Summary
इस वीडियो एकाधिक भंडारण स्वरूपों में मानव अग्न्याशय के प्रसंस्करण के लिए एक विच्छेदन प्रक्रिया को दर्शाता है. क्षेत्रीय आइलेट संरचना और घनत्व की परिभाषा की अनुमति संरचनात्मक अभिविन्यास अग्नाशय क्षेत्रों भर में बनाए रखा है.
Protocol
1. सेट अप
- एक पेंसिल के साथ, या स्वतः एक कैसेट प्रिंटर के साथ में तेल ब्लॉक मैन्युअल के लिए लेबल कैसेट. दाता पहचानकर्ता (CaseID), नमूना प्रकार, अशेष भाजक संख्या, और किसी भी अतिरिक्त अद्वितीय पहचान (प्रकरण, कार्यपत्रक शामिल परिशिष्ट 1 ).
- लेबल के रूप में एक स्थायी मार्कर के साथ कैसेट के लिए molds के अक्टूबर. एल्यूमीनियम पन्नी के 5-10 सेमी आयत कट.
- मुद्रित करें या मैन्युअल रूप से स्थायी मार्कर सभी शीशियों और ट्यूबों के साथ लेबल. कीमा बनाया हुआ तस्वीर ताजा लदान के लिए RPMI मीडिया के साथ जमे हुए नमूने और ट्यूबों के लिए पर्याप्त शीशियों शामिल हैं. इस तस्वीर RNAlater साथ जमे हुए शीशियों के लिए, प्रत्येक cryovial के लिए 1 एमएल RNAlater के जोड़ें.
- सेट जैव सुरक्षा हुड और काउंटर में सबसे ऊपर में निष्फल विच्छेदन (संदंश, नलियां, ब्लेड, धुंध पैड (4x4)) उपकरणों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैसेट और अक्टूबर molds के साथ विच्छेदन बोर्डों उपयोग के क्रम में व्यवस्थित हैं.
- डाल द्वारा एक ठंड स्नान की तैयारीएक मध्यम आकार के स्टायरोफोम बॉक्स (10x10 सेमी) कम से कम 3 सेमी की गहराई में शुष्क बर्फ और isopentane जोड़ने जब तक सूखी बर्फ पूरी तरह से कवर किया जाता है.
- वैकल्पिक: तरल नाइट्रोजन के साथ एक छोटे देवर कंटेनर भरें.
- अगर अग्न्याशय इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के लिए की जरूरत है, 1.25 एमएल 16% paraformaldehyde, 1.25 एमएल glutaraldehyde 8%, और 7.5 एमएल 0.1M पीबीएस जोड़कर तैयार TAAB लगानेवाला. 7.5 एमएल 0.1M पीबीएस के लिए 2.5 एमएल 16% paraformaldehyde जोड़कर तैयार Lowicryl लगानेवाला.
- कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया समाधान को तैयार है. DMEF की 500 मिलीलीटर की बोतल के (glutamine साथ), सड़न रोकनेवाला तकनीक का पालन करते हुए निम्नलिखित जोड़ने:
- भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम: जोड़ने 50ml, अंतिम 10%.
- / पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / Strep, 10,000 यू / एमएल 10,000 / स्नातकीय / एमएल स्टॉक) - 100 यू / एमएल / 100ug/mL के अंतिम एकाग्रता के लिए RPMI 5 एमएल / पेन Strep स्टॉक जोड़ने. इसके अलावा एक 500 मिलीलीटर की बोतल DPBS जब लिम्फ नोड्स या तिल्ली के नमूने के लिए इस्तेमाल करने के लिए 5 मिलीग्राम जोड़ें.
2. कार्मिक
3. अग्न्याशय विच्छेदन
- ग्रहणी और तिल्ली निकालें और बाहरी वसा, जहाजों, और तंत्रिकाओं के अग्न्याशय कुंद और तेज विच्छेदन का उपयोग साफ
- एक विदारक कागज तौलिये के साथ कवर बोर्ड पर साफ अग्न्याशय रखें. अग्न्याशय के पूर्वकाल सतह पर नीली स्याही और प्रसार में एक कपास इत्तला दे दी applicator के डुबकी. बंद अतिरिक्त दाग.
- वैकल्पिक: अग्न्याशय के पीछे सतह पर काली स्याही और प्रसार में एक नया applicator के डुबकी. (शरीर - रचना पर व्याख्यान देने आदि के लिए) शव की चीरफाड़ करने वाला पूर्वकाल सतह सामना करना पड़ के साथ सामान्य उन्मुखीकरण के लिए अग्न्याशय लौटें.
- सिर, शरीर, और पूंछ (चित्रा 1): 3 क्षेत्रों में अग्न्याशय कटौती. Hea के बीच जंक्शन कटौतीघ और शरीर तो शरीर और पूंछ के लिए बराबर भागों में शेष भाग में विभाजित है.
- अग्न्याशय और रिकॉर्ड वजन (प्रकरण workup पत्रक (प्रत्येक क्षेत्र तौलना परिशिष्ट 1 )).
- धारा (~ 0.5 सेमी) एक अनुप्रस्थ "रोटी का कंद" तरीके से (चित्रा 1) में अग्न्याशय के प्रत्येक क्षेत्र.
- कीमा बनाया हुआ नमूने के लिए क्षेत्रों के बीच दोनों जंक्शनों से वर्गों का उपयोग करें. अग्न्याशय के आकार पर निर्भर करता है, शरीर पूंछ जंक्शन क्षेत्र से एक नमूना प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है जो मामले में तेल ब्लॉकों की संख्या कीमा बनाया हुआ या अग्न्याशय क्षेत्र सिर शरीर से नमूने केवल नमूने प्राप्त करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है कम किया जा सकता है. लेबल cryovials सिर या शरीर जंक्शन में समीपस्थ क्षेत्र निरूपित के रूप में अनुसार.
- टुकड़े क़ीमा और cryovials (≥ शीशी प्रति 1 ग्राम) के बीच समान रूप से विभाजित. तेजी से तरल नाइट्रोजन में या सूखी बर्फ में RNALater के बिना शीशियों स्थिर isopentane घोल तो टी स्थानांतरणoa -80 ° सी फ्रीजर.
- कमरे के तापमान पर RNALater साथ शीशियों 30 मिनट के लिए रखें संतुलन के लिए अनुमति देते हैं, रीमिक्स और तरल नाइट्रोजन में तेजी या फ्रीज सूखा घोल बर्फ - isopentane के में फिर एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर हस्तांतरण.
- तेल और तेल (चित्रा 1) के साथ शुरुआत अक्टूबर ब्लॉक के लिए बारी वर्गों निकालें.
- सभी अनुप्रस्थ वर्गों को सही करने के लिए झुक.
- जगह ~ 1.5 x 1.5 x 0.5 सेमी वर्गों कैसेट में. यदि अनुप्रस्थ वर्गों भी बड़े हैं, आधे (चित्र 2b) में कटौती. "A" और "बी" के रूप में पीछे आधे के रूप में नीले पूर्वकाल आधे के लिए लेबल कैसेट.
- यदि टुकड़े अभी भी बहुत बड़ा है, पिछले कट (चित्रा 2c) के लिए प्रत्येक अनुभाग सीधा कटौती. लेबल कैसेट ई. एक दक्षिणावर्त ढंग में. आगे के रूप में को कैसेट भीतर फिट की जरूरत टुकड़े को छाँटो.
- क्षेत्र के भीतर ब्लॉक क्रमिक रूप से, सबसे मध्यवर्ती अनुभाग के साथ शुरू.
- तेल ब्लॉक, सी स्थिति के लिएलेबल इतना assettes कैसेट में छोड़ दिया और जगह के ऊतकों को है, इसकी उन्मुखीकरण को बनाए रखने. बंद कैसेट ढक्कन और ~ 500 मिलीलीटर 10% तटस्थ के साथ एक कंटेनर के लिए स्थानांतरण formalin बफर (NBF). प्रारंभ समय निर्धारण जब पिछले कैसेट लगानेवाला में रखा गया है.
- अक्टूबर ब्लॉक के लिए, prelabeled मोल्ड में अक्टूबर मीडिया की एक पतली परत डाल तो मोल्ड में ऊतक ओरिएंटेशन को बनाए रखने और अक्टूबर के साथ ऊतक कवर करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा रखना. ~ 1 मिनट के लिए isopentane गारा - तेजी से एक सूखी बर्फ में अक्टूबर molds के विसर्जित कर दिया. अस्थायी भंडारण के लिए सूखी बर्फ पर या -80 में घोल और जगह से निकालें ° दीर्घकालिक भंडारण के लिए फ्रीजर सी.
- इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के लिए सिर से शरीर जंक्शन से ~ 0.5 x 0.5 सेमी स्लाइसें प्राप्त करते हैं. जगह TAAB लगानेवाला और अन्य टुकड़ा Lowicryl स्थिरकारी में में एक टुकड़ा. लगानेवाला के दोनों प्रकार के नमूनों के साथ कम से कम 48 घंटे और / या अनिश्चित काल के EM के लिए आगे की प्रक्रिया तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
4. तिल्ली, लसीका नोड Dissecमाहौल और ग्रहणी mucosa dissections
- अग्नाशय के लिम्फ नोड्स (PLN) वसा से अलग करने और नोड कैप्सूल सभी संयोजी ऊतक ट्रिम. बाँझ सेल संस्कृति DMEF युक्त डिश में रखें. कुल पृथक संख्या पर निर्भर करता है, ताजा लदान, cryopreserved सेल isolations, आयल और / या अक्टूबर ब्लॉक, और शीशियों के लिए aliquots में PLN विभाजित. 0.5 सेमी से भी बड़ा टुकड़ों में बड़े नोड क़ीमा.
- छोटे cubes (~ 0.5 सेमी) में गैर - अग्नाशय के लिम्फ नोड्स और तिल्ली क़ीमा. लगानेवाला, अक्टूबर, मीडिया और या DMEM में ताजा नमूना लदान शुरू सामग्री की मात्रा के अनुसार या cryopreserved सेल isolations के लिए जगह.
- ग्रहणी खोलें और धीरे सिक्त धुंध पैड के साथ श्लेष्म की ग्रहणी के mucosa साफ साफ. आयल और / या जमे हुए अक्टूबर शीशियों के लिए ब्लॉक और कीमा बनाया हुआ नमूने के लिए mucosa के वर्गों के साथ और RNAlater बिना, काटें. अन्य नमूनों के लिए के रूप में रुक.
5. लपेटें पूर्व लेबल एल्यूमीनियम पन्नी और जगह ब्लॉक अक्टूबर और अक्टूबर ब्लॉक लंबी अवधि के भंडारण के लिए बक्से में -80 पर शीशियों डिग्री सेल्सियस
6. आयल प्रोसेसिंग के लिए निश्चित नमूने जमा करें
- फिक्स ऊतकों (सीमा 20 ± 4 घंटे) 16 घंटे के लिए एक स्वचालित तेल प्रोसेसर का उपयोग कर या मैन्युअल समय का उपयोग. तेल ब्लॉक का उपयोग कर एक स्वचालित प्रोसेसर (के लिए प्रक्रिया परिशिष्ट 2 ).
- सटीक अभिविन्यास कैसेट लेबल के साथ छोड़ दिया करने के लिए (शरीर - रचना पर व्याख्यान देने आदि के लिए) शव की चीरफाड़ करने वाला से रखा के रूप में वर्गों एम्बेड. कटौती की सतह के साथ ग्रहणी mucosa को एम्बेड नीचे submucosa के mucosa सीधा की परीक्षा की अनुमति.
7. विच्छेदन क्षेत्रों में स्वच्छ और कीटाणुरहित. विच्छेदन उपकरणों धो और फिर से बाँझ. Formalin लगानेवाला में जैव चिकित्सा अपशिष्ट के रूप में भंडारण के लिए बचे हुए मानव ऊतकों रखें. स्थानीय नियमों के अनुसार एक महीने के भीतर जैव चिकित्सा अपशिष्ट त्यागें.
8. नमूना इन्वेंट्री सिस्टम अद्यतन
ve_title "> 9 प्रतिनिधि परिणाम.यह प्रक्रिया तीन प्रमुख क्षेत्रों, अर्थात्, सिर, शरीर और 2 घंटे के भीतर पूंछ के सीमांकन सहित अंग भर में प्रतिनिधि नमूने के साथ एक अक्षुण्ण मानव अग्न्याशय कार्रवाई करेंगे. हुकदार, घुमावदार या टेढ़ा क्षेत्र, पश्च सिर क्षेत्र में पाया, सिर विच्छेदन में शामिल है. मधुमेह के बिना अंग दाताओं में मंझला अग्नाशय वजन 82.4 ग्राम (139.0 ग्राम 52.7) था. अग्न्याशय क्षेत्रीय वजन लगभग बराबर थे (चित्रा 3).
यह प्रक्रिया भी पूरे - अनुक्रमिक आयल और अक्टूबर ब्लॉक से दाग स्लाइड का उपयोग कर अग्न्याशय के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति दे सकते हैं. एकाधिक प्रारूपों वर्तमान और भविष्य प्रौद्योगिकियों के लिए अधिकतम उपयोग के लिए अनुमति देता है संभव है. वर्तमान nPOD मामले कार्यपत्रक (प्रदान की गई है कि बरामद नमूनों और बाद proc के दस्तावेज़ के लिए प्रयोग किया जाता है परिशिष्ट 1 )अशेष भाजक के प्रकार और मात्रा द्वारा Essing.
आकृति 1. प्रक्रिया के समग्र योजना पूरे अग्न्याशय जबकि संरचनात्मक झुकाव को बनाए रखने की कार्रवाई की है. सिर क्षेत्र बेहतर अवर पीछे क्षेत्र है जिसमें हुकदार, घुमावदार या टेढ़ा क्षेत्र में उदर अग्नाशय पालि की उपस्थिति के कारण अक्ष में रह गया है. जंक्शनों पर रची क्षेत्र कीमा बनाया cryovials में नमूने के लिए इस्तेमाल किया क्षेत्रों में निरूपित. पी, पैराफिन, हे, अक्टूबर.
चित्रा 2. आगे के अग्न्याशय वर्गों के लिए लिखे योजना अनुप्रस्थ अग्न्याशय स्लाइस आधा या तिमाहियों में विभाजित किया जा सकता है और एक दक्षिणावर्त तरीके से लिखित.
चित्रा 3. मधुमेह के बिना अंग दाताओं से अग्न्याशय वजन.वयस्क दाताओं (> 17 साल पुराने) से अक्षुण्ण अग्न्याशय तो क्षेत्रों और क्षेत्रीय भार प्राप्त में विभाजित तौला गया. डेटा साधन हैं ± SEM (एन = 15).
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Discussion
इस प्रक्रिया के लक्ष्य के लिए एक मानक अग्न्याशय प्रसंस्करण है कि कई संग्रह साइटों के पार संगत हो सकता है परिभाषित करने और इस तरह अलग अलग समूहों द्वारा प्राप्त परिणामों की तुलना की अनुमति है. विच्छेदन विधि प्रमुख अंतर क्षेत्रीय उप विभाजनों के बाद अग्न्याशय क्षेत्रों के एनोटेशन के लिए अतिरिक्त कदम के साथ मानक शल्य विकृति प्रथाओं पर आधारित है. Biospecimen प्रसंस्करण विधियों के मानकीकरण के लिए उच्च गुणवत्ता के रूप में राष्ट्रीय कैंसर संस्थान 6 राष्ट्रीय biobanking संगठनों से biospecimen संग्रह के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं के प्रकाशन से उदाहरण के नमूनों का संग्रह की सुविधा के लिए आवश्यक है. मधुमेह और उपयुक्त नियंत्रण आबादी के विभिन्न चरणों का प्रतिनिधित्व दाताओं से मानव अग्न्याशय के नमूनों की biobanking 7-9 सूचित किया गया है. हालांकि, उन अग्नाशय के सिर क्षेत्र से एकत्र नमूने के लिए सटीक जानकारी का अभाव रहा है. काफी अंतर - व्यक्तिगत आइलेट विजातिता प्रसिद्ध वाईआइलेट आकार वितरण में 5 गुना बदलाव वें इतना है कि अग्नाशय के क्षेत्र के एनोटेशन जब अंतर्निहित दस heterogenity का विश्लेषण की जरूरत है. मानकीकृत स्वरूप में अग्नाशय के नमूने प्रसंस्करण व्यक्तिगत रोगी कारकों के समाधान के साथ सहायता इसलिए कि अन्य अंतर्निहित कुंजी रोग कारकों बेहतर हल किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों 'दाताओं के परिवारों और अंग प्रत्यारोपण खरीद में शामिल उनके विशेषज्ञ की सहायता के लिए इस शोध और मारिया मार्टिनो और इरीना Kusmartseva के संगठन धन्यवाद. यह काम अग्नाशय के मधुमेह के साथ अंग दाताओं के लिए नेटवर्क के समर्थन में किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन (MC-T., एमए) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura Finetek | ||
| Sakura VIP300 | Sakura Finetek | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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- Rahier, J. The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).
- Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).
- Wittingen, J., Frey, C. F. Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas. Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).
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- In't Veld, P. Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors. Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).
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