Abstract
Innenfor tarmen bor unike bestander av medfødte og ervervede immun celler som er involvert i å fremme toleranse overfor Commensal flora og mat antigener mens samtidig resterende klar til å montere inflammatoriske responser mot invasiv patogener 1,2. Antigenpresenterende celler, særlig DCS og makrofager, spiller avgjørende roller i å opprettholde intestinal immune homeostase via deres evne til å oppfatte og å reagere på den bakterieflora 3-14. Effektiv isolering av tarm DCS og makrofager er et kritisk punkt i karakterisere fenotypen og funksjon av disse cellene. Mens mange effektive metoder for å isolere intestinal immunceller, blant annet DCS og makrofager, har blitt beskrevet 6,10,15-24, mange er avhengige av lange digestions tider som kan negativt påvirke celleoverflateantigen uttrykk, celleviabilitet, og / eller celle yield. Her detalj vi en metode for rask isolering av et stort antall viable, intestinal DCS og makrofager. Fenotypisk karakterisering av intestinale DCS og makrofager blir utført av direkte flekker isolerte tarmcellene med konkrete fluorescens-merkede monoklonale antistoffer for multi-farge flowcytometrisk analyse. Videre er svært ren DC og macrophage populasjoner isolert for funksjonelle studier utnytte CD11c og CD11b magnetisk aktivert celle sortering perler etterfulgt av celle sortering.
Protocol
1. Disseksjon og dissosiasjon av Intestinal Epitelceller
Utarbeidelse av reagenser og utstyr:
- Varm Ca 2 + / Mg 2 +-free PBS (CMF PBS) til romtemperatur.
- Varm Ca 2 + / Mg 2 +-free HBSS med 5% FBS (CMF HBSS / FBS) og 2mm EDTA til romtemperatur.
- Varm Orbital shaker til 37 ° C.
Merk: Steps 1.1 til 1.7 må utføres så raskt som mulig for å minimalisere omfanget av celledød og for å oppnå maksimal celle yield.
- Avlive mus i en CO 2 kammer og spray 70% etanol på magen og thorax.
- Lag en liten horisontal snitt i midten av magen med en saks og skrelle tilbake huden å eksponere peritoneum.
- Fortsett å skille magen fra øvre tynntarmen ved å kutte på pyloric sphincter. Erte bort mesenteriet med pinsett og kuttes igjenden ileo-cecal ventil for å frigjøre hele tynntarmen fra tykktarmen. Lag et snitt på anal randen og igjen erte hverandre den mesenteriet inntil tykktarmen er gratis.
- Skjær åpne tykktarmen lengderetningen ved hjelp av saks og vask av fekal innhold og slim fra intestinal lumen i CMF PBS ved romtemperatur.
- Bruk saks og pinsett for å makroskopisk dissekere ut Peyer sin flekker langs anti-mesenteric overflate av tynntarm og kuttet opp i tynntarmen lengderetningen.
- Vask tynntarmen lumen av fecal innhold og slim i CMF PBS ved romtemperatur.
- Separat kutte den lille / tykktarmen til ca 1,5 cm biter og legg dem inn i separate 50 ml koniske rør som inneholder 30 ml forvarmes CMF HBSS / FBS og 2mm EDTA. Ikke legg mer enn en tarm per 50 ml konisk rør.
- Horisontalt plassere hver 50 ml konisk rør inn en orbital shaker og rist for ved 250 rpm i 20 min ved 37 ° C. </ Li>
- Plasser en eneste maske ledning sil over en avfall bøtte og helle innholdet i hver 50 ml konisk rør gjennom å utvinne 1,5 cm biter av tarmen og plassere dem i egne 50 ml koniske rør som inneholder 30 ml forvarmet CHBSS / FBS med 2 mM EDTA.
- Gjenta 1,8.
2. Tissue Fordøyelse og Isolering av tarmcellene
Preparater av reagenser og utstyr:
- Collagenase løsning: 1,5 mg / ml Type VIII collagenase oppløst i forvarmes CMF HBSS / FBS med 40 mikrogram / ml DNase I.
- Forvarmes CMF HBSS / FBS og 2mm EDTA.
- Forvarmes orbital shaker ved 37 ° C.
- Iskald CMF HBSS / FBS.
- Etter den andre runden av risting, helle innholdet i hver 50 ml konisk rør gjennom silen og overføre 1,5 cm biter av tarmen til en liten plast veie båten etter dabbing vekk overflødig medier med et papirhåndkle.
- Raskt Finhakk 1.5 Cm biter av tarmen ved hjelp av saks direkte i vekt båten og legge hakket tarmen til 20 ml collagenase løsning. Horisontalt plassere hver 50 ml konisk rør inn en orbital shaker og fordøye på 200 rpm i 10-20 minutter ved 37 ° C. Se omtale nedenfor om optimalisering.
- Kort vortex å sikre grundig dissosiasjon av eventuelle gjenværende tarmvevet og filteret gjennom en 100 mikrometer celle sil direkte inn i en 50 ml konisk rør.
- Mest av hver 50 ml konisk rør med CMF HBSS / FBS og sentrifuger ved 1500 rpm i 5 min ved 4 ° C. Hvis en solid pellet ikke observeres for tykktarm prøver etter sentrifugering, bør prøvene sentrifugeres igjen for 3,5 min. Gjenta dette vasketrinn igjen.
- Hell av supernatanten og resuspender cellen pellet i iskaldt CMF HBSS / FBS og sted prøver på isen.
- Fortsett til avsnitt 3 for FACS erverv / analyse eller § 4 for magnetisk-perle berikelse for høyhastighets celle sorting.
3. Antistoff Farging for Multi-Color flowcytometrisk analyse av utviklingsland og makrofager
Preparater av reagenser og utstyr:
- Iskald CMF PBS.
- Iskald flekker buffer (CMF PBS + 5% FBS).
- Forbered død celle flekk i iskaldt CMF PBS ved 1:1000 fortynning bruker LIVE / DEAD fikses Aqua død celle Stain Kit.
- Klargjør antistoff farging cocktail ved å legge følgende fluorescens-merkede monoklonale antistoffer (mAbs) til det iskalde flekker buffer: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (IA b)-Alexa 700 Fluor, CD11b 450-eFluor, F4/80-PE-Cy7.
- Overfør cellene inn i en 5 ml polystyren rundbunnet (FACS) tube.
- Vask cellene to ganger i iskaldt CMF PBS.
- Inkuber prøver med døde celler beis for 15 min på isen i mørket.
- Vask cellene to ganger i iskaldt CMF PBS.
- Block celler med 2.4G2 anti-FcγRIII/II i iskaldt flekkerbuffer for 10 min på isen.
- Vask cellene i iskald flekker buffer.
- Inkuber prøver med antistoff farging cocktail for 20 min på isen i mørket.
- Vask celler med iskald flekker buffer to ganger og resuspender prøver i 400 mL av iskald flekker buffer og passerer gjennom 40 mikrometer filterlokket på FACS rør.
- Tilegne prøver på LSR II cytometer (BD) som definert av gating strategien i kapittel 5 og Figur 1.
4. Anrikning av DCS og makrofager fra tarmen
Preparater av reagenser og utstyr:
- Iskald flekker buffer (CMF PBS + 5% FBS).
- Inkuber enkelt celle suspensjon hentet fra trinn 2,5 med CD11b og CD11c MACS perler i henhold til produsentens anvisninger.
- Vask celler med iskald flekker buffer etterfulgt av sentrifugering.
- Kast supernatant og resuspender cellen pellet i 1 mL iskaldt flekker bufferog passerer gjennom et 100 mikrometer celle sil etterfulgt av en 40 mikrometer celle sil.
- Enrich for magnetiske kuler-tilkoblede celler ved positiv utvelgelse bruke MACS LS magnetisk kolonne.
- Gjenta steg 4,2 og kast supernatanten.
- Inkuber cellene med overflate markør mAbs som beskrevet i trinn 3.7.
- Vask magnetiske perle-beriket celler to ganger med iskald flekker buffer. Resuspender celle pellets i 500 mL iskaldt flekker buffer uten natriumazid, og passerer gjennom 40 mikrometer celle sil inn en FACS tube.
- Fortsett til FACS-sortering på BD ARIA II Cell sorter å sortere intestinal DC og / eller macrophage undergrupper av interesse.
5. Gating Strategi for LP APC
Merk: Vær oppmerksom på at unstained tarmcellene kan brukes som en negativ kontroll for å bistå i riktig plassering av portene for å skille positive og negative populasjoner.
- Som vist i figur1, opprette en prikk tomt og inkluderer celler som er positive for de døde cellen flekken (Fig. 1A) etterfulgt av utelukkelse av Doublet hendelser (Fig. 1B og C). Deretter gate på cellene av rente etter å videresende og side scatter å sørge for å utelukke rusk (Fig. 1D).
- Opprett en ny prikk tomt og videre gate på CD45 + og IA b + celler, som fenotypisk karakteriserer APC (Fig. 1E).
- På en egen prikk tomt, analysere for CD11b og CD11c uttrykk for å skille spesifikk DC og macrophage undergrupper (R1, R2 og R3,. Fig. 1F). Celler av R1 er CD11c + CD11b sløve / - celler. Regionen, R2, er avgrenset slik at disse cellene har lignende nivåer av overflate uttrykk for CD11c som i cellene i R1, men cellene i R2 også uttrykkelig CD11b. Deretter blir R3 regionen utpekt for celler som er CD11b + og CD11c kjedelig / -.
- Enalyze regioner R1, R2 og R3 videre for F4/80 og CD103 uttrykk å differensiere macrophage og DC populasjoner, henholdsvis. Den CD11c + CD11b kjedelig / - cellene i R1 uttrykte høye nivåer av αE integrin, CD103, og lave nivåer av F4/80 (Fig. 1G). CD11b + CD11c + celler av R2 er sammensatt av både utviklingsland og makrofager basert på deres dikotom uttrykk av CD103 og F4/80 (Fig. 1H). Endelig CD11b + CD11c sløve / - cellene i R3 utgjør makrofager basert på fenotypiske profilen F4/80 + og CD103 - (Fig. 1I) 16.
6. Representative Resultater
Figur 1. Gating strategi for intestinal DCS og makrofager. Døde celler (A) og dubletter (B og C) ble først ekskludert fra analysen, og deretter liten intestisjonelle celler var inngjerdet tilsvarende å videresende og side scatter (D), og APC ble definert som CD45 + IA b + (E). Makrofager og DCS ble identifisert ved uttrykket av CD11b og CD11c (F). CD103 og F4/80 uttrykk for celler pre-gated på R1 (G), R2 (H) og R3 (I) populasjoner ble analysert.
Figur 2. Cell avkastning og antistoff farging kvalitet avhenger fordøyelsen tid. CD11b og CD11c flekker mønster og total celle utbytte av under-(A, D), optimalt-(B, E) eller over-fordøyd (C, F) tarmvevet.
Tarmcellene ble isolert fra en C57BL / 6 mus tynntarmen og DCS og makrofager ble analysert ved FACS på BD LSR II. Spenning og erstatning ble satt ved hjelp unstained og enkelt fluorokromkonjugerte beiset splenocytes. Døde celler (Fig. 1a) og dubletter (Fig. 1B og C) ble først ekskludert fraanalysen. Celler av interesse ble deretter analysert etter å videresende og side scatter (Fig. 1D) etterfulgt av gating på CD45 + og IA b + celler (Fig. 1E). Deretter ble CD11b og CD11c uttrykk vurderes blant CD45 + IA b + celler å avgrense tre regioner (R1, R2 og R3,. Fig. 1F). CD103 og F4/80 uttrykk i de tre regionene ble vurdert å skille mellom utviklingsland og makrofager, henholdsvis. Den CD11c + CD11b kjedelig / - cellene i R1 uttrykt høye nivåer av αE integrin, CD103, og lave nivåer av F4/80 (Fig. 1G). CD11b + CD11c + celler i R2 var sammensatt av både utviklingsland og makrofager basert på deres dikotom uttrykk av CD103 og F4/80 (Fig. 1H) mens CD11b + CD11c sløve / - cellene i R3 utgjør makrofager basert på fenotypiske profilen F4 / 80 + og CD103 - (
Forholdet mellom varighet av vev fordøyelsen på total celle yield og uttrykk av CD11b og CD11c er illustrert i figur 2. Tarmvevet som ble fordøyd i 3 min (under-fordøyelse) ga lav total celle nummer (Fig. 2D) og dermed få DCS og makrofager tilgjengelige for karakteristikk (Fig. 2A). Tissue fordøyelsen for 11 min produsert en robust avkastning av levende celler (Fig. 2E) med bestander av DCS og makrofager som uttrykte høye nivåer av CD11b og CD11c og var fenotypisk tydelig (Fig. 2C). I kontrast, resulterte fordøyelsen i 50 min (over-fordøyelse) i en lignende celle avkastning når compared til optimalisert fordøyelsen (Fig. 2E og F), ble imidlertid avgrensning av ulike celle populasjoner med CD11b og CD11c mer obskure som uttrykk for CD11c redusert (Fig. 2C) og antall døde celler økte (data ikke vist).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Figur 3. Faktorer som er viktige for optimalisering av cellen yield og overflateantigen uttrykk. Cell yield og overflateantigen uttrykk er direkte berørt av varigheten av vev fordøyelse, de spesifikke egenskapene til collagenase, grad av vev hakking, og tilstedeværelse eller fravær av betennelse, som kan påvirke vev integritet og cellularitet. Langvarig vev fordøyelsen kan resultere i redusert celleviabilitet og overflateantigen uttrykk mens utilstrekkelig vev fordøyelsen kan resultere i en sparsomt med celler for analyse.
Her detaljert vi en metode for rask isolering av mus intestinal DCS og makrofager for fenotypisk karakterisering ved hjelp av multi-farge flowcytometri og for berikelse bruke MACS perler og celle sortering for å gjennomføre funksjonelle studier på renset celler. Optimalisere konsentrasjonen av collagenaseog varigheten av vev fordøyelsen er nødvendig for å produsere en robust celle avkastning uten at det går levedyktighet og overflate antigen uttrykk. Under-fordøyelse gir en lav total celle nummer og en sparsomt med DCS og makrofager for karakterisering (Fig. 2A og D). På den annen side, gir over-fordøyelse en total celle nummer lik optimaliserte forhold (Fig. 2F), men antall døde celler blir merkbart økt (data ikke vist) og kvaliteten på farging er kompromittert. I likhet med under fordøyelsen, ville over-fordøyelsen av vev komplisere fenotypisk karakterisering og rensing.
Flere andre parametere for vurdering ved hjelp av denne protokollen er produsent, type og spesifikk mye collagenase, integritet og cellularitet av tarmen, og graden av vev hakking. Som variasjon i collagenase aktivitet kan eksistere mellom ulike produsenter, typer collagenase og produksjon lots, styrkegraden på fordøyelsen kan variere sterkt og krever optimalisering. Derfor er valg av den mest hensiktsmessige form for collagenase kritisk når du utformer et eksperiment som kvaliteten og reproduserbarhet av data kan bli påvirket. Etter vår erfaring har collagenase skriver VIII hentet fra Sigma-Aldrich gitt de beste resultatene, har vi imidlertid også hatt suksess med collagenase type IV fra Sigma-Aldrich.
Mens ovenfor detaljerte protokollen har blitt optimalisert for bruk på friske små og store tarmen, kan det med hell brukes til isolering av DCS og makrofager fra betent vev stiller økt cellularitet og arkitektonisk forvrengning assosiert med betennelse. Tilstedeværelsen av intestinal inflammasjon kan dramatisk påvirke hastigheten på fordøyelsen, ofte øke følsomheten tarmvevet til handling av proteolytiske enzymer basert på vår erfaring. Derfor, varigheten av fordøyelsen eller concentration av collagenase må tilpasses deretter for endringer i vev integritet knyttet til betennelse.
Videre vil graden av hakking vevet påvirke varigheten av vev fordøyelsen. Hakking vevet i mindre biter øker arealet for fordøyelsen og gir flere celler, men forholdsregler må tas, da vevet kan være mer utsatt for over-fordøyelsen. Følgelig kan varigheten av fordøyelsen må reduseres. I kontrast vil dårlig hakking resultere i større biter av vev som skal fordøyes dårlig resulterer i en lav total celle yield. Økende varighet av fordøyelsen kan kompensere for dårlig hakking til en viss grad.
Ved å optimalisere parametrene for tarmvevet fordøyelsen med collagenase, kan en robust celle avkastning bli raskt oppnådd. Som et resultat, kan intestinal DC og macrophage populasjoner være mer nøyaktig karakterisert og renset for funksjonelle studier for å vurdere cytokinproduksjon, antigen presentasjon, og regulering av immunceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Aaron Rae (Emory University Department of Pediatrics og Barnas Healthcare of Atlanta Flow Core) for celle sortering. Dette arbeidet ble støttet av NIH AA01787001 bevilgning, en Career Development Award fra Crohns og kolitt Foundation of America, og en Emory-Egleston Barnas Research Center frø stipend til TLD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+- and Mg2+-free | |||
| Hank's balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza Inc. | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| DNase I | Roche Group | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD Biosciences | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD Biosciences | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Biosciences | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD Biosciences | ||
| FACSAria II | BD Biosciences |
References
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity. Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).
- Abraham, C., Medzhitov, R. Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).
- Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. Regula tine. Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).
- Rescigno, M. Intestinal dendritic cells. Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).
- Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation. J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).
- Coombes, J. L., Powrie, F. Dendritic cells in intestinal immune regulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).
- Kelsall, B. Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages. Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).
- Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets. Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).
- Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses. Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).
- Niess, J. H. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
- Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. How do DCs interact with intestinal antigens. Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).
- Bilsborough, J., Viney, J. L. Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease. Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).
- Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria. Gut. 52, 1522-1529 (2003).
- Medina-Contreras, O. CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice. J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).
- Denning, T. L. Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization. J. Immunol. , 187-733 (2011).
- Kim, Y. G. The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes. Immunity. 34, 769-780 (2011).
- Schulz, O. Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions. J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).
- Jaensson, E. Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans. J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).
- Uematsu, S. Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5. Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).
- Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases. J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).
- Sun, C. M. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).
- Kamada, N. Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria. J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).
- Denning, T. L. CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC. J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).
