Summary
Deze video toont een dissectie procedure voor de verwerking van de menselijke pancreas in meerdere opslagformaten. Anatomische oriëntatie wordt gedurende de gehele pancreas regio's definitie van regionale eilandje samenstelling en dichtheid mogelijk te maken.
Abstract
Deze dissectie en bemonsteringsprocedure is ontwikkeld voor het netwerk voor Pancreatic Organ Donors met diabetes (nPOD) programma om de voorbereiding van de alvleesklier hersteld van postmortale orgaandonoren te standaardiseren. De alvleesklier is verdeeld in 3 grote regio's (hoofd, lichaam, staart), gevolgd door seriële dwarsprofielen in de mediale naar laterale as. Afwisselend secties worden gebruikt voor vaste paraffine en vers bevroren blokken en resterende monsters worden versneden voor snap bevroren monster preparaten, met of zonder RNAse inhibitoren DNA, RNA of eiwit isolatie. Het algemene doel van de alvleesklier dissectie procedure is om de hele alvleesklier te proeven met behoud van anatomische oriëntatie.
Endocriene cellen heterogeniteit op het vlak van eilandje samenstelling, grootte, en getallen wordt gerapporteerd voor de menselijke eilandjes ten opzichte van knaagdieren eilandjes 1. De meerderheid van de menselijke eilandjes uit de alvleesklier hoofd, lichaam en staart regio's bestaat uit insuline-containing β-cellen gevolgd door lagere aantal glucagon bevattende α-cellen en somatostatine bevattende δ-cellen. Alvleesklier polypeptide bevattende PP cellen en ghreline-bevattende epsilon-cellen zijn ook aanwezig, maar in kleine aantallen. In tegenstelling, de uncinate gebied bevat eilandjes die hoofdzakelijk bestaan uit pancreas polypeptide bevatten PP cellen 2. Deze regionale eilandje verschillen komen voort uit verschillen in ontwikkeling. De alvleesklier ontwikkelt zich uit de ventrale en dorsale alvleesklier knoppen in de voordarm en na rotatie van de maag en de twaalfvingerige darm, de ventrale lob beweegt en zekeringen met de dorsale 3. De ventrale lob vormt het achterste deel van de kop met de uncinate proces terwijl de dorsale nok geeft aanleiding tot de rest van het orgel. Regionale pancreas variatie wordt ook gemeld met de staart gebied met hogere dichtheid eilandje in vergelijking met andere regio's en de dorsale lob-afgeleide componenten die een selectief atrofie bij type 1 diabetes Extra organen en weefsels worden vaak hersteld van de orgaandonoren en zijn lymfklieren, milt en niet-lymfklieren. Deze monsters worden teruggewonnen met soortgelijke formaten de pancreas met de toevoeging van isolatie van cryogeconserveerde cellen. Wanneer de proximale twaalfvingerige darm wordt meegeleverd met de alvleesklier, de twaalfvingerige darm slijmvlies kan worden verzameld voor paraffine en bevroren blokken en gehakt snap bevroren bereidingen.
Protocol
1. Set-up
- Label cassettes voor paraffine blokken handmatig met een potlood, of automatisch met een cassette printer. Neem de donor identifier (CaseID), monster type, aliquot-nummer, en eventuele aanvullende unieke identificatie (zaak werkblad, bijlage 1 ).
- Label oktober mallen als voor cassettes met een permanent marker. Knip 5-10 cm rechthoeken van aluminium folie.
- Print of handmatig label met permanente marker alle flacons en tubes. Neem genoeg flesjes voor gehakt snap bevroren monsters en buizen met RPMI media voor verse zendingen. Voor de snap bevroren flesjes met RNAlater, voeg 1 ml RNAlater aan elke cryovial.
- Set-up dissectie borden in bioveiligheid kap en aanrechtbladen met gesteriliseerde dissectie instrumenten (tangen, scalpels, messen, gaasjes (4x4)) en cassettes en LGO-schimmels gerangschikt in volgorde van gebruik.
- Maak een bevriezing bad door de invoeringdroogijs een middelgrote Styrofoam vak (10x10 cm) tot een diepte van ten minste 3 cm en voeg isopentaan tot droog ijs volledig bedekt.
- Optioneel: Vul een klein Dewar vat met vloeibare stikstof.
- Als pancreas nodig voor elektronenmicroscopie (EM) bereiden TAAB fixeermiddel door toevoeging 1,25 ml 16% paraformaldehyde, 1,25 ml 8% glutaraldehyde, en 7,5 ml 0,1 M PBS. Bereid Lowicryl fixeermiddel door toevoeging van 2,5 ml 16% paraformaldehyde 7,5 ml 0,1 M PBS.
- Bereid oplossingen gebruikt voor het isoleren cellen. Om 500 ml fles DMEF (met glutamine), volg aseptische technieken, terwijl het volgende toegevoegd:
- Foetale bovine serum (FBS): voeg 50 ml, laatste 10%.
- Penicilline / streptomycine (Pen / Strep, 10.000 E / ml / 10.000 ug / ml voorraad) - voeg 5 ml Pen / Strep voorraad RPMI voor de uiteindelijke concentratie van 100 U / ml / 100ug/mL. Voeg ook 5 ml van een 500 ml fles DPBS bij gebruik voor het houden van lymfeklieren en milt monsters.
2. Personeel
3. Pancreas Dissection
- Verwijder de twaalfvingerige darm en de milt en reinig de alvleesklier van vreemde vet, vaten en zenuwen met behulp van stompe en scherpe dissectie
- Leg de schoongemaakte alvleesklier op de snijtafel bord bedekt met keukenpapier. Doop een wattenstaafje in blauwe inkt en de verspreiding op de voorste oppervlak van de alvleesklier. Dep het overtollige.
- Optioneel: Dompel een nieuwe applicator in zwarte inkt en de verspreiding op de achterste oppervlak van de alvleesklier. Keer terug naar de normale pancreas oriëntatie met anterior oppervlak naar prosector.
- Snijd de alvleesklier in 3 regio's: hoofd, lichaam en staart (figuur 1). Snijd de kruising tussen head en lichaam dan verdeel het resterende deel naar ~ gelijke porties voor lichaam en staart.
- Weeg elke regio van de alvleesklier en opnemen gewichten (Zaak workup blad ( bijlage 1 )).
- Sectie (~ 0,5 cm) elke regio van de alvleesklier in een dwarse "brood brood" manier (figuur 1).
- Gebruik de secties van beide verbindingen tussen de regio's voor gehakt monsters. Afhankelijk pancreas grootte kan een monster van het lichaam-tail grensgebied moeilijk te verkrijgen waarbij het aantal paraffineblokken worden verlaagd tot gehakt monsters of slechts monsters van de alvleesklier kop lichaamsdeel verkrijgen kan worden verkregen. Label cryovials volgens het hoofd of lichaam te proximale regio aan te duiden op de kruising.
- Mince stukken en verdeel gelijkmatig tussen cryovials (≥ 1 gram per flacon). Snel invriezen flesjes zonder RNALater in vloeibare stikstof of in het droog ijs - isopentaan slurry vervolgens over to -80 ° C vriezer.
- Houd flacons RNALater bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot een evenwichtstoestand, remix en snel invriezen in vloeibare stikstof of in het droog ijs-isopentaan brij naar een -80 ° C diepvriezer.
- Verwijder afwisselende secties voor paraffine en de LGO blokken beginnen met paraffine (figuur 1).
- Lean alle dwarsdoorsneden naar rechts.
- Plaats ~ 1,5 x 1,5 x 0,5 cm secties in de cassettes. Indien de dwarsprofielen te groot, gehalveerd (figuur 2b). Label cassettes voor blauw voorste helft als "A" en achterste helft als "B".
- Als stukken nog te groot, elk gesneden loodrecht op de vorige snede (figuur 2c). Label cassettes AD met de klok mee. Knip stukken verder als nodig is om te passen binnen de cassettes.
- Aantal blokken achter elkaar binnen regio, te beginnen met de meest mediale sectie.
- Voor de paraffine blokken, stand cassettes zodat de label zich links en plaats weefsel in de cassette, handhaving van de oriëntatie. Sluiten bandhouder en overbrengen in een vat met ~ 500 ml 10% neutraal gebufferde formaline (NBF). Start timing fixatie wanneer de laatste cassette wordt geplaatst in fixeermiddel.
- Voor OCT blokken, een dunne laag van oktober media giet het in de prelabeled vorm dan lag het weefsel in de mal en zorg ervoor dat de oriëntatie te behouden en weefsel te bedekken met oktober Snel onder te dompelen de LGO mallen in een droog ijs - isopentaan drijfmest voor ~ 1 minuut. Verwijderen uit drijfmest en plaats op droog ijs voor tijdelijke opslag of in de -80 ° C vriezer voor langdurige opslag.
- Verkrijgen ~ 0,5 x 0,5 cm segmenten van het hoofd-lichaam knooppunt elektronenmicroscopie (EM). Plaats een sneetje in de TAAB fixatief en de andere plak in de Lowicryl fixeermiddel. Bewaren beide fixeermiddel met monsters bij 4 ° C gedurende ten minste 48 uur en / of onbepaalde tot verdere verwerking voor EM.
4. Spleen, lymfkliertest Dissecgen en duodenale slijmvlies Dissecties
- Isoleer de lymfklieren (PLN) van vet en te trimmen alle bindweefsel naar het knooppunt capsule. Plaats in steriele celkweek schotel met DMEF. Afhankelijk van de geïsoleerd totale aantallen, verdelen PLN in porties voor verse zendingen, gecryopreserveerd cel isolaties, paraffine en / of de LGO blokken, en flacons. Mince grote knooppunten in stukken niet groter dan 0,5 cm.
- Mince niet-lymfklieren en de milt in kleine (~ 0,5 cm) blokjes. Plaats in fixatief, OCT media, en of DMEM voor verse monster zendingen of gecryopreserveerde cel isolatie op basis van hoeveelheden van de grondstoffen.
- Open de twaalfvingerige darm en veeg de twaalfvingerige darm slijmvlies van de huid schoon met een vochtig gaasje. Snijd gedeelten van het slijmvlies van paraffine en / of bevroren oktober blokken en gehakt monsters voor flacons, met en zonder RNAlater. Freeze als voor andere monsters.
5. Wrap oktober blokken in de pre-gelabeld aluminiumfolie en plaats oktober blokken en flacons in dozen voor langdurige opslag bij -80 ° C.
6. Stuur Vaste Monsters voor Paraffine Processing
- Bevestig weefsels voor 16 uur (tussen 20 ± 4 uur) met behulp van een automatische paraffine-processor of met behulp van handmatige timing. Proces om paraffine blokken met behulp van een automatische processor ( bijlage 2 ).
- Insluiten delen in de juiste oriëntatie zoals die door de prosector de cassette label links. Plaats de duodenale mucosa met het snijvlak naar beneden tot het onderzoek van het slijmvlies loodrecht staat te stellen de submucosa.
7. Reinig dissectie gebieden en ontsmet. Was dissectie-instrumenten en opnieuw steriliseren. Plaats overblijfsel menselijk weefsel in formaline fixeermiddel voor opslag als biomedisch afval. Gooi biomedisch afval volgens de plaatselijke regels binnen een maand.
8. Werk de Sample Inventory System
ve_title "> 9. representatieve resultatenDeze procedure zal het verwerken van een intact humaan alvleesklier met een representatieve steekproef in het orgaan waaronder afbakening van de drie grote regio's, namelijk, hoofd, lichaam en staart binnen 2 uur. De uncinate regio, te vinden in het achterste kop regio, is opgenomen in het hoofd dissectie. De mediaan van de pancreas gewicht in orgaandonoren zonder diabetes was 82,4 gram (52,7 tot 139,0 gram). Pancreas regionale gewichten waren ongeveer gelijk (figuur 3).
Deze procedure kan ook zorgen voor reconstructie van de gehele alvleesklier met behulp van gekleurde dia's van een sequentiële paraffine en LGO-blokken. Meerdere formaten zijn mogelijk waardoor een maximale benutting van de huidige en toekomstige technologieën. De huidige nPOD geval werkblad is voorzien van ( bijlage 1 ) die wordt gebruikt om hersteld monsters en de daarop volgende proc documenterenkingscapaciteit door de hoeveelheid soorten en hoeveelheden.
Figuur 1. Algemene regeling van de procedure. De gehele alvleesklier wordt verwerkt met behoud van anatomische oriëntaties. De kop regio meer in de superieure inferieur as door de aanwezigheid van de ventrale pancreas nok in het posterieure gebied dat uncinate gebied omvat. Gearceerde gebied op de kruispunten geven gebieden voor gehakt monsters cryovials. P, Paraffine, O, oktober
Figuur 2. Belettering regeling voor alvleesklier secties. Transverse alvleesklier plakjes kan verder worden verdeeld in tweeën of in vieren en beletterd met de klok mee.
Figuur 3. Pancreas gewichten van orgaandonoren zonder diabetes. Deintacte pancreas van volwassen donoren (> 17 jaar) werd vervolgens gewogen verdeeld in regio's en regionale gewichten verkregen. De gegevens zijn gemiddelden ± SEM (n = 15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van deze procedure is om een standaard alvleesklier verwerking die kunnen worden geharmoniseerd over meerdere inzamelpunten dus definiëren en vergelijkingen van de resultaten verkregen door verschillende groepen mogelijk te maken. De dissectie methode is gebaseerd op standaard chirurgische pathologie praktijken met extra stappen voor annotatie van de grote pancreas regio's, gevolgd door de intra-regionale onderverdelingen. Standaardisatie van biospecimen verwerkingsmethoden is nodig om collectie van hoge kwaliteit monsters blijkt uit de publicatie van beste praktijken voor biospecimen inzameling bij de nationale biobanken organisaties zoals de National Cancer Institute 6 te vergemakkelijken. De Biobanking van de menselijke pancreas monsters van donoren die de verschillende stadia van diabetes en geschikte controle populaties is gemeld 7-9. Echter, de exacte details voor de monsters van de pancreaskop regio ontbroken. Aanzienlijke inter-individuele eilandje heterogeniteit is bekend wie tot en met 5-voudige variaties in de eilandjes van Langerhans grootte-verdeling, zodat annotatie van de pancreas regio nodig is bij de analyse van inherente heterogeniteit 10. Verwerking pancreas monsters in gestandaardiseerde formaten zullen helpen bij het oplossen van individuele factoren bij de patiënt, zodat andere onderliggende ziekte de belangrijkste factoren beter kan worden opgelost.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs danken de donateurs de familie en de Organ Procurement Organisaties die betrokken zijn bij dit onderzoek en Maria Martino en Irina Kusmartseva voor hun deskundige hulp. Dit werk werd gefinancierd door de Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) ter ondersteuning van het netwerk voor Pancreatic Organ Donors met diabetes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura Finetek | ||
| Sakura VIP300 | Sakura Finetek | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Brissova, M. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).
- Rahier, J. The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).
- Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).
- Wittingen, J., Frey, C. F. Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas. Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).
- Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. Cellular composition of the human diabetic pancreas. Diabetologia. 24, 366-371 (1983).
- Vaught, J. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).
- Gianani, R. Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).
- Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity. Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).
- In't Veld, P. Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors. Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).
- Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans. Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).
