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Un modèle de tube de Fallope humaines des enquêtes sur Published: August 11, 2012 doi: 10.3791/4036
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,4
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

Summary

Nous décrivons une

Abstract

Les infections des voies génitales à Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) sont les plus fréquentes transmises sexuellement maladie chez les femmes à travers le monde. Clairance inefficace ou la persistance des agents pathogènes peut conduire à des infections croissant de la partie supérieure du tractus génital et sont censés provoquer chronique inflammatoire des dommages à 1,2 tissus infectés. En conséquence, grave séquelle clinique comme la maladie inflammatoire pelvienne (PID), l'occlusion des trompes et de l'infertilité peut se produire 3,4.

La plupart des recherches en collaboration avec C. trachomatis a été réalisée dans des lignées cellulaires épithéliales (par exemple cellules HEp-2 et HeLa-229) ou chez les souris. Cependant, comme avec la cellule-culture à base de modèles, ils ne reflètent ni la physiologie du tissu natif, ni la physiopathologie de la C. infections du tractus génital trachomatis in vivo 5. D'autres limitations sont donnés par le fait que centrales cascades de signalisation (par exemple l'IFN-γ mediated signalisation JAK / STAT voie) qui contrôlent la croissance intracellulaire Chlamydia diffèrent fondamentalement entre les souris et les humains 6,7. Nous et d'autres a donc établi un modèle organe entier des trompes de Fallope pour étudier les interactions directes entre C. trachomatis et humaines des trompes de Fallope ex vivo des cellules 8,9.

A cet effet, l'homme des trompes de Fallope de la femme devant subir une hystérectomie ont été recueillis et infectés par le C. trachomatis sérovar D. Dans les 24 heures après l'infection, spécimen, analysés par microscopie électronique à balayage (MEB) et microscopie électronique à transmission (MET) pour détecter Chlamydia trachomatis médiation lésions épithéliales ainsi que C. la formation d'inclusion trachomatis dans le tissu de Fallope.

Protocol

1. Préparation de Chlamydia trachomatis sérotype D Stock

  1. Infect confluente 175 cm 2 flacon de culture cellulaire contenant des cellules HeLa-229 avec 4 ml C. D trachomatis dans tampon SPG.
  2. Incuber pendant une heure à 37 ° C pendant une agitation constante.
  3. Ajouter 20 ml de DMEM avec 10% de SVF et 240 cycloheximide ul.
  4. Incuber dans un incubateur humidifié pendant 48 h à 37 ° C et 5% de CO 2.
  5. Ajouter 5 ml perles de verre stériles, Shake forte pour détacher et détruire C. trachomatis héberger HeLa-229 cellules.
  6. Recueillir le surnageant et ajouter un autre 5 ml de billes de verre stériles.
  7. Rock à trois reprises pendant 1 min pour détruire toutes les cellules HeLa-229 et la libération C. trachomatis.
  8. Centrifuger pendant 5 min à 1000 RPMI et 4 ° C pour se débarrasser des débris cellulaires.
  9. Recueillir le surnageant de l'infection de 8 à 10 175 cm 2 de culture de cellules confluentes flacons grown avec HeLa 229 cellules.
  10. Incuber chaque flacon avec 4 ml de tampon SPG et 4 ml de surnageant d'une infection antérieure pendant une heure à 37 ° C avec une agitation constante.
  11. Après une heure, ajoutez 15 ml de DMEM avec 10% de SVF et 230 cycloheximide ul suivie par 48 heures d'incubation à 37 ° C et 5% de CO 2.
  12. Ajouter 5 ml de billes de verre stériles, secouer pour détacher et détruire C. trachomatis héberger HeLa-229 cellules.
  13. Recueillir le surnageant et ajouter un autre 5 ml de billes de verre stériles.
  14. Rock à trois reprises pendant 1 min pour détruire toutes les cellules HeLa-229 et la libération C. trachomatis.
  15. Centrifuger pendant 5 min à 1000 RPMI à 4 ° C pour se débarrasser des débris cellulaires.
  16. Recueillir le surnageant.
  17. Remplir 40 ml de surnageant dans des tubes de 50 ml Falcon, centrifugeuse pour 99 min avec 11000 RPMI.
  18. Après centrifugation éliminer le surnageant et laver le culot avec 1 ml tampon SPG.
  19. Homogénéiser leculot dans 1 ml et SPG partie aliquote de 20 pl dans un 1, 5 ml tube Eppendorf, conserver à -70 ° C jusqu'à son utilisation. L'activité biologique du stock préparé a été confirmée dans un établi HeLa-229 modèle d'infection de cellules.

2. Préparation de la trompe de Fallope humaines

  1. Boutique de l'homme des trompes de Fallope (HFT) de femmes qui subissent une hystérectomie immédiatement après la chirurgie dans du RPMI contenant 5% de FCS sans antibiotiques dans le 4 ° C jusqu'à ce que la préparation. Le protocole a été approuvé par le comité d'éthique de l'Université de Lübeck (09-153). Les femmes incluses dans l'étude (âge de 34 ans jusqu'à ce que 53) n'avait pas d'antécédents d'avant C. trachomatis infection. Tissus des trompes de Fallope ont été recueillis à la stérilisation péripartum sur demande de la mère au cours de césariennes ou pendant une hystérectomie en raison de fibromes utérins symptomatiques dans la phase lutéale. Tous ont été testés HFT négatifs pour C. trachomatis par PCR.
  2. Disséquer le HFT dans une boîte de Pétri contenant du milieu RPMI avec5% de FCS sans antibiotiques. Au cours de l'ensemble du traitement du tissu doit être immergé dans les médias pour prévenir l'assèchement.
  3. Couper et jeter les tissus conjonctifs et des tissus détruits pendant la chirurgie.
  4. Après dissection ouvrir le HFT soigneusement avec un petit scalpel.
  5. Pour de plus amples expériences préparer des morceaux de tissu de la taille de 0,5 cm x 0,5 cm à 1 cm x 1 cm.
  6. Pour obtenir un spécimen HFT infection magasin dans 1 ml du milieu RPMI contenant 5% de FCS sans antibiotiques. Spécimens DFT ont été infectées par le 5.5x10 5 IFU (unités formant inclusion) de C. trachomatis.
  7. Incuber spécimen DFT à 37 ° C, 5% de CO 2 et 21% de O 2 ainsi que par 37 ° C, 5% de CO 2 et 2% de O 2 pendant 24 h.
  8. Après le temps d'incubation de recueillir des échantillons et magasin dans le fixateur de Monti pour au moins trois jours à 4 ° C jusqu'à ce que SEM / TEM préparation.

3. Préparation du spécimen HFT pour le TEM

  1. PourTEM retirer spécimen de fixateur Monti et couper 2 x 2 mm à 4 x 5 mm pièces. Le tissu restant peut être utilisé pour SEM.
  2. Laver pièces avec un tampon cacodylate de sodium, pH 7,35 pour 1 h.
  3. Incuber dans 1% (w / v) dans du tétroxyde d'osmium eau distillée. pendant la nuit.
  4. Retirez le tétroxyde d'osmium en excès par lavage min 6x5 dans un tampon cacodylate de sodium, pH 7,35.
  5. Enlever l'eau par incubation dans des concentrations croissantes d'éthanol dans l'eau (v / v) (30% pendant 2 h, de 40% pendant 2 h, de 50% pendant 2 h, de 60% pendant 2 h, 70% pendant la nuit, 80% pour 2 h, de 90% pendant 1 h, 95% pendant 1 h, 100% pendant 1 h.
  6. Laver à l'éthanol pour 2 x 15 min dans l'oxyde de propylène et ensuite transférer à un mélange de 50% (v / v) araldite fraîchement préparé (y compris tous les composants) dans propylène et incuber pendant une nuit.
  7. Transfert à l'araldite fraîchement préparé (y compris tous les composants) pendant au moins 1 h.
  8. Transfert à l'incorporation des moules plats et de remplir à l'araldite.
  9. Laissez durcir pendant aralditeau moins 48 h à 60 ° C
  10. Après le parage de l'échantillon intégré coupe semi sections minces (700 nm) sur un ultramicrotome en utilisant des couteaux de verre ou d'un couteau de diamant et histo tache avec de la lasure de Richardson.
  11. Couper coupes ultra-fines (environ 70 nm) en utilisant un couteau de diamant et le transfert à des grilles de cuivre (par exemple 150 à mailles carrées).
  12. Colorer coupes ultra-fines avec de l'acétate d'uranyle 0,5% (w / v) dans l'eau distillée. suivi de 3% (p / v) du citrate de plomb dans l'eau distillée. dans une section de coloration automatique. Sinon, les articles peuvent être colorés manuellement en laissant les grilles 15 min sur une solution saturée d'acétate d'uranyle centrifugé dans l'eau distillée. suivie par le citrate de plomb de 0,3% (w / v) dans l'eau distillée.

4. Préparation de l'échantillon HFT pour SEM

  1. Pour SEM retirer spécimen de fixateur Monti, orienter vers le haut avec l'épithélium sur un 1,5 x 1 cm feuille de liège et de fixer la position en utilisant des aiguilles d'insectes.
  2. Transfert spécimen sur liège pour paniers métalliques appropriés etlaver pendant 30 min dans un tampon cacodylate de sodium, pH 7,35.
  3. Enlever l'eau en incubant spécimen dans la concentration croissante de l'acétone mélanges eau / (v / v) 30% pendant 6 h, de 40% pendant 6 h, de 60% pendant 8 h, 70% pendant la nuit, 80% pendant 2 h, 90% pour les 2% h et 100 pendant la nuit (être extrêmement prudent de garder en permanence immergée spécimen).
  4. Transfert à 100% d'acétone fraîche et échantillon sec par séchage au point critique (température 40 ° C, pression 80 bars).
  5. Retirer les aiguilles, les bouchons et des échantillons de colle avec l'épithélium de montage vers le haut sur éprouvette SEM équipés d'une patte de carbone conducteur à l'aide de ciment de carbone conducteur. Utilisation liquide d'argent conductrice pour améliorer la conductivité entre le support et la patte de carbone conducteur.
  6. Préparer un revêtement conducteur de platine, d'or ou de palladium de l'échantillon en utilisant une coucheuse par pulvérisation cathodique.

5. Coloration des semi-Lames minces avec taches de Richardson

  1. Laissez semi-lames minces sèche sur la diapositive.
  2. Colorer les sections avec coloration solution à 60 ° C pendant 1-2 min.
  3. Laver à l'eau distillée.
  4. Sécher les sections et lamelle.

6. Les résultats représentatifs

Dans le modèle humain d'infection des trompes de Fallope, nous avons pu visualiser les différences dans la morphologie épithéliale entre les contrôles non-infectées (figure 1) et le C. trachomatis - tubes infectés (Figure 2) sous condition de normoxie. Caractéristiques des différences morphologiques implicite induite par des agents pathogènes gonflement et une lyse des cellules épithéliales trompes de Fallope qui ne pouvaient pas être détectées dans les contrôles non-infectés. Utilisation de semi-lames minces et microscopie électronique à transmission nous étions en mesure de prouver intracellulaire C. la formation d'inclusion trachomatis dans la infectées ex vivo de tissus humains trompe de Fallope (Figure 3, 5), mais pas dans les contrôles non infectés (Figure 4). Comme l'oxygène concentrationtions dans le tractus génital féminin sont déjà faibles dans des conditions physiologiques 11, et nouvelle baisse au cours d'un processus inflammatoire nous avons également étudié notre modèle dans des conditions hypoxiques. Les résultats préliminaires indiquent le modèle est utile pour analyser la croissance chlamydia et de la descendance dans les diverses concentrations d'oxygène. Chlamydia-induite lésions des cellules épithéliales doit être séparé des artefacts qui sont médiés par la préparation et la manipulation imprudente des trompes de Fallope avant l'infection (figure 6).

Figure 1
Figure 1. Microscopie électronique à balayage (MEB) d'une trompe de Fallope non-humain infecté après une journée dans un milieu d'incubation de contrôle (flèche verte montre cilié cellule, flèche bleue démontrer la non-cilié cellules).

Figure 2
Figure 2. Numérisation micros d'électrons copie (SEM) d'une trachomatis ex vivo C. infectés humaine trompe de Fallope une infection après jour (flèche blanche marque l'inclusion rupture).

Figure 3
Figure 3. Semi lames minces montrent typiques inclusions intracellulaires (flèches blanches) 1j après l'infection du tube humaine Fallope avec C. ex vivo trachomatis.

Figure 4
Figure 4. Microscopie électronique à transmission (TEM) d'un non-infectés trompe de Fallope humaine après une incubation dans un milieu de contrôle jour.

Figure 5
Microscopie électronique à la figure 5. Transmission (MET) d'un ex vivo C. trachomatis infection humaine trompe de Fallope une infection après jour (flèches blanches marquent inclusions à Chlamydia).

ve_content "> Figure 6
Figure 6. Microscopie électronique à balayage (MEB) de l'épithélium des trompes de Fallope endommagées par la préparation et la manipulation imprudente de l'échantillon (flèches marque blanche détruit les tissus épithéliaux).

Discussion

Visualisation de l'agent pathogène causée par des dommages au tissu infecté est ardu et souvent limitée à des procédures expérimentales chez la souris. Nous avons établi un modèle ex vivo l'infection dans les trompes de Fallope de l'homme pour analyser C. trachomatis des voies génitales supérieures. Par l'utilisation de cette méthode, nous étions en mesure de visualiser C. trachomatis - des lésions de l'épithélium du tube humaine Fallope dans l'jours après l'infection. Gonflement cellulaire et une lyse étaient des changements morphologiques typiques qui ont été observés en C. trachomatis - infectés trompes de Fallope, mais pas dans les contrôles non infectés. Analyses TEM a révélé que Chlamydia mettre en œuvre un cycle de type intracellulaire de développement dans les tissus infectés, montrant grosses inclusions avec re-différenciés des corps élémentaires, mais aussi les petites inclusions avec corps réticulés élargies qui pourraient indiquer la persistance. Cependant, l'image morphologique seule ne suffit pas à discriminer entre les replinfections intoxicantes et persistante, qui sont caractérisées par un métabolisme réduit et une résistance accrue aux antimicrobiens 10.

La destruction de l'épithélium des trompes de Fallope infectés est soit due à la perturbation de C. trachomatis - cellules épithéliales infectées après l'achèvement du cycle de développement intracellulaire et la libération de corps élémentaires infectieux ou la libération de cytokines pro-inflammatoires 8. Dommages aux tissus des agents pathogènes et l'hôte induite induits par les réactions immunitaires contre C. trachomatis sont censés être les principaux facteurs conduisant à la perte de la fonction des cellules épithéliales, fibroblastes remodelage et la stérilité tubaire, enfin in vivo 8,11.

Une des principales limites de ce modèle est l'absence de cellules inflammatoires qui entrave l'analyse des effets secondaires à l'initiale C. trachomatis de l'épithélium des trompes de Fallope. Cependant, le modèle est apappropriées afin de rechercher des conditions environnementales différentes (teneur en oxygène par exemple) et la première réponse immunitaire hôte à la phase aiguë C. trachomatis 8,9. D'autres plans sont d'établir un modèle pour les essais d'antimicrobiens contre C. trachomatis dans l'ensemble de l'homme des trompes de Fallope et de caractériser les états métaboliques des différents stades de développement observés dans l'épithélium des trompes par le 2-photons microscopie à balayage laser.

Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la DFG-cluster d'excellence "inflammation aux interfaces" (RA-Si, RA-D). Nous sommes reconnaissants pour l'assistance technique excellent de Kristin Wischnat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-802
FCS PAA A15-101
Cycloheximide Sigma - Aldrich
SPG Buffer various see recipe below
Monti's fixative various see recipe below
sodium cacodylate buffer various see recipe below
Richardson's stain various see recipe below

Recipes:

1. SPG Buffer
  1. Add 75 g sucrose.
  2. Add 2.47 g disodium phosphate.
  3. Add 0.36 g monosodium phosphate.
  4. Add 0.72 g glutamic acid.
  5. Fill to 1 l with aqua dest.
  6. Adjust pH to 7.3.

2. 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.35.
  1. Add 42.80 g dimethylarsenic acid sodium salt.
  2. Add 68.46 g sucrose.
  3. Fill to 1 l with aqua dest. to get 0.2 M sodium cacodylate buffer.
  4. Before use dilute solution with aqua dest. to desired concentration and adjust pH to 7.35 if necessary.

3. Monti's fixative
  1. Add 156 ml 0.12 M sodium cacodylate buffer. 3.2 Add 25 ml 25% glutardialdehyde in aqua dest.
  2. Add 19 ml 10% paraformaldehyde in aqua dest.
  3. Add 3 ml 3% CaCl2 in aqua dest.
  4. Adjust pH to 7.35 and fill with aqua dest. to 312 ml final solution.

4. Richardson's stain
  1. Mix equal parts of 1% methylene blue in 1% aqueous borax solution and 1% Azur II in aqua dest.

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References

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Médecine Numéro 66 infection microbiologie physiologie, Le tube de l'homme de Fallope modèle de tissu microscopie électronique à balayage microscopie électronique à transmission
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Jerchel, S., Knebel, G., König, … More

Jerchel, S., Knebel, G., König, P., Bohlmann, M. K., Rupp, J. A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections. J. Vis. Exp. (66), e4036, doi:10.3791/4036 (2012).

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