Summary
このビデオでは、複数のストレージ形式にヒト膵臓を処理するための解剖の手順を示しています。解剖学的なオリエンテーションは、地域の膵島の組成と密度の定義を可能にするために、膵臓領域を通して維持されています。
Abstract
この解離およびサンプリング手順は、死体臓器提供者から回収された膵臓の準備を標準化するための糖尿病（nPOD）プログラムと膵臓の臓器提供者のためのネットワーク用に開発されました。膵臓は、横軸の内側全体に連続横断切片に続いて3つの主要領域（頭、体、尾）に分かれています。交互にセクションが固定パラフィン包埋に使用され、新鮮凍結ブロックと残りのサンプルは、DNA、RNA、またはタンパク質を分離するため、RNアーゼ阻害剤の有無に関わらずどちらかは、スナップ凍結試料調製のために刻まれています。膵臓の解剖手順の全体的な目標は、解剖学的配向性を維持しながら、全体の膵臓をサンプリングすることである。
膵島組成、サイズ、および数字の面で内分泌細胞の不均一性は、齧歯類膵島1に比べてヒト膵島 のために報告されています。膵頭部、膵体尾部領域からのヒト膵島の大半はインスリンcontaininで構成されていますgのβ細胞は、低い割合に続いてグルカゴンを含有するα細胞、δ細胞をソマトスタチン含有します。膵臓ポリペプチドを含有するPP細胞とグレリン含有イプシロン細胞も存在するが、少数である。対照的に、鉤状領域は主に2膵ポリペプチドを含有するPP細胞から構成されている島が含まれています。これらの地域の膵島バリエーションが発達の違いから生じる。膵臓は、前腸と胃や十二指腸、背3腹葉の動きやヒューズの回転後の腹側と背側膵臓芽から開発しています。腹葉は背側葉、臓器の残りの部分を生じさせる一方鉤状突起を含む頭部の後方部分を形成する。地域の膵臓の変化はまた、尾部領域では1型糖尿病で選択萎縮を受けて他の地域と背側葉由来の成分に比べて高い膵島密度を有すると報告されている 追加の臓器や組織は、多くの場合、臓器提供者から回収し、膵臓のリンパ節、脾臓および非膵臓リンパ節を含んでいる。これらのサンプルは、凍結保存細胞の単離を加えた膵臓の場合と同様の形式で回収される。近位十二指腸が膵臓に含まれている場合は、十二指腸粘膜にはパラフィンや冷凍ブロックとひき肉スナップ凍結の準備のために収集されることがあります。
Protocol
1。セットアップ
- 鉛筆で、または自動的にカセット·プリンタを手動でパラフィンブロックのラベルカセット。ドナー識別子（CaseID）、サンプルの種類、分量番号、および任意の追加を一意に識別（ケースワークシートが含ま付録1 ）。
- 永久的なマーカーでカセットのラベルとして10月の金型。アルミ箔の5-10 cmの長方形を切り取ります。
- 永久的なマーカーすべてのバイアル、チューブのラベルを印刷するか、手動で。新鮮な出荷のためのRPMIメディアとひき肉スナップ凍結サンプルとチューブの十分なバイアルが含まれています。 RNAlater中でスナップ凍結バイアルについては、各クライオバイアルに1 mLのRNAlaterを追加します。
- 滅菌解剖器具（鉗子、メス、刃、ガーゼパッド（4×4））と同様の使用順に並んでカセットや10月の金型バイオセーフティーフードとカウンタートップの解剖ボードを設定します。
- 置くことによって、凍結風呂の準備をする乾燥した少なくとも3 cmの深さまで中小発泡スチロールの箱（10×10センチ）の氷とドライアイスが完全に覆われるまで、イソペンタンを追加します。
- オプション：液体窒素デュワー小さなコンテナを記入してください。
- 膵臓は、電子顕微鏡（EM）のために必要な場合は、1.25 mLの16％パラホルムアルデヒド、1.25 mLの8％のグルタルアルデヒド、および7.5 mLの0.1M PBSを加えることによってTAABの固定を準備します。 7.5mLの0.1M PBSに2.5 mLの16％パラホルムアルデヒドを添加することによりLowicryl固定を準備します。
- 細胞を単離するために使用される溶液を準備します。以下を追加しながらDMEFの500ミリリットルボトル（グルタミンを含む）に、無菌テクニックを、次のとおりです。
- ウシ胎児血清（FBS）：最終追加50mLの10％。
- ペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌、10,000 U / mLの/ 10,000 ug / mlのストック） - 100 U / mLの/ 100ug/mLの最終濃度をRPMIに5 mLのペン/連鎖球菌株を追加します。また、リンパ節や脾臓のサンプルを保持するために使用するDPBS 500mlのボトルに5ミリリットルを追加します。
2。人員
3。膵臓の解剖
- 十二指腸と脾臓を除去し、鈍と鋭い解剖を使用して、余分な脂肪、血管、神経の膵臓をきれいに
- 紙タオルで覆われた解剖基板上にきれいに膵臓を配置します。膵臓の前面にある青色のインクと普及に綿棒を浸します。過剰をオフにブロット。
- オプション：膵臓の後面に黒インクと普及の新しいアプリケーターを浸します。死体を解剖する人が直面している前面の通常の向きに膵臓を返します。
- 頭、体、尾（ 図1）：3領域に膵臓を切った。 HEAの間の接合部を切断dとボディは、ボディとテールのために〜に等しい部分に残りの部分を分割します。
- 膵臓とレコードの重み（ケース後処理シート（の各領域を量り付録1 ））。
- セクション（〜0.5 cm）の横方向の"パン一斤"の方法（ 図1）で、膵臓の各地域。
- みじん切りにしたサンプルの地域間の両方の接合部からセクションを使用しています。膵臓の大きさに応じて、体尾部の接合領域からのサンプルはパラフィンブロックの数を得ることができる膵臓頭部、ボディ領域からミンチのサンプルまたはサンプルのみを取得するために減少させることができ、その場合に得ることが困難かもしれません。頭や接合部の近位の領域を示すために体によるとしてラベルcryovials。
- の部分をミンチとcryovials（バイアルあたり≥1グラム）との間で均等に分割します。急速に液体窒素やドライアイスでRNAlaterでなく、バイアルを凍結 - イソペンタンスラリーは、tを転送OA -80℃の冷凍庫。
- 平衡を可能にするために、室温で30分間RNAlater中でバイアルを維持し、急速にリミックスして、その後-80℃の冷凍庫に移し、液体窒素やドライアイス·イソペンタンスラリー中のフリーズ。
- パラフィン、パラフィン（ 図1）で始まる10月ブロックの交互のセクションを削除します。
- 右側にあるすべての横断面を傾けます。
- 場所〜カセットで1.5×1.5×0.5 cmのセクションでは、。横断面が大きすぎる場合、半分（ 図2b）にカット。 "A"と "B"として後半に青前半のラベルカセット。
- 作品はまだ大きすぎる場合、以前のカット（ 図2c）にそれぞれ垂直な断面を切った。時計回りの方法でラベルカセットは、AD。カセット内に収まるように、必要に応じてさらに作品をトリミングします。
- 順次地域内の数ブロック、最も内側のセクションから始まる。
- パラフィンブロック、位置cのラベルなどassettesは、その方向を維持し、カセットに左にと場所を組織することです。閉じるカセットの蓋と中性〜500 mlの10％は（NBF）緩衝ホルマリンを使用してコンテナに転送する。最後のカセットを固定で配置されているタイミングの固定を開始します。
- OCTのブロックでは、標識し金型内に10月のメディアの薄層を注ぐその後、方向を維持し、10月に組織をカバーしている金型の組織を置く。 〜1分のイソペンタンスラリー - 急速にドライアイス中で10月の金型を浸漬。一時的な記憶のためにドライアイス上または-80でスラリーとの場所から削除する長期保存のための°Cの冷凍庫。
- 電子顕微鏡（EM）のヘッド·ボディ接合部から約0.5×0.5 cmのスライスを取得します。 TAABの固定とLowicryl固定の他のスライスで1つのスライスを配置します。少なくとも48時間、および/または無期限にEMのためにさらに処理まで。のために4℃でサンプルと固定の両方のタイプを保存する
4。脾臓、リンパ節Dissectionsと十二指腸粘膜解剖
- 脂肪からの膵臓リンパ節（PLN）を分離し、ノードのカプセルへのすべての結合組織をトリミングします。 DMEFを含む滅菌細胞培養皿の中の場所。隔離された総数に応じて、新鮮な出荷、凍結保存細胞のアイソレーション、パラフィンおよび/または10月のブロック、およびバイアルのアリコートにPLNに分割します。 0.5センチメートルより大きくない部分に大規模なノードをミンチ。
- 小さな（〜0.5 cm）の立方体に非膵臓リンパ節と脾臓をミンチ。出発物質の量に応じて新鮮なサンプル出荷または凍結細胞のアイソレーションのために固定、OCTメディア、またはDMEMに置きます。
- 十二指腸を開き、ゆっくりと湿らせたガーゼパッドで粘膜の十二指腸粘膜をきれいに拭いてください。ととRNAlaterでなく、パラフィンおよび/またはバイアルの凍結のOCTブロックとみじん切りにしたサンプルの粘膜の部分をカットします。他のサンプルと同様にフリーズします。
5。事前に標識されたアルミ箔と場所10月·ブロック内のラップOCTのブロックと -80℃で長期保存のためのボックス内のバイアル℃の
6。パラフィン処理のための固定のサンプルを提出
- 自動パラフィンプロセッサを使用するか、または手動でタイミングを使用して16時間（範囲20±4時間）のために組織を固定します。自動プロセッサ（を使用してパラフィンブロックを処理する付録2 ）。
- 左側にカセットラベルが付いた死体を解剖する人によって置かとして正確な向きでセクションを埋め込むことができます。粘膜下に粘膜に垂直の検査を可能にするために切断面と十二指腸粘膜下に埋め込むことができます。
7。解剖エリアを清掃し、消毒する。解剖器具を洗浄、再滅菌する。生物廃棄物として貯蔵するためのホルマリン固定で残りのヒト組織を配置します。 1ヶ月以内に地域の規則に従って医学廃棄物を廃棄します。
8。サンプルの在庫システムを更新
ve_title "> 9。代表的な結果この手順では、2時間以内という3つの主要な地域、頭部、体尾部の境界を含む臓器全体の代表的なサンプリングで、無傷のヒト膵臓を処理します。後部頭部に見られる鉤状領域は、頭部郭清に含まれています。糖尿病のない臓器提供者の中央値は膵臓重量が82.4グラム（ - 139.0グラム52.7）であった。膵臓地域の重みは（ 図3）とほぼ同じであった。
また、この手順では、シーケンシャルパラフィンとOCTブロックから染色されたスライドを使用して全体の膵臓の再建を可能にすることができる。複数のフォーマットは、現在および将来の技術の最大活用を可能にする実現可能である。現在nPODケースワークシートは、（提供されている付録1回収試料とその後のprocを文書化するために使用されている）アリコートの種類と量によってディエッシング。
図1。手順の全体的なスキーム。解剖学的方位を維持しながら、全体の膵臓が処理されます。頭部には、鉤状領域を含む後方地域で腹膵臓葉の存在のために優れた劣性軸に長くなっています。接合部の斜線エリアはcryovialsでひき肉のサンプルに使用される領域を示す。 P、パラフィン、O、10月
図2。膵臓セクションのレタリング方式を採用しています。横膵臓スライスがさらに半分または四半期に分割され、時計回りの方法で、文字のことができます。
図3。糖尿病の臓器ドナーから膵臓の重み。大人のドナー（> 17歳）からの無傷の膵臓が得られる地域や地域の重みに分けた後秤量した。データは平均±SEM（N = 15）です。
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Discussion
この手順の目的は、複数のコレクションのサイト間で調和することができます標準の膵臓の処理を定義するため、異なったグループによって得られた結果の比較を可能にすることです。解剖法は、域内の分割に続く主要な膵臓領域の注釈の追加の手順と標準的な外科病理プラクティスに基づいています。生物検体処理方法の標準化などの国立がん研究所6として国家のバイオバンクの組織からの生物検体収集のためのベストプラクティスの公表に代表される高品質のサンプルの収集を容易にするために必要となります。糖尿病および適切な制御集団の様々な段階を代表するドナーからのヒト膵臓試料のバイオバンクは7-9を報告されています。しかし、膵頭部領域から収集されたこれらのサンプルの正確な詳細が欠けている。 wiをよく知られているかなりの間、個々の膵島異種アップ膵島のサイズ分布の5倍の変化に目の固有の不均一10を分析するときに、膵臓領域と注釈が必要とされるようにします。標準化されたフォーマットで膵臓のサンプルを処理するように、他の基本的なキーの疾患の要因がよりよい解決することができ、個々の患者の要因を解決を支援します。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、ドナーの家族や専門家の支援のため、本研究とマリア·マルティーノとイリーナKusmartsevaに関与する臓器調達機関に感謝します。この作品は、糖尿病患者の膵臓の臓器提供者のネットワークをサポートする青少年糖尿病研究財団（MC-T.、MA）によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura Finetek | ||
| Sakura VIP300 | Sakura Finetek | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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