Summary
Qui, dettaglio una metodologia per l'isolamento rapido delle cellule dendritiche di topo intestinali (DCS) e macrofagi. Caratterizzazione fenotipica di DC intestinali e macrofagi viene eseguita utilizzando multi-color analisi citometrica mentre magnetica arricchimento tallone seguita dalla selezione cellulare viene utilizzato per produrre le popolazioni di elevata purezza per gli studi funzionali.
Abstract
All'interno l'intestino risiedono popolazioni uniche di cellule immunitarie innate e adattiva che sono coinvolti nella promozione della tolleranza verso la flora commensale e gli antigeni alimentari, mentre in concomitanza rimanendo in bilico per montare le risposte infiammatorie verso invasive 1,2 patogeni. Cellule presentanti l'antigene, in particolare DCS e macrofagi, giocano un ruolo critico nel mantenimento della omeostasi immunitaria intestinale attraverso la loro capacità di percepire e rispondere adeguatamente al microbiota 3-14. Isolamento efficiente di DC intestinali e macrofagi è un passo fondamentale nel caratterizzare il fenotipo e la funzione di queste cellule. Mentre molti metodi efficaci per isolare cellule immunitarie intestinali, compresi DC e macrofagi, sono stati descritti 6,10,15-24, contare su lunghe molte volte digestioni che possono influenzare negativamente l'espressione sulla superficie cellulare antigene, la vitalità cellulare, e / o quantità di cellule. Qui, si dettaglio una metodologia per l'isolamento rapido di un gran numero di viablelettronici, DCS intestinali e macrofagi. Caratterizzazione fenotipica delle DC intestinali e macrofagi viene effettuata direttamente colorazione cellule intestinali isolate con specifici anticorpi monoclonali marcati a fluorescenza per multi-colore analisi citofluorimetrica. Inoltre, DC altamente puro e popolazioni macrofagi sono isolati per studi funzionali utilizzano CD11c e CD11b magnetico attivati perline di separazione delle cellule seguite da selezione cellulare.
Protocol
1. Dissezione e la dissociazione di cellule epiteliali intestinali
Preparazione dei reagenti e attrezzature:
- Caldo Ca 2 + / Mg 2 +-libera PBS (CMF PBS) a temperatura ambiente.
- Caldo Ca 2 + / Mg 2 +-libere HBSS con 5% FBS (CMF HBSS / FBS) e 2 mM EDTA a temperatura ambiente.
- Warm Agitatore orbitale a 37 ° C.
Nota: Procedura 1,1 a 1,7 devono essere eseguite più rapidamente possibile per minimizzare l'entità della morte cellulare e per ottenere la massima resa cella.
- Euthanize topi in una camera di CO 2 e l'etanolo al 70% a spruzzo sul addome e torace.
- Effettuare una piccola incisione orizzontale al centro dell'addome con una forbice e staccare la pelle per esporre il peritoneo.
- Procedere per separare lo stomaco dalla parte superiore dell'intestino tenue tagliando alla sfintere pilorico. Tease via il mesentere con una pinza e tagliare di nuovo al'ileo-cecale valvola per liberare l'intero intestino piccolo crasso. Fare un taglio al margine anale e di nuovo prendere in giro oltre il mesentere fino a quando il grosso intestino è gratuito.
- Tagliare i due punti longitudinalmente con le forbici e lavare i contenuti fecali e muco dal lume intestinale in CMF PBS a temperatura ambiente.
- Usare le forbici e pinze a sezionare macroscopicamente le placche di Peyer, lungo la superficie anti-mesenterico dell'intestino tenue e tagliare aperta longitudinalmente l'intestino tenue.
- Lavare il lume dell'intestino tenue di contenuti fecali e muco nelle CMF PBS a temperatura ambiente.
- A parte tagliare il piccolo intestino / grandi dimensioni in pezzi di circa 1,5 cm e mettetela in distinte provette da 50 ml coniche contenenti 30 ml di pre-riscaldato HBSS CMF / FBS e 2 mM EDTA. Non aggiungere più di 1 intestino per tubo da 50 ml.
- Posizionare orizzontalmente ogni tubo da 50 ml conica in un agitatore orbitale ed agitare per a 250 rpm per 20 min a 37 ° C. </ Li>
- Posizionare un unico filtro di rete metallica su un secchio dei rifiuti e versare il contenuto di ciascuna provetta 50 ml conica attraverso il recupero dei pezzi di 1,5 cm di intestino e metterli in diverse provette da 50 ml coniche contenenti 30 ml di pre-riscaldati CHBSS / FB con 2 mM EDTA.
- Ripetere 1,8.
2. Tissue Digestione e isolamento delle cellule intestinali
Preparazioni a base di reagenti e attrezzature:
- Collagenasi soluzione: 1,5 mg / ml Tipo VIII Collagenasi disciolto in preriscaldata HBSS CMF / FBS con 40 pg / ml di DNasi I.
- Pre-riscaldata HBSS CMF / FBS e 2 mM EDTA.
- Pre-riscaldata agitatore orbitale a 37 ° C.
- Ice-freddo HBSS CMF / FBS.
- Dopo il secondo turno di scuotere, versare il contenuto di ciascuna provetta 50 ml conica attraverso il filtro e trasferire pezzi di 1,5 cm di intestino ad una plastica piccola pesa barca dopo tamponando distanza supporti in eccesso con un tovagliolo di carta.
- Rapidamente tritare il 1.5 Pezzi cm di intestino usando forbici direttamente sulla barca peso e aggiungere intestino macinata a 20 ml di soluzione di collagenasi. Posizionare orizzontalmente ogni tubo da 50 ml conica in un agitatore orbitale e digest a 200 rpm per 10-20 min a 37 ° C. Si prega di consultare la discussione sotto per quanto riguarda l'ottimizzazione.
- Brevemente vortice di assicurare la dissociazione completa di qualsiasi restante tessuto intestinale e filtrare attraverso un colino 100 micron cella direttamente in una provetta da 50 ml.
- Top off ogni provetta conica da 50 ml con HBSS CMF / FBS e centrifugare a 1500 rpm per 5 min a 4 ° C. Se un solido pellet non si osserva per i campioni del colon dopo la centrifugazione, i campioni devono essere centrifugati di nuovo per 3,5 min. Ripetere questa fase di lavaggio, una volta di più.
- Eliminare il sopranatante e risospendere il pellet cellulare in ghiacciato HBSS CMF / FBS e campioni posto sul ghiaccio.
- Procedere alla Sezione 3 per l'acquisizione FACS / analisi o la sezione 4 per magneto-tallone di arricchimento per la cella sorti ad alta velocitàng.
3. Colorazione anticorpo per Multi-Color mediante citometria a flusso delle cellule dendritiche e macrofagi
Preparazioni a base di reagenti e attrezzature:
- Ice-freddo CMF PBS.
- Tampone ghiacciato colorazione (CMF PBS + 5% FBS).
- Preparare cellula morta macchia in ghiacciato CMF PBS alla diluizione 1:1000 utilizzando LIVE / DEAD fissabile Kit Dead Cell Aqua Stain.
- Preparare il cocktail di anticorpi colorazione aggiungendo le seguenti fluorescenza marcati anticorpi monoclonali (mAb) al tampone ghiacciato colorazione: PerCP CD45-, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (IA b)-Alexa Fluor 700, CD11b eFluor-450, F4/80-PE-Cy7.
- Trasferire le cellule in un polistirene da 5 ml a fondo rotondo (FACS) tubo.
- Lavare le cellule due volte in ghiacciato CMF PBS.
- Incubare campioni con cellule morte colorare per 15 min in ghiaccio al buio.
- Lavare le cellule due volte in ghiacciato CMF PBS.
- Celle a blocchi con 2.4G2 anti-FcγRIII/II in ghiacciato colorazionetampone per 10 min in ghiaccio.
- Lavare le cellule in tampone ghiacciato colorazione.
- Incubare campioni con cocktail colorazione anticorpale per 20 min in ghiaccio al buio.
- Lavare le cellule con tampone ghiacciato colorazione due volte campioni e risospendere in 400 microlitri di tampone ghiacciato colorazione e passare attraverso cap 40 micron filtro sui tubi FACS.
- Acquisire campioni su LSR II citometro (BD), come definiti dalla strategia di gating nella Sezione 5 e nella Figura 1.
4. Arricchimento della DC e dei macrofagi da parte dell'intestino
Preparazioni a base di reagenti e attrezzature:
- Tampone ghiacciato colorazione (CMF PBS + 5% FBS).
- Incubare singola sospensione cellulare ottenuta dal punto 2.5 con CD11b e CD11c perle MACS secondo le istruzioni del produttore.
- Lavare le cellule con tampone ghiacciato colorazione seguita da centrifugazione.
- Gettare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 1 ml di tampone ghiacciato colorazionee passano attraverso un filtro 100 pm cella seguito da un filtro cella 40 um.
- Arricchire per magnetici bead-cellule collegate da una selezione positiva utilizzando MACS colonna magnetica LS.
- Ripetere il passaggio 4.2 e scartare il surnatante.
- Incubare le cellule con anticorpi monoclonali marcatori di superficie come descritto al punto 3.7.
- Lavare magnetici tallone arricchiti di cellule due volte con tampone ghiacciato colorazione. Risospendere pellet cellulari in 500 microlitri tampone ghiacciato colorazione senza azide di sodio, e passare attraverso il filtro 40 micron cellule in una provetta FACS.
- Procedere alla FACS-ordinamento sulla cella BD ARIA Sorter II per ordinare DC intestinale e / o sottoinsiemi dei macrofagi di interesse.
5. Strategia di gating per LP APC
Nota: Si noti che non marcate cellule intestinali può essere utilizzato come controllo negativo per assistere nel posizionamento corretto delle porte per separare popolazioni positive e negative.
- Come mostrato in figura1, creare un grafico punto e escludere le cellule che sono positivi per la cella morti macchia (Fig. 1A) seguita dalla esclusione di eventi doppietto (Fig. 1B e C). Poi, porta sulle cellule di interesse in funzione di trasmettere e disperdere lato fare in modo di escludere i detriti (Fig. 1D).
- Creare un altro dot plot e porta avanti CD45 + b + e IA, che caratterizza le cellule fenotipicamente APC (Fig. 1E).
- Su un diagramma dot separato, per analizzare l'espressione CD11c CD11b e per distinguere DC specifici sottoinsiemi e macrofagi (R1, R2, e R3;. Figura 1F). Cellule di R1 sono CD11c + CD11b spenti / - cellule. La regione, R2, è delineato in modo tale che queste cellule hanno livelli simili di espressione superficie CD11c come in cellule di R1, ma anche cellule di R2 esprimono CD11b. Successivamente, la regione R3 è designato per le celle che sono + CD11b e opaco / CD11c -.
- Unalyze regioni R1, R2, R3 e ulteriore espressione per F4/80 e CD103 differenziare macrofagi e popolazioni CC, rispettivamente. Il CD11c + CD11b opaco / - cellule R1 esprimono alti livelli di integrina αE, CD103, e bassi livelli di F4/80 (Fig. 1G). CD11b + + CD11c cellule di R2 sono composti da entrambi i DC e dei macrofagi in base alla loro espressione dicotomica del CD103 e F4/80 (Fig. 1 H). Infine, CD11b + CD11c opache / - cellule di macrofagi R3 costituiscono in base al profilo di fenotipica F4/80 CD103 + e - (Fig. 1I) 16.
6. Risultati rappresentativi
Figura 1. Strategia di gating per DC intestinali e macrofagi. Cellule morte (A) e farsetti (B e C) sono stati esclusi dall'analisi e poi piccolo intestinalenali cellule erano gated conseguenza di trasmettere e lato scatter (D), e APC sono stati definiti come CD45 + IA b + (E). I macrofagi e DC sono stati identificati mediante l'espressione di CD11b e CD11c (F). CD103 e F4/80 espressione per cellule pre-gated su R1 (G), R2 (H) e R3 (I) popolazioni stato analizzato.
Figura 2. Quantità di cellule e la colorazione di qualità anticorpi dipende dal tempo di digestione. CD11b e pattern di colorazione CD11c e la resa totale delle cellule di sotto-(A, D), in modo ottimale-(B, E) o sopra-digerito (C, F) tessuto intestinale.
Cellule intestinali sono stati isolati da un intestino C57BL / 6 topo piccolo e DC e macrofagi sono stati analizzati mediante FACS sulla LSR BD II. Tensione e compensazione erano state impostate utilizzando solo fluorocromo non colorati e macchiati di splenociti. Le cellule morte (Fig. 1A) e farsetti (Fig. 1B e C) sono stati esclusi dallal'analisi. Le cellule di interesse sono stati poi analizzati secondo di trasmettere e lato scatter (Fig. 1D), seguita da gating sul CD45 + b + IA e cellule (Fig. 1E). Successivamente, CD11b ed espressione CD11c è stata valutata tra il CD45 + b + IA cellule per delineare tre regioni (R1, R2, e R3;. Figura 1F). CD103 e F4/80 espressione nelle tre regioni è stata valutata per distinguere tra DCS e macrofagi, rispettivamente. Il CD11c + CD11b / opaco - cellule R1 espresso alti livelli di integrina αE, CD103, e bassi livelli di F4/80 (Fig. 1G). CD11b + + CD11c cellule R2 erano composti sia DC e dei macrofagi in base alla loro espressione dicotomica del CD103 e F4/80 (Fig. 1 H), mentre CD11b + CD11c spenti / - cellule R3 costituiscono macrofagi in base al profilo fenotipica della F4 / 80 + e CD103 - (
Il rapporto tra la durata di digestione tessutale sulla resa cellulare totale e l'espressione di CD11b e CD11c è illustrato nella figura 2. Tessuto intestinale che è stato digerito per 3 min (sotto-digestione) prodotto a basso numero totale delle cellule (Fig. 2D) e DCS così pochi e macrofagi disponibili per la caratterizzazione (Fig. 2A). La digestione del tessuto per 11 minuti ha prodotto un rendimento affidabile di cellule vive (Fig. 2E) con popolazioni di cellule dendritiche ei macrofagi che esprimono alti livelli di CD11b e CD11c ed erano fenotipicamente distinti (Fig. 2C). Al contrario, la digestione per 50 min (over-digestione) ha comportato una resa simile cella quando compared a digestione ottimizzata (2E Fig. e F), tuttavia, la definizione delle diverse popolazioni cellulari utilizzando CD11b e CD11c divenne più alternativi come l'espressione di diminuita CD11c (Fig. 2C) e il numero di cellule morte aumentata (dati non mostrati).
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Discussion
Figura 3. Fattori importanti per l'ottimizzazione della resa delle cellule e l'espressione dell'antigene di superficie. Resa cellulare e l'espressione dell'antigene di superficie sono direttamente interessati dalla durata della digestione dei tessuti, le caratteristiche specifiche del collagenasi, il grado di macinazione dei tessuti e la presenza o l'assenza di infiammazione, che possano pregiudicare l'integrità dei tessuti e cellularità. Digestione tessutale prolungato può provocare diminuita vitalità cellulare e l'espressione dell'antigene di superficie, mentre la digestione tissutale insufficiente può comportare una scarsità di cellule per l'analisi.
Qui, abbiamo dettagliato una metodologia per l'isolamento rapido di cellule dendritiche ei macrofagi intestinali del mouse per la caratterizzazione fenotipica utilizzando multi-color citometria a flusso e per l'arricchimento con perline MACS e di separazione delle cellule di condurre studi funzionali su cellule purificate. Ottimizzazione della concentrazione di collagenasie la durata di digestione tessutale è necessario per produrre una resa robusta cella senza compromettere la vitalità e antigene di espressione di superficie. Sotto-digestione produce un basso numero cellulare totale e una scarsità di macrofagi e cellule dendritiche per la caratterizzazione (Fig. 2A e D). D'altra parte, oltre-digestione produce un numero totale cellulare simile a condizioni ottimizzate (Fig. 2F), ma il numero di cellule morte sono sensibilmente aumentato (dati non mostrati) e la qualità della colorazione è compromessa. Simile al sotto-digestione, l'over-digestione del tessuto complicherebbe caratterizzazione fenotipica e purificazione.
Diversi parametri aggiuntivi a titolo oneroso che utilizzano questo protocollo sono il tipo, produttore e specifico lotto di collagenasi, l'integrità e la cellularità dell'intestino, e il grado di macinazione del tessuto. Come variabilità dell'attività collagenasi possono esistere tra i produttori di diversi tipi di collagenasi, ed ecco la produzionets, la potenza di digestione può variare notevolmente e richiede l'ottimizzazione. Quindi, la selezione del tipo più appropriato di collagenasi è critico quando si progetta un esperimento come la qualità e la riproducibilità dei dati può essere influenzata. Nella nostra esperienza, collagenasi tipo VIII ottenuta da Sigma-Aldrich ha fornito i migliori risultati, però, abbiamo anche avuto successo con collagenasi di tipo IV da Sigma-Aldrich.
Mentre il protocollo dettagliata di cui sopra è stato ottimizzato per l'uso su sani intestino tenue e crasso, può essere utilizzato con successo per l'isolamento di cellule dendritiche e macrofagi da tessuto infiammato espongono cellularità maggiore e distorsione architetturale associata a infiammazione. La presenza di infiammazione intestinale può influenzare notevolmente il tasso di digestione-spesso aumentare la sensibilità del tessuto intestinale all'azione di enzimi proteolitici basate sulla nostra esperienza. Pertanto, la durata della digestione o concentration di collagenasi deve essere adattato di conseguenza alle variazioni integrità dei tessuti associati con l'infiammazione.
Inoltre, il grado di macinazione del tessuto influenzerà la durata di digestione tessutale. Macinare il tessuto in pezzi più piccoli aumenta la superficie per la digestione e produce nuove cellule, ma le precauzioni dovrebbero essere prese, come il tessuto possono essere più suscettibili a un eccesso di digestione. Di conseguenza, la durata di digestione può essere necessario diminuita. Al contrario, macinazione povero si tradurrà in grandi pezzi di tessuto che digeriscono male conseguente bassa resa totale di cellule. Aumentare la durata di digestione può compensare per tritare poveri in una certa misura.
Dopo ottimizzando i parametri per digestione con collagenasi tessuto intestinale, una resa cellula resistente può essere raggiunto rapidamente. Come risultato, DC intestinale e popolazioni di macrofagi può essere più accuratamente purificato e caratterizzato per studi funzionali per valutare citochinaproduzione, presentazione antigene, e la regolazione delle cellule immunitarie.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Aaron Rae (Emory University Dipartimento di Pediatria e Healthcare bambini di Core flusso Atlanta) per l'ordinamento delle cellule. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH AA01787001, un Career Development Award dal morbo di Crohn e Colite Foundation of America, e della ricerca uno Emory-Egleston Children Center di sementi sovvenzione TLD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+- and Mg2+-free | |||
| Hank's balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza Inc. | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| DNase I | Roche Group | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD Biosciences | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD Biosciences | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Biosciences | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD Biosciences | ||
| FACSAria II | BD Biosciences |
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