Summary
Bu video çoklu depolama biçimleri içine insan pankreas işlemek için bir diseksiyon yordam gösterir. Anatomik oryantasyon bölgesel adacık bileşimi ve yoğunluğu tanımı izin pankreas bölgeleri boyunca korunur.
Abstract
Bu diseksiyon ve örnekleme prosedürü kadavradan organ bağışında kurtarıldı pankreas hazırlanması standardize etmek Diyabet (nPOD) programı ile Pankreas Organ Bağış için Ağ için geliştirilmiştir. Pankreas yanal eksene medial boyunca seri enine kesitler ardından 3 ana bölgede (baş, gövde, kuyruk) ayrılmıştır. Alternatif bölümleri sabit parafin ve taze dondurulmuş blokları ve kalıntı numuneler için kullanılan DNA, RNA ve protein izolasyon için olan ya da olmayan RNAse inhibitörleri ya ek dondurulmuş Örnek preparatlar için kıyılmış edilir. Pankreas Diseksiyon işlemin genel amacı anatomik yönelimi korurken tamamını pankreas örneklemek etmektir.
Adacık bileşimi, büyüklüğü ve sayısı açısından Endokrin hücre heterojenitesini kemirgen adacıklar 1'e göre, insan adacıkları bildirilmektedir. Pankreas başı insan adacık çoğunluğu, vücut ve kuyruk bölgelerinde insülin containin oluşurg β-hücrelerinin düşük oranlarda takiben glukagon içeren α-hücreleri ve δ-hücreleri somatostatin-içeren. Pankreatik polipeptid içeren PP hücreleri ve ghrelin içeren epsilon hücreleri de mevcut fakat az sayıda bulunmaktadır. Bunun aksine, unsinat bölgesi esas pankreatik polipeptid içeren bir PP hücreleri 2 oluşan adacıklar içerir. Bu bölgesel farklılıklar adacık gelişimsel farklılıkları ortaya çıkar. Pankreas foregut ve mide ve onikiparmak bağırsağı, dorsal 3 ile ventral lobun hamle sigortalar ve dönüşten sonra ventral ve dorsal pankreas tomurcukları gelişir. Ventral lob dorsal lob organ kalanı yol açmaktadır ederken unsinat işlemi de dahil olmak üzere başının arka kısmını teşkil eder. Bölgesel farklar da pankreas kuyruk bölgesi, tip 1 diyabette selektif atrofi geçiren diğer bölge ve dorsal lob kaynaklı bileşenlerine kıyasla daha yüksek adacık yoğunluğuna sahip olan bildirilmektedir Ek organ ve dokular genellikle organ bağışında kurtarıldı ve pankreatik lenf bezleri, dalak ve non-pankreatik lenf düğümleri içerir. Bu numuneler Kriyoprezerve hücrelerinin izolasyon ilavesi ile pankreas için de benzer biçimleri ile geri kazanılmaktadır. Proksimal duodenum, pankreas dahil edildiğinde, duodenal mukoza parafin ve dondurulmuş bloklar ve kıyılmış ek donmuş hazırlıkları için toplanmış olabilir.
Protocol
1. Set-up
- Bir kalemle veya otomatik bir kaset yazıcı ile el parafin blokları için etiket kasetleri. Donör tanımlayıcı (CaseID), numune tipi, tablet sayısı ve herhangi bir ek benzersiz bir kimlik (Olgu çalışma, Include Ek 1 ).
- Kalıcı bir kalem ile kaset olarak Etiket Ekim kalıplar. Alüminyum folyo 5-10 cm dikdörtgenler kesin.
- Kalıcı bir kalem bütün şişeler ve tüpler ile etiket yazdırmak veya manuel. Taze gönderiler için RPMI medya ile kıyılmış ek donmuş numuneler ve tüpler için yeterli şişeleri ekleyin. RNAlater ile ek dondurulmuş şişeleri için, her cryovial 1 ml RNAlater ekleyin.
- Sterilize diseksiyon aletleri (forseps, neşter, bıçaklar, gazlı bez (4x4)) yanı sıra kaset ve OCT kalıpları ile biyogüvenlik kaput ve tezgahlar Set-up diseksiyon panoları kullanım sırasına göre düzenlenmiş.
- Koyarak dondurucu bir banyo hazırlayınKuru en az 3 cm derinliğe kadar orta büyüklükte bir strafor kutu (10x10 cm) buz ve kuru buz tamamen kaplıdır kadar izopentan ekleyin.
- İsteğe Bağlı: sıvı nitrojen ile küçük bir Dewar doldurun.
- Pankreas elektron mikroskobu (EM) için gerekli ise, 1.25 mL% 16 paraformaldehit, 1.25 mL% 8 glutaraldehit ve 7.5 mL 0.1M PBS ekleyerek TAAB fiksatif hazırlamak. 7.5 mL 0.1M PBS 2.5 mL% 16 paraformaldehit ekleyerek Lowicryl fiksatif hazırlayın.
- Hücreler izole etmek için kullanılan çözümler hazırlayın. Aşağıdaki eklerken DMEF 500 ml şişe (glutamin ile), aseptik teknikler aşağıda:
- Fetal sığır serumu (FBS): add 50mL, son 10%.
- Penisilin / Streptomisin (Kalem / Strep, 10.000 U / mL / 10,000 ug / mL stok) - 100 U / mL / 100ug/mL son konsantrasyon için RPMI 5 ml Kalem / Strep stok ekleyin. Ayrıca, lenf düğümleri ve dalak örnekleri tutmak için kullanılan DPBS bir 500 ml'lik şişe için 5 ml ilave edilir.
2. Personel
3. Pankreas Diseksiyon
- Duodenum ve dalak çıkarın ve künt ve keskin diseksiyon kullanılarak gereksiz yağ, damar ve sinirlerin pankreas temizlemek
- Kağıt havlu ile örtülü bir diseksiyon gemide temizlenmiş pankreas yerleştirin. Pankreasın ön yüzünde mavi mürekkep ve yayılmasında bir pamuk uçlu aplikatör batırın. Fazla gelen lekeyi silin.
- İsteğe Bağlı: Pankreasın arka yüzeyinde siyah mürekkep ve yayılmasında yeni bir aplikatör batırın. Ön yüzey prosector bakan normal yönlendirmeye pankreas dönün.
- Baş, gövde ve kuyruk (Şekil 1): 3 bölgeye pankreas kesin. Hea arasındaki bağlantı kesind ve sonra vücut, vücut ve kuyruk için ~ eşit kısma kalan kısmını bölün.
- Pankreas ve kayıt ağırlıkları (Olgu workup sayfası (her bölge tartılır Ek-1 )).
- Bölüm (~ 0.5 cm) enine bir "Ekmek" bir şekilde (Şekil 1) pankreas her bölge.
- Kıyma örnekleri için bölgeler arasında kavşak gelen bölümleri kullanın. Pankreas boyutuna bağlı olarak, vücudun-kuyruk bileşke bölgesinden bir numune parafin blok sayısı elde edilebilir pankreas kafası-vücut bölgesinden kıyılmış numune ya da yalnızca örnek elde etmek için düşük olabilir ve bu durumda elde etmek zor olabilir. Baş veya kavşakta proksimal bölge belirtmek için vücut olarak göre Etiket cryovials.
- Adet kıyma ve cryovials (flakon başına ≥ 1 gram) arasında eşit olarak bölün. Hızla sıvı azot veya kuru buz RNALater olmadan şişeleri dondurmak - izopentan bulamaç ardından t aktarmakoa -80 ° C derin dondurucuda.
- Dengelenmesi için izin vermek için 30 dakika için oda sıcaklığında RNALater ile şişe tutmak, hızla remix ve daha sonra bir derin dondurucu -80 ° C transfer sıvı azot içinde ya da kuru buz-izopentan bulamaç içinde donma.
- Parafin ve parafin (Şekil 1) ile başlayan Ekim blokları için alternatif bölümleri kaldırın.
- Sağa doğru enine bölüm eğimlidir.
- Yeri ~ 1.5 x 1.5 kasetlere x 0.5 cm bölümleri. Enine kesitler çok büyükse, yarım (Şekil 2b) kesti. "B" "A" ve posterior yarısı gibi mavi anterior yarısı için etiket kasetleri.
- Parçaları hala çok büyükse, önceki kesme (Şekil 2c) için her bölüm dik olarak kesilmiş. Saat yönünde bir şekilde etiket kasetleri AD. Daha kaseti sığdırmak için gerekli parçaları kesin.
- En medyal bölümü ile başlayarak bölge içinde sırayla numarası bloklar,.
- Parafin bloklar, pozisyon cböylece etiketli assettes yönünü koruyarak, kaset içine sol ve yerinde doku etmektir. Kapat kaset kapağı ve ~ 500 ml% 10'luk nötral bir konteyner aktarma (NBF) tamponlu formalin. Son kaset sabitleştirici yerleştirilir zamanlama fiksasyon başlayın.
- Ekim blokları için prelabeled kalıp içine Ekim medyanın ince bir tabaka dökün yönlendirme sonra korumak ve OCT ile doku karşılandığından emin olmak kalıp doku yatıyordu. ~ 1 dakika izopentan bulamaç - Hızla bir kuru buz kalıpları Ekim batırmayın. Geçici depolama için kuru buz veya -80 olarak çamur ve yerden kaldırma, uzun süreli depolama için ° C derin dondurucuda.
- Elektron mikroskobu (EM) için baş-beden ayrımından ~ 0.5 x 0.5 cm dilimleri alın. TAAB sabitleştirici ve Lowicryl sabitleştirici diğer dilim koyun bir dilim. En az 48 saat ve / veya belirsiz bir süre için EM işlenmek. Için 4 ° C'de numunelerin ile sabitleştirici Her iki tip depolamak
4. Dalak, lenf nodu diseksiyonuASIZ ve Duodenum Mukoza Diseksiyonlarında
- Yağdan pankreatik lenf düğümleri (PLN) yalıtmak ve düğüm kapsül tüm bağ dokusu kırpın. DMEF içeren steril hücre kültür kaplarına koyun. Izole edilen toplam sayı bağlı olarak, taze gönderiler, soğukta saklanan hücre izolasyonları, parafin ve / veya Ekim blokları ve flakon için kısma PLN bölün. 0.5 cm'den daha büyük parçalar halinde büyük düğümleri kıyma.
- Küçük (~ 0.5 cm) küpler halinde olmayan pankreatik lenf bezleri ve dalak kıyma. Başlangıç maddelerinin miktarlarına göre taze örnek gönderiler veya dondurulmuş hücre izolasyonları için fiksatörü, Ekim medya ve ya DMEM yerleştirin.
- Duodenum açın ve hafifçe ıslatılmış gazlı bezle mukus duodenal mukoza silin. Ve RNAlater olmadan, parafin ve / veya flakon için dondurulmuş Ekim blokları ve kıyma örnekleri için mukozasının bölümleri kesin. Diğer örnekleri gibi dondurun.
5.. Önceden etiketli alüminyum folyo ve yeri Ekim blokları ve içine al Ekim bloklar -80 uzun süreli saklama için kutuları şişeleri ° C
6. Parafin İşleme Sabit Örnekleri gönderin
- Otomatik bir parafin işlemci kullanarak ya da manuel zamanlama kullanarak 16 saat boyunca dokular (aralığı 20 ± 4 saat) sabitleyin. Otomatik bir işlemci (parafin bloklara işlemek Ek 2 ).
- Sol kaset etiketi ile prosector tarafından yerleştirilmiş olarak kesin yönde bölümleri Embed. Submukozaya mukoza dik muayene izin kesim yüzeyi ile duodenal mukoza aşağı Embed.
7. Diseksiyon alanları temizleyin ve dezenfekte edin. Diseksiyon aletleri yıkayın ve tekrar sterilize. Biyomedikal atık depolama için formalin fiksatif içinde kalan insan dokularında yerleştirin. Bir ay içinde yerel yönetmeliklere göre biyomedikal atık atın.
8. Örnek Envanter Sistemi Güncelleme
ve_title "> 9. Temsilcisi SonuçlarBu işlem üç büyük yani bölgeler, baş, gövde ve 2 saat içinde kuyruk çizimi de dahil olmak organın her temsili örnekleme bozulmamış bir insan pankreas işleyecek. Posterior kafa bölgesinde bulunan unsinat bölgesi, kafa Diseksiyon dahildir. Diyabeti olmayan organ bağışında bulunan ortalama pankreas ağırlığı 82.4 gram (- 139.0 gram 52.7) idi. Pankreas bölgesel incelme (Şekil 3) yaklaşık eşit düzeydeydi.
Bu işlem aynı zamanda sıralı parafin ve OCT bloklardan lekeli slaytlar kullanarak tüm pankreas rekonstrüksiyonu için izin verebilirsiniz. Çoklu biçimleri mevcut ve gelecek teknolojiler için maksimum kullanımı için izin mümkün bulunmaktadır. Mevcut nPOD durumda çalışma (sağlanmaktadır Ek 1 kurtarıldı örnekleri ve sonraki proc belgelemek için kullanılan)tablet türleri ve miktarları ile Essing.
Şekil 1.. Anatomik yönelimleri korurken prosedür genel şeması. Tamamı pankreas işlenir. Kafa bölgesinde unsinat bölgesi içerir arka bölgede ventral pankreas lobun varlığı nedeniyle, üstün-inferior eksen daha uzundur. Kavşaklarda çizili alana cryovials içinde kıyılmış numuneler için kullanılan bölgeleri ifade eder. P, Parafin, O, Ekim
Şekil 2. Pankreas bölümler için Yazı düzeni. Enine pankreas dilim fazla iki ya da dört ayrılır ve saat yönünde bir şekilde harfli edilebilir.
Şekil 3. Diyabeti olmayan organ bağışında gelen Pankreas ağırlıkları.yetişkin bağışçılar (> 17 yaş) intakt pankreas edilen bölgeler ve bölgesel incelme ayrılmıştır sonra tartıldı. Veriler ortalama ± SEM (N = 15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu prosedürün amacı birden toplama siteler arasında uyumlu olabilir standart bir pankreas işleme tanımlamak ve böylece farklı gruplar tarafından elde edilen sonuçları karşılaştırabilme sağlamaktır. Diseksiyon yöntemi bölge-içi alt bölümleri tarafından takip başlıca pankreas bölgelerin açıklama için ek adımlar ile standart cerrahi patoloji uygulamalarına dayanmaktadır. Biospecimen işleme yöntemlerinin standartlaştırılması, Ulusal Kanser Enstitüsü 6 ulusal biobanking kuruluşlardan biospecimen koleksiyon için en iyi uygulamaların yayınlanması örneklediği kaliteli örneklerin toplanmasını kolaylaştırmak için gereklidir. Diyabet ve uygun kontrolü popülasyonlarının aşamalarını gösteren donörlerden insan pankreas örneklerinin biobanking 7-9 rapor edilmiştir. Ancak, pankreas başına uyan bölgede alınan örneklerle için kesin bilgi eksikliği edilmiştir. Arasındaki önemli bireysel adacık heterojenite bilinen wi olduğunukadar adacık boyut dağılımı 5 kat farklılıklar inci doğasında heterojenitesini 10 analiz ederken pankreas bölgenin bu açıklama gerekli yani. Standart formatlarda pankreas örnekleri İşleme böylece altta yatan başka önemli hastalık etmenlerinin iyi çözülebilir bireysel hasta faktörleri çözümünde yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar, donörlerin aileleri ve uzman yardımı için bu araştırma ve Maria Martino ve Irina Kusmartseva yer Organ İhale Organizasyonlar teşekkür ederim. Bu çalışma Diyabet ile Pankreas Organ Bağış için Ağ destek Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (MC-T., MA) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura Finetek | ||
| Sakura VIP300 | Sakura Finetek | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Brissova, M. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).
- Rahier, J. The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).
- Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).
- Wittingen, J., Frey, C. F. Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas. Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).
- Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. Cellular composition of the human diabetic pancreas. Diabetologia. 24, 366-371 (1983).
- Vaught, J. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).
- Gianani, R. Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).
- Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity. Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).
- In't Veld, P. Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors. Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).
- Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans. Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).
