Summary
Cette vidéo montre une procédure pour le traitement de la dissection pancréas humain dans des formats multiples de stockage. L'orientation anatomique est maintenu dans toutes les régions du pancréas pour permettre la définition de la composition et la densité de l'îlot régionale.
Abstract
Cette dissection et la procédure d'échantillonnage a été développé pour le réseau de donneurs d'organes pancréatiques avec diabète (nPOD) programme visant à normaliser la préparation du pancréas récupéré de donneurs d'organes cadavériques. Le pancréas est divisé en 3 régions principales (tête, corps, queue), suivis par série des coupes transversales à travers le dedans de l'axe latéral. Sections alternées sont utilisées pour la paraffine fixe et frais blocs congelés et des échantillons restantes sont hachées pour la préparation des échantillons congelés pression, avec ou sans inhibiteurs de RNAse, de l'ADN, l'ARN, ou l'isolement des protéines. L'objectif global de la procédure de dissection du pancréas est d'échantillonner le pancréas entier, tout en conservant l'orientation anatomique.
L'hétérogénéité des cellules endocrines en termes de composition des îlots, la taille et le nombre est indiqué pour des îlots humains par rapport à 1 îlots de rongeurs. La majorité des îlots humains à partir de la tête du pancréas, les régions du corps et la queue sont composées de l'insuline-containing les cellules ß suivie par de plus faibles proportions de glucagon contenant les alpha-cellules et la somatostatine contenant ô-cellules. Le polypeptide pancréatique des cellules contenant PP et les cellules epsilon ghréline contenant sont également présents mais en petit nombre. En revanche, la région unciforme contient îlots qui sont principalement composées de cellules pancréatiques PP polypeptide contenant 2. Ces variations régionales des îlots de Langerhans proviennent des différences de développement. Le pancréas se développe à partir des bourgeons pancréatiques ventrale et dorsale de l'intestin antérieur et après la rotation de l'estomac et du duodénum, les lobes se déplace ventrales et fusibles avec la 3 dorsale. Le lobe ventrale forme la partie postérieure de la tête y compris le processus unciforme tandis que le lobe dorsale donne lieu à la suite de l'organe. La variation du pancréas régional est également signalé à la région de la queue ayant une densité plus élevée par rapport à l'îlot d'autres régions et les dorsales du lobe dérivés composants qui subissent une atrophie sélective diabète de type 1 Organes et de tissus supplémentaires sont souvent récupérés par les donneurs d'organes et incluent des ganglions lymphatiques du pancréas, la rate et les ganglions lymphatiques non-pancréatiques. Ces échantillons sont récupérés avec des formats similaires à ceux de l'pancréas avec l'addition d'isolement de cellules cryoconservées. Lorsque le duodénum proximal est inclus avec le pancréas, la muqueuse duodénale peuvent être collectées pour des blocs de paraffine et congelées et préparations pression hachés surgelés.
Protocol
1. Mise en place
- Cassettes d'étiquettes pour des blocs de paraffine manuellement avec un crayon, ou automatiquement avec une imprimante à cassette. Inclure l'identificateur du donneur (CASEID), type d'échantillon, le nombre aliquote, et toute autre identification unique (feuille de calcul de cas, l'annexe 1 ).
- Étiquettes moules PTOM comme pour les cassettes avec un marqueur permanent. Découpez des rectangles de 5-10 cm de papier d'aluminium.
- Imprimer ou manuellement l'étiquette avec un marqueur permanent, tous les flacons et tubes. Inclure flacons assez pour les échantillons composant logiciel enfichable hachés surgelés et les tubes avec les médias pour les expéditions RPMI frais. Pour les flacons congelés pression avec RNAlater, ajouter 1 ml à chaque RNAlater cryovial.
- Conseils de dissection Set-up en matière de biosécurité capot et les comptoirs avec des instruments de dissection stérilisés (forceps, scalpels, lames, tampons de gaze (4x4)) ainsi que des cassettes et des moules PTOM classées par ordre d'utilisation.
- Préparer un bain de congélation par la miseglace sèche dans une zone de mousse de polystyrène de taille moyenne (10x10 cm) à une profondeur d'au moins 3 cm et ajouter l'isopentane jusqu'à ce que la glace sèche est complètement recouverte.
- En option: Remplir un petit récipient Dewar d'azote liquide.
- Si le pancréas est nécessaire pour la microscopie électronique (EM), de préparer fixateur Taab par l'ajout de 1,25 ml de paraformaldéhyde 16%, glutaraldéhyde à 1,25 ml 8%, et 7,5 ml 0,1 M PBS. Préparer fixateur Lowicryl en ajoutant 2,5 mL de paraformaldéhyde 16% à 7,5 mL du PBS 0,1 M.
- Préparer des solutions utilisées pour isoler des cellules. Pour bouteille de 500 ml de DMEF (avec de la glutamine), suivez les techniques d'asepsie tout en ajoutant ce qui suit:
- Sérum de veau fœtal (FBS): ajouter 50 ml, 10% final.
- Pénicilline / streptomycine (Pen / Strep, 10.000 U / ml / 10000 ug / ml de bouillon) - ajouter 5 ml Pen / Strep stock de RPMI pour une concentration finale de 100 U / ml / 100ug/mL. Aussi, ajoutez 5 ml d'un flacon de 500 ml de DPBS lorsqu'ils sont utilisés pour la tenue de ganglions lymphatiques ou la rate des échantillons.
2. Personnel
3. Dissection du pancréas
- Retirez le duodénum et de la rate et nettoyer le pancréas de graisse superflus, les vaisseaux et les nerfs à l'aide dissection et forte
- Placez le pancréas nettoyé sur une planche de dissection couverte avec du papier absorbant. Trempez un coton-tige à l'encre bleue et la propagation à la surface antérieure du pancréas. Éponger l'excédent.
- En option: Trempez un nouvel applicateur à l'encre noire et la propagation sur la face postérieure du pancréas. Retour du pancréas à l'orientation normale avec la surface antérieure face prosecteur.
- Couper le pancréas dans 3 régions: la tête, le corps et la queue (Figure 1). Couper la jonction entre head et le corps, puis divisez la partie restante dans ~ portions égales pour le corps et la queue.
- Peser chaque région du poids du pancréas et l'enregistrement (Affaire bilan feuille ( annexe 1 )).
- Section (~ 0,5 cm) de chaque région du pancréas dans un transversal "pain" de manière (Figure 1).
- Utilisez les sections des deux jonctions entre les régions pour les échantillons hachés. Selon la taille du pancréas, un échantillon de la région de jonction corps-queue peut être difficile à obtenir dans ce cas, le nombre de blocs de paraffine peut être diminuée pour obtenir des échantillons ou des échantillons hachés seulement de la tête et le corps du pancréas région peut être obtenu. Cryotubes étiquette selon la tête ou le corps pour désigner la région proximale à la jonction.
- Mince morceaux et répartir également entre les cryotubes (≥ 1 gramme par flacon). Congeler rapidement flacons sans RNALater dans l'azote liquide ou dans la glace sèche - suspension isopentane puis transfert to -80 ° C au congélateur.
- Conserver les flacons avec RNALater à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre l'équilibrage, remix et congeler rapidement dans l'azote liquide ou dans la glace sèche-isopentane bouillie puis transférer dans un congélateur à -80 ° C.
- Supprimer les sections en alternance pour les blocs de paraffine et des PTOM à compter avec de la paraffine (Figure 1).
- Penchez-vous toutes les sections transversales vers la droite.
- Lieu ~ 1,5 x 1,5 x 0,5 cm dans les sections cassettes. Si les sections transversales sont trop gros, coupé en deux (Figure 2b). Cassettes d'étiquettes pour moitié antérieure bleu comme «A» et la moitié postérieure comme «B».
- Si les morceaux sont encore trop grande, couper chaque section perpendiculaire à la coupe précédente (figure 2c). Cassettes d'étiquettes AD dans le sens horaire. Coupez des morceaux plus que nécessaire pour s'inscrire dans des cassettes.
- Blocs de numéros de façon séquentielle au sein de la région, en commençant par la partie la plus médiale.
- Pour les blocs de paraffine, la position cassettes de sorte que le marqueur est à l'endroit gauche et le tissu dans la cassette, le maintien de son orientation. Couvercle de la cassette Fermer et transférer dans un récipient avec 500 ml ~ 10% du formol tamponné neutre (FBN). Début de fixation moment où la dernière cassette est placée dans un fixateur.
- Pour les blocs de PTOM, versez une couche mince de l'OCT médias dans le moule puis posez prelabeled le tissu dans le moule en veillant à maintenir l'orientation et de couvrir tout le tissu avec octobre Rapidement immerger des moules dans un PTOM de la glace sèche - suspension isopentane pendant ~ 1 minute. Retirer du lisier et le lieu sur la glace sèche pour le stockage temporaire ou -80 ° C congélateur pour le stockage à long terme.
- Obtenir ~ 0,5 x 0,5 cm tranches de la jonction tête-corps pour la microscopie électronique (EM). Placer une tranche dans le fixateur Taab et l'autre tranche dans le fixateur Lowicryl. Conserver les deux types de fixateur avec des échantillons à 4 ° C pendant au moins 48 heures et / ou indéfiniment jusqu'à ce que le traitement ultérieur des EM.
4. Spleen, dissection des ganglions lymphatiquestions et duodénal dissections Muqueuse
- Isoler les nœuds lymphatiques du pancréas (PLN) de la graisse et enlevez tout le tissu conjonctif de la capsule du ganglion. Placer dans un plat de culture cellulaire stérile contenant DMEF. Selon le nombre total isolé, il faut diviser PLN en aliquots pour les expéditions fraîches, congelées, isolations de cellules de paraffine et / ou des blocs de PTOM, et les flacons. Mince nœuds grands en morceaux pas plus de 0,5 cm.
- Mince ganglions lymphatiques non-pancréatiques et de la rate dans de petites (~ 0,5 cm) cubes. Lieu dans un fixateur, OCT médias, et pour les expéditions ou DMEM échantillons frais ou les isolants cellulaires cryopréservés selon quantités de matières premières.
- Ouvrez le duodénum et essuyez doucement la muqueuse duodénale propre de la muqueuse avec une compresse de gaze humide. Coupez les sections de la muqueuse de la paraffine et / ou congelés blocs PTOM et des échantillons pour flacons hachée, avec et sans RNAlater. Congelez comme pour les autres échantillons.
5. Wrap blocs PTOM en pré-étiquetés feuille d'aluminium et placer des blocs PTOM et flacons dans des boîtes pour le stockage à long terme à -80 ° C.
6. Soumettre des échantillons fixes pour le traitement de paraffine
- Fixer les tissus pendant 16 heures (plage de 20 ± 4 heures) à l'aide d'un processeur de paraffine automatique ou en utilisant le chronométrage manuel. Processus de blocs de paraffine en utilisant un processeur automatique ( Annexe 2 ).
- Incorporer les sections de l'orientation exacte par ce prosecteur avec l'étiquette de cassette vers la gauche. Intégrer la muqueuse duodénale avec la surface de coupe vers le bas pour permettre l'examen de la perpendiculaire à la muqueuse sous-muqueuse.
7. Nettoyer les zones de dissection et à désinfecter. Laver instruments de dissection et re-stériliser. Placez les tissus résiduels de l'homme dans le fixateur de formol pour le stockage de déchets biomédicaux. Jeter les déchets biomédicaux conformément aux réglementations locales délai d'un mois.
8. Mise à jour du Système d'inventaire des échantillons
ve_title "> Résultats représentatifs 9.Cette procédure va traiter d'un pancréas humain intact avec un échantillonnage représentatif tout au long de l'organe, y compris la délimitation des trois grandes régions, à savoir, tête, corps et la queue dans les 2 heures. La région unciforme, trouvé dans la région postérieure de la tête, est inclus dans la dissection de tête. Le poids du pancréas médian des donneurs d'organes sans le diabète est de 82,4 grammes (52,7 - 139,0 grammes). Poids du pancréas régionaux étaient à peu près égale (Figure 3).
Cette procédure peut également permettre la reconstruction du pancréas entier en utilisant les lames colorées de la paraffine et des blocs séquentiels PTOM. Plusieurs formats sont possibles permettant une utilisation maximale des technologies actuelles et futures. La feuille de calcul cas actuel nPOD est fourni ( Annexe 1 ) qui est utilisé pour documenter échantillons récupérés et proc ultérieureesser par types et les quantités aliquotes.
Figure 1. Diagramme d'ensemble de la procédure. Le pancréas est entièrement traitée, tout en maintenant les orientations anatomiques. La région de tête est plus longue dans l'axe supérieur-inférieur en raison de la présence du lobe pancréatique ventrale dans la région postérieure qui comprend la région unciforme. Zone hachurée au niveau des jonctions désigner les régions utilisées pour les échantillons hachés dans cryotubes. P, paraffine, O, EAO.
Figure 2. Régime lettrage pour les sections du pancréas. Tranches transversales du pancréas peut encore être divisé en deux moitiés ou des quartiers et une lettre dans le sens horaire.
Figure 3. Poids du pancréas de donneurs d'organes sans le diabète. Lespancréas intact provenant de donneurs adultes (> 17 ans) ont été pesés, puis divisé en régions et les poids régionaux obtenus. Les données sont des moyennes ± SEM (n = 15).
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Discussion
L'objectif de cette procédure est de définir un traitement pancréas standard qui peut être harmonisé à travers les sites de collecte multiples et permettre ainsi la comparaison des résultats obtenus par les différents groupes. La méthode de dissection est basé sur le standard chirurgicales pratiques de pathologie avec des mesures supplémentaires pour l'annotation des régions importantes du pancréas suivi par voie intra-régionaux subdivisions. Normalisation des méthodes de traitement des échantillons biologiques est nécessaire pour faciliter la collecte d'échantillons de haute qualité illustrée par la publication des meilleures pratiques pour la collecte des échantillons biologiques issus d'organisations nationales biobanques comme le National Cancer Institute 6. La biobanque d'échantillons du pancréas de l'homme des bailleurs de fonds représentant divers stades du diabète et des populations de contrôle appropriées ont été signalés 7-9. Cependant, les détails exacts de ces échantillons prélevés dans la région la tête du pancréas ont fait défaut. Grande hétérogénéité inter-individuelle îlot est bien connu wie en place à 5 fois les variations de distribution de la taille des îlots de telle sorte que l'annotation de la région du pancréas est nécessaire lors de l'analyse hétérogénéité inhérente 10. Traitement des échantillons pancréatiques dans des formats standardisés aidera à résoudre les facteurs individuels du patient afin que d'autres facteurs sous-jacents des maladies clés peuvent être mieux résolus.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les familles des donneurs et des d'approvisionnement en organes impliqués dans cette recherche et Maria Martino et Irina Kusmartseva pour leur aide d'experts. Ce travail a été financé par la Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) à l'appui du Réseau des donneurs d'organes atteints de diabète pancréatique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura Finetek | ||
| Sakura VIP300 | Sakura Finetek | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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