletten.
  11. Skær ultra-tynde sektioner (ca. 70 nm) ved hjælp af en diamant kniv og overførsel til kobber net (fx 150 kvadratiske masker).
  12. Plette ultratynde sektioner med 0,5% (w / v) uranylacetat i destilleret vand. efterfulgt af 3% (w / v) blycitrat i destilleret vand. i en automatisk sektion Stainer. Alternativt, kan sektioner farves manuelt ved at lade net 15 minutter på en mættet centrifugeret opløsning af uranylacetat i destilleret vand. efterfulgt af 0,3% blycitrat (w / v) i destilleret vand.

4. Fremstillinq af HFT prøveemne SEM

  1. For SEM fjerne eksemplar fra Montis fiksativ, Orient med epitel opad på en 1,5 x 1 cm kork plade og fastgør position ved hjælp af insekter nåle.
  2. Overfør prøven på kork til egnede metalkurve ogvask i 30 minutter i natrium cacodylat puffer, pH 7,35.
  3. Fjerne vand ved inkubering prøve i stigende koncentrationer af acetone / vand-blandinger (v / v) 30% i 6 timer, 40% i 6 timer, 60% i 8 timer, 70% i løbet af natten, 80% i 2 timer, 90% for 2 timer og 100% i løbet af natten (være yderst forsigtige med at holde modellen kontinuerligt nedsænket).
  4. Overfør frisk 100% acetone og tør prøve af det kritiske punkt tørring (40 ° C, tryk 80 bar).
  5. Fjern nåle, kork og lim eksemplar med epitel opad på SEM prøven mount er udstyret med en ledende kulstof fane med ledende kulstof cement. Brug flydende ledende sølv til at øge ledningsevne mellem holderen og den ledende kulstof fanen.
  6. Fremstilling af en ledende platin, guld eller palladium coating af prøven ved hjælp af en pådampningsbelægningsmaskinen.

5. Farvning af Semi tyndslib med Richardsons Stain

  1. Lad semi tynde sektioner tørt på dias.
  2. Plet sektioner med farvning opløsning ved 60 ° C i 1-2 min.
  3. Vask i destilleret vand.
  4. Tørre sektioner og dækglas.

6. Repræsentative resultater

I det menneskelige æggelederen infektion model var vi i stand til at visualisere forskelle i epitelmorfologi mellem de ikke-inficerede kontroller (figur 1) og C. trachomatis - inficerede rør (figur 2) under normoxisk tilstand. Karakteristiske morfologiske forskelle underforstået patogen-inducerede kvældning og lysis af æggeleder epitelceller, der ikke kunne påvises i ikke-inficerede kontroller. Brug semi tynde sektioner og transmissions elektron mikroskopi vi var i stand til at bevise intracellulær C. trachomatis optagelse dannelse i ex vivo-inficeret humant æggelederen væv (fig. 3, 5), men ikke i ikke-inficerede kontroller (figur 4). Da ilt koncentrationertioner i de kvindelige kønsorganer allerede er lav under fysiologiske forhold 11, og yderligere fald i løbet af en inflammatorisk proces vi også undersøgt vores model under hypoxiske betingelser. Foreløbige resultater tyder på modellen er nyttigt at analysere chlamydia vækst og afkom under varierende iltkoncentrationer. Chlamydia-induceret epitelcelle skaden skal adskilles fra artifakter, der er medieret gennem uforsigtig forberedelse og håndtering af æggelederne før infektion (figur 6).

Figur 1
Figur 1. Scanningselektronmikroskopi (SEM) af en ikke-inficeret humant æggelederens efter én dag inkubation i kontrolmediet (grøn pil viser cilierede celler, blå pil viser manglende cilierede celler).

Figur 2
Figur 2. Scanning elektron MICROS kopi (SEM) af en ex vivo C. trachomatis inficeret human æggelederen én dag efter infektion (hvid pil mærket lækkende integration).

Figur 3
Figur 3. Semi tynde sektioner viser typiske intracellulære inklusioner (hvide pile) 1d efter infektion af den humane æggeleder med C. trachomatis ex vivo.

Figur 4
Figur 4. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) af et ikke-inficeret humant æggelederen efter én dag inkubation i kontrolmediet.

Figur 5
Figur 5. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) af en ex vivo C. trachomatis inficeret human æggelederen én dag efter infektion (hvide pile markerer chlamydia indeslutninger).

ve_content "> Figur 6
Figur 6. Scanningselektronmikroskopi (SEM) af æggeleder epitel beskadiget gennem uforsigtig forberedelse og håndtering af prøven (hvid pil mærket nedbrudt epitelvæv).

Discussion

Visualisering af patogen-induceret skade på det inficerede væv er vanskelig og ofte begrænset til eksperimentelle procedurer i mus. Vi har etableret en ex vivo-infektion model i menneskelige æggelederne at analysere C. trachomatis infektioner i de øvre kvindelige kønsorganer. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde, var vi i stand til at visualisere C. trachomatis - induceret skader på menneskers æggeleder epitel løbet af en dag efter infektion. Cellulær hævelse og lyse var typiske morfologiske ændringer, der blev observeret i C. trachomatis - inficerede æggelederne, men ikke i ikke-inficerede kontroller. TEM-analyser viste, at chlamydier gennemføre en typisk intracellulær udviklingsmæssig cyklus i inficerede væv, viser store inklusioner med re-opdelte elementære organer, men også mindre indeslutninger med forstørrede netagtige organer, der kunne indikere vedholdenhed. Men det morfologiske billedet alene ikke nok til at skelne mellem REPLicating og vedvarende infektioner, der er karakteriseret ved reduceret metabolisme og forøget resistens over for antimikrobielle 10.

Ødelæggelse af epitel i inficerede æggelederne enten på grund af afbrydelse af C. trachomatis - inficerede epitelceller efter afslutningen af den intracellulære udviklingsmæssige cyklus og frigivelse af infektiøse elementære organer eller frigivelsen af pro-inflammatoriske cytokiner 8. Patogen-induceret vævsbeskadigelse og host-inducerede immunreaktioner mod C. trachomatis formodes at være de vigtigste faktorer, der fører til tab af epitelcelle funktion, fibroblast remodellering og endelig tubal infertilitet in vivo 8,11.

En af de vigtigste begrænsninger i denne model er fraværet af inflammatoriske celler, som hæmmer analyse af sekundære virkninger af den oprindelige C. trachomatis infektion af æggelederen epitel. Men modellen er APmæssig at undersøge forskellige miljøforhold (f.eks iltindhold), og den første host-immunrespons i akut C. trachomatis-infektioner 8,9. Yderligere planer er at etablere en model for afprøvning af antimikrobielle stoffer mod C. trachomatis i hele humane æggelederne og karakterisere de metaboliske tilstande af de forskellige udviklingsstadier observeret i den tubare epitel ved to-foton laser scanning-mikroskopi.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af DFG-Cluster of Excellence "Inflammation på grænseflader" (RA-Hvis RA-D). Vi er taknemmelige for den fremragende teknisk bistand fra Kristin Wischnat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-802
FCS PAA A15-101
Cycloheximide Sigma - Aldrich
SPG Buffer various see recipe below
Monti's fixative various see recipe below
sodium cacodylate buffer various see recipe below
Richardson's stain various see recipe below

Recipes:

1. SPG Buffer
  1. Add 75 g sucrose.
  2. Add 2.47 g disodium phosphate.
  3. Add 0.36 g monosodium phosphate.
  4. Add 0.72 g glutamic acid.
  5. Fill to 1 l with aqua dest.
  6. Adjust pH to 7.3.

2. 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.35.
  1. Add 42.80 g dimethylarsenic acid sodium salt.
  2. Add 68.46 g sucrose.
  3. Fill to 1 l with aqua dest. to get 0.2 M sodium cacodylate buffer.
  4. Before use dilute solution with aqua dest. to desired concentration and adjust pH to 7.35 if necessary.

3. Monti's fixative
  1. Add 156 ml 0.12 M sodium cacodylate buffer. 3.2 Add 25 ml 25% glutardialdehyde in aqua dest.
  2. Add 19 ml 10% paraformaldehyde in aqua dest.
  3. Add 3 ml 3% CaCl2 in aqua dest.
  4. Adjust pH to 7.35 and fill with aqua dest. to 312 ml final solution.

4. Richardson's stain
  1. Mix equal parts of 1% methylene blue in 1% aqueous borax solution and 1% Azur II in aqua dest.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping. J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).
  2. Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility. Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).
  3. Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).
  4. Mardh, P. A. Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).
  5. Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells. Mol. Cancer. 5, 55 (2006).
  6. Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells. Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).
  7. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
  8. Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection. Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).
  9. Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).
  10. Wyrick, P. B., Knight, S. T. Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin. J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).
  11. Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring. Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).

Tags

Medicin Infektion Mikrobiologi Fysiologi, Human æggeleder væv model scanningselektronmikroskopi transmissionselektronmikroskopi
En human æggelederen Model til undersøgelse af<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Infektioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jerchel, S., Knebel, G., König, … More

Jerchel, S., Knebel, G., König, P., Bohlmann, M. K., Rupp, J. A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections. J. Vis. Exp. (66), e4036, doi:10.3791/4036 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter