Summary
De intraluminale cerebralis occlusie bij muizen wordt hierin gepresenteerd. De omvang van herseninfarct wordt beoordeeld door een neurologische score en cresyl violet kleuring, een kleuring met TTC alternatief biedt het grote voordeel te testen in parallel veel belang markers.
Abstract
Beroerte is de derde doodsoorzaak en de belangrijkste oorzaak van invaliditeit in de wereld. Ischemische beroerte is goed voor ongeveer 80% van alle beroertes. De trombolytische weefsel plasminogeen activator (tPA) is de enige behandeling van acute ischemische beroerte dat bestaat. Dit leidde onderzoekers verschillende herseninfarct modellen ontwikkelen in een verscheidenheid van soorten. Twee belangrijke soorten knaagdier modellen ontwikkeld: modellen van globale cerebrale ischemie of focale cerebrale ischemie. Om ischemisch CVA na te bootsen bij patiënten, bij wie ongeveer 80% trombotische of embolische beroertes voorkomen op het grondgebied van de middelste cerebrale slagader (MCA), de intraluminale midden cerebrale slagader occlusie (mCaO) model is heel relevant voor CVA studies. Dit model werd ontwikkeld in ratten door Koizumi et al.. In 1986 1. Vanwege het gemak van genetische manipulatie in muizen, zijn deze modellen ook ontwikkeld in deze soort 2-3.
content "> Hierbij presenteren we de voorbijgaande MCA occlusie procedure in C57/Bl6 muizen. Eerdere studies hebben gemeld dat fysische eigenschappen van de occluder zoals tip diameter, lengte, vorm en flexibiliteit zijn kritisch voor de reproduceerbaarheid van de infarct volume 4. Hierin commerciële siliconencoating monofilamenten (Doccol Corporation) gebruikt. ander groot voordeel is dat het risico monofilament subarachnoïdale bloedingen veroorzaken vermindert. gebruiken Zeiss stereomicroscoop Stemi 2000 werd de siliconencoating monofilament ingebracht in de interne halsslagader (ICA) via een snede in de externe halsslagader (ECA) tot de afsluit monofilament de basis van de MCA. bloedstroom 1 uur later hersteld door verwijdering van het monofilament het herstel van de bloedstroom na te bootsen na lysis van een klonter in trombo mens. De mate van cerebraal infarct eerst worden beoordeeld door een neurologische score en door meting van de infarct volume.Ischemische muizen werden dus geanalyseerd op hun neurologische score op verschillende post-reperfusie keer. Het infarctvolume evalueren kleuring met 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) werd gewoonlijk uitgevoerd. Hierin hebben we cresyl violet vlekken, omdat het biedt de mogelijkheid om vele kritische markers te testen door middel van immunohistochemie. In deze video, rapporteren wij de mCaO procedure; neurologische scores en de evaluatie van het infarct volume door cresyl violet kleuring.Protocol
Voorbijgaande midden cerebrale slagader occlusie (mCaO)
1. Chirurgie Procedure (figuur 1)
Transient middelste cerebrale slagader occlusie (tMCAO) uitgevoerd op 2 - tot 3-maanden oude man C57Bl / 6 muizen (22-28g). Dit protocol werd goedgekeurd door de IRCM bio-ethiek commissie dierverzorging. Chirurgische instrumenten werden de autoclaaf (121 ° C bij 15 psi gedurende 60 min). Tussen elk dier werden ze gesteriliseerd met de hete kraal sterilisator (15 sec). Chirurgie tafel en andere apparatuur worden opgeschoond met behulp van 70% ethanol.
Twee uur voor de operatie werden muizen analgesized met buprenorfine (0,03 mg / kg bwip).
Figuur 1A.
- Diep verdoven muizen met isofluraan 5% en vervolgens onderhouden van de anesthesie op 2,5% isofluraan. Lichaamstemperatuur van de muizen constant gehouden tijdens de operatie met een verwarmingselement.
- Desinfecteer de vacht en skin met 70% ethanol of Betadine. Omdat scheren produceert haar fragment release, microabrasions en ontsteking die invloed kan hebben op een beroerte pathofysiologie, we scheren muis bont.
- Maak een middellijn incisie nek en trek uit elkaar van de zachte weefsels.
- Onder een stereomicroscoop (Stemi 2000, Zeiss) wordt een stompe dissectie uitgevoerd om de trachea en de spieren bloot te schuiven naar de halsslagader vinden.
- De linker gemeenschappelijke halsslagader (CCA) is zorgvuldig ontleed van het omringende weefsel en de CCA wordt tijdelijk afgesloten door een tijdelijke hechting (1) met behulp van 5-0 zijden hechtdraad snijd deze in 20 mm segmenten. Grote zorg moet worden betracht niet aan de nervus vagus schaden.
- Scheid de bifurcatie van de linker interne halsslagader (ICA) en externe halsslagader (ECA). Een permanente hechting (2) is geplaatst rond de ECA als distaal mogelijk en andere tijdelijke hechting enigszins strak (3) wordt op de ECA distaal van debifurcatie.
- Klem de linker ICA (4) met behulp van een reverse-actie pincet om te voorkomen dat bloeden. Grote zorg moet worden betracht niet aan de nervus vagus schaden.
- Snij een klein gat in de ECA (5) tussen permanente (2) en tijdelijke (3) hechtingen.
Figuur 1B.
- Introductie van een 12 mm lange 6-0 silicium gecoat (ongeveer 9-10mm gecoat silicium) monofilament hechting (Doccol Corporation) in de ECA (6), volledig afgesneden de Rekenkamer distaal van de permanente hechting en keren de occluder in de ICA . De hechting is strak gebonden rond de monofilament om bloedingen te voorkomen en de reverse-actie pincet worden verwijderd.
- De afsluiter wordt ingebracht om de oorsprong van de MCA in de cirkel van Willis occluderen. Stop met het inbrengen rond 9-10 mm voorbij de bifurcatie van de Rekenkamer en CCA. De occluder is geblokkeerd en kan niet meer bewegen. Wees voorzichtig dat u de pterygopalatine slagader door te dringen. De hechting (3) op de Europese Rekenkamer is tigHTLV gebonden aan de monofilament te fixeren.
- Sluit de huid met een autoclip wond sluitsysteem.
- Injecteer subcutaan 1 ml zoutoplossing en breng muizen onder een infrarode warmtelamp gedurende alle post-occlusie periode (60 min).
2. Herstel van het Midden-Cerebral arteriebloedstroom
Voor reanesthesia kan de neuroscore worden gecontroleerd om het succes van de operatie te evalueren.
- Verdoven de muizen zoals hierboven beschreven en verwijder de autoclips.
- Een klein stukje open de hechting (3) op de Rekenkamer om monofilament terugtrekking en bloed reperfusie mogelijk te maken.
- Permanent binden uit de tijdelijke hechting op de Rekenkamer om bloedverlies te voorkomen. De monofilament blijft voor hergebruik.
- Verwijder de tijdelijke hechting (1) op de CCA om bloed recirculatie mogelijk te maken.
- Sluit de wond. De muizen moeten krijgen nog eens 1 ml zoutoplossing subcutaan.
- Plaats de muizen in de infraroodverwarming lamp gedurende 1 uur. Na controle dat het dier mobiliteit herwint, wordt de muis terug naar zijn kooi en linksaf onder de verwarming pad en handdoeken voor 72 uur. Merk op dat slechts de helft van de kooi wordt op het verwarmingselement om muizen hun omgeving kiezen. Omdat postoperatieve gewichtsverlies aangetroffen, gepureerd voedsel wordt geplaatst in een petrischaal stimuleren eten.
Twaalf uur na de operatie, muizen een dosis van buprenorfine (0,03 mg / kg bwip).
3. Schijnoperatiegroep
Voor sham operaties, alle procedures zijn identiek, behalve dat de occluder niet is geplaatst.
4. Neuroscore
Neurologische tekorten maken de evaluatie van het succes van tMCAO net na reperfusie en later de schatting van de mate van ernst van het letsel. Neurologische tekorten worden gescoord zoals eerder beschreven 5 </ Sup> en uitgevoerd na 1, 24, 48 en 72 uur post-reperfusie. Een uitgebreide zes-punts schaal wordt gebruikt:
- 0: normaal.
- 1: mild omcirkelen gedrag met of zonder inconsistent draaien wanneer opgepikt door de staart, <50% pogingen draaien de contralaterale zijde.
- 2: mild overeenstemming omcirkelen,> 50% pogingen draaien de contralaterale zijde.
- 3: sterk en consistent en onmiddellijke cirkelen, de muis heeft een rotatie positie voor meer dan 1-2 sec, met zijn neus bijna het bereiken van zijn staart.
- 4: ernstige rotatie ontwikkelt zich tot vaten doen, het verlies van wandelen of oprichtreflex.
- 5: comateuze of stervende.
5. Cresyl violet kleuring (figuur 2)
Na PBS oplossing perfusie worden hersenen snel bevroren in isopentaan en opgeslagen bij -80 °C. muizenhersenen kan ook perfusie met 4% paraformaldehyde (PFA) afhankelijk van de geplande immunohistochemie studies. Cryostaat-cuts van coronale hersenen secties (17 micrometer) worden uitgevoerd. Een deel uit elke 30 is verzameld op dezelfde dia om een vertegenwoordiger hersenletsel hebben. Voor kwantificering volume zijn 2 glijbanen gekleurd met cresyl violet kleuring en een beeldanalysesysteem (Scion Corporation, Frederick, MD) werd gebruikt om de laesie te evalueren. De schade volume werd berekend in willekeurige eenheden (pixels), en uitgedrukt als een percentage van de contralaterale niet-gelaedeerde gebied voor elke sectie. Andere slides worden bewaard bij -80 ° C voor immunohistochemie studies. Als alternatief kan PFA-vaste hersenen worden gesneden bij 30-50 micrometer met behulp van vibratome en het infarct volume gemeten, zoals aanbevolen door Han et al.. (2009) 6.
Representative Results
De neuroscore evaluatie bevestigt het succes van tMCAO post-stroke en bepaalt de efficiëntie van de post-reperfusie tMCAO. In onze handen, alle muizen blootgesteld aan de intraluminale procedure moeten ten minste een mild consistente curling (neuroscore 2) en de neurologische tekorten algemeen stabiel tot 72 uur. De meeste muizen vertonen een milde consistente curling (neuroscore 2). Muizen met afwezigheid van curling zijn uitgesloten van de studie. Echter, de neuroscore evaluatie ons niet toe om tussen muizen onderscheiden met een gewonde hippocampus en mensen met een intact hippocampus.
Er werd geen sterfte waargenomen tijdens de operatie dag suggereert dat subarachnoïdale bloedingen niet optreden. Wanneer subarachnoïdale bloeding is geïdentificeerd in een muis, wordt deze systematisch uitgesloten van analyse. Het gebruik van silicium gecoate monofilament van Doccol Corporation, dat is gladder dan zelf bereide monofilamenten, vergroot het succes vantMCAO en vermindert subarachnoïdale bloedingen. Mortaliteit tussen 24 uur en 72 uur is 14% in dit model, zoals algemeen beschreven voor 60 minuten occlusie. Waargenomen mortaliteit is waarschijnlijk een grote infarctvolume in deze muizenstam. Een sterke reproduceerbaarheid laesie is ook waargenomen (standaarddeviatie 15%), die zeer interessant neuroprotectie moleculen waarin de effect (en) kan worden verborgen door de variabiliteit van het model te bestuderen.
De omvang van hersenletsel na tMCAO evalueren, hebben we gekozen om cresyl violet kleuring (figuur 2) te gebruiken in plaats TTC om veel materialen te testen relevant markers 6. De omvang van de laesie relatief consistent. Maar we gemerkt dat in sommige muizen, de hippocampus was gewond (ongeveer 30% van de muizen). Het is interessant op te merken dat cresyl violet vlekken kunnen worden toegepast later tot 1 week. In de literatuur is het percentage herseninfarct verschilt vanstudie naar de andere. Het hangt af van de keuze van muisstam, de verdoving, de dikte van hersensecties, gebruikte monofilament of de kleuring gebruikte 6, 7.
Figuur 1. Schema van de occlusie van de arteria cerebri media met behulp van silicium gecoate intraluminale monofilament. A. Vereenvoudigd schema van muizenhersenen en cerebrale slagaders die opeenvolgende hechtingen en clip op de introductie van silicium beklede monofilament bereiden. B. De positie van monofilament door de cirkel van Willis vertegenwoordigd. De monofilament wordt in ICA via ECA de basis van de MCA ACA, anterior cerebrale slagader af te sluiten;. BA, basilaire slagader, CCA, halsslagader, C. Willis, cirkel van Willis, ECA, uitwendige halsslagader artery, ICA, interne halsslagader, MCA, midden cerebrale slagader, PCA, posterior communiceren slagader, PPA, pterygopalatine slagader.
Figuur 2. Vertegenwoordiger coronale secties van de hersenen van muizen gekleurd met cresyl violet na 72 uur na reperfusie. Infarct gebied (voornamelijk striatum, cortex en de aangrenzende delen van de hersenen) verschijnt in het wit (onbesmet door cresyl violet). De blessure volume (witte gedeelte, rechter hersenhelft) was afgebakend en uitgedrukt als een percentage van de contralaterale niet-gelaedeerde gebied (linker hersenhelft).
Discussion
Verschillende slag modellen ontwikkeld gevolgen van een beroerte bij patiënten bootsen. De keuze van de slag is afhankelijk van het biologische kwestie. De intraluminale mCaO model bootst een van de meest voorkomende vormen van ischemische beroerte bij patiënten en is minder invasief en consistenter dan de Tamura model 4,7. Het is een heel interessant model voor neuroprotectie, neurorepair en celdood analyses. Het succes van de intraluminale model hangt af van vele factoren zoals dieren geslacht, leeftijd en gewicht, temperatuur, verdoving en het moment van chirurgie die moeten worden gecontroleerd. De fysieke proprieties van de occluder (tip diameter, lengte, vorm en fexibiliteit) zijn van cruciaal belang voor de consistentie van de mCaO 4. Hierin gebruiken we de 12 mm lange monofilament 6-0 bekleed met silicium 9-10 mm van Doccol Corporation. Het grote voordeel van deze monofilament is het verminderen subarachnoïdale bloedingen en omdat de lengte onder de ICAlengte, resterende bloedstroom, die afkomstig is van de voorste en achterste communiceren slagaders van de cirkel van Willis en PPA, wordt voorkomen en de variabiliteit in het infarct volume afneemt (15% van de variabiliteit in onze handen) 8. De hechting van de CCA vermindert ook de variabiliteit van het infarct volume 9.
De omvang van hersenletsel volgende tMCAO kan worden bepaald door verschillende manieren. Neurologische gebreken kan worden gemeten zoals eerder vermeld. Het is echter moeilijk om een doelmatige maatregel hebben op deze manier. De omvang van het infarct wordt gewoonlijk uitgevoerd door TTC kleuring. Meer recent zijn magnetische resonantie technieken ook een bijzonder interessante technologie voor neuroprotectieve behandelingen. Het begrijpen van de onderliggende cellulaire mechanismen van beroerte zoals neurorepair, celdood of celproliferatie, de studie van een markers door immunohistochemie is kritisch en zeer informatief. Aldus onze protocolol gedeelte van de hersenen preparaten heeft het grote voordeel dat deze analyses en minimaliseert het aantal gebruikte muizen. Bovendien Tureyen et al. 10. Gemeld dat er een goede correlatie tussen cresyl violet kleuring en TTC.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicterende belangen te onthullen.
Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Zeiss, Inc
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door een CIHR TEAM subsidie # CTP 82946, een CIHR subsidie # MOP 102741, evenals een Canada stoel # 216684 en een Strauss Foundation. ER werd ondersteund door een beurs van de Canadese Heart & Stroke Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope |  Zeiss |
Stemi 2000 | |
| Fiber-Light High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries Inc. | ||
| Anesthesia system for isoflurane | |||
| Isoflurane | CDMV | 108737 | |
| Heating blanket | Gaymar Medsearch | TP22G | |
| Infrared heating lamp | |||
| Ultra fine tweezers, style 5 | Electron Microscopy Sciences | 78320-5TI | |
| Vannas Scissors 3 mm Cutting Edge, Straight | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | |
| Style LA-1 and MPF-1 All smooth blades | Electron Microscopy Sciences | 77926-5S | |
| Negative action tweezers, style KOPINC 5 | Electron Microscopy Sciences | 72850-F | |
| Dissecting scissors 5 1/2" Straight | Cedarlane | 72960 | |
| Autoclip starter set | Harvard apparatus | 34-0557 | |
| BD Autoclip Wound Closing Syst., 9mm long,100/pk | Fisher | 01-804-5 | |
| 5-0 suture | Harvard apparatus | 517763 | |
| Suture material PDS II monofilament violet, 5-0, RB-1; Z303H | CDMV | 6167 | |
| 12 mm-long 6-0 silicon-coated monofilament suture | Doccol Corporation | 60SPRePK5 | |
| Seringes 1ml | Fisher | 14-823-2F | |
| Needles 26G1/2 | Fisher | BD-305111 | |
| C57BL/6 mice | IRCM |
References
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. rain infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia. Neuroreport. 5, 293-296 (1993).
- Yang, G., Chan, P. H., Chen, J., Carlson, E., Chen, S. F., Weinstein, P., Epstein, C. J., Kamii, H. Human copper-zinc superoxide dismutase transgenic mice are highly resistant to reperfusion injury after focal cerebral ischemia. Stroke. 25, 165-170 (1994).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition. J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia. J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).
- Han, R. Q., Ouyang, Y. B., Xu, L., Agrawal, R., Patterson, A. J., Giffard, R. G. Postischemic brain injury is attenuated in mice lacking the beta2-adrenergic receptor. Anesth. Analg. 108, 280-287 (2009).
- Rousselet, E., Marcinkiewicz, J., Kriz, J., Zhou, A., Hatten, M. E., Prat, A., Seidah, N. G. PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke. J. Lipid Res. 52, 1383-1391 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1986).
- Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J. Neurosci. Methods. 174, 18-24 (2008).
- Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Res. 970, 131-192 (2003).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).
