Summary
Aquí, le detallamos una metodología para el aislamiento rápido de las células dendríticas de ratones intestinales (DCS) y los macrófagos. Caracterización fenotípica de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales se realiza utilizando varios colores, mientras que el flujo de análisis de citometría de enriquecimiento de bolas magnéticas seguido por la selección de células se utiliza para producir poblaciones de alta pureza para los estudios funcionales.
Abstract
Dentro del intestino residen poblaciones únicas de las células inmunitarias innatas y adaptativas que están involucrados en la promoción de la tolerancia hacia la flora comensal y antígenos alimentarios, mientras que concomitantemente a punto restante para montar las respuestas inflamatorias hacia el 1,2 patógenos invasores. Células presentadoras de antígeno, en particular los PED y los macrófagos, juegan un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis inmune intestinal a través de su capacidad de detectar y responder apropiadamente a la microbiota 3-14. El aislamiento eficiente de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales es un paso fundamental en la caracterización del fenotipo y la función de estas células. Mientras que muchos métodos eficaces de aislar intestinales células inmunes, incluyendo los DC y macrófagos, han sido descritos 6,10,15-24, muchas veces se basan en digestiones largas que pueden influir negativamente superficie celular expresión del antígeno, la viabilidad celular, y / o el rendimiento de la célula. Aquí, detalles de una metodología para el aislamiento rápido de un gran número de viable, los países en desarrollo y los macrófagos intestinales. Caracterización fenotípica de los DC intestinales y macrófagos se lleva a cabo por tinción aislados directamente con las células intestinales específicas fluorescencia-etiquetados anticuerpos monoclonales para el análisis de flujo de múltiples colores citometría. Por otra parte, CC de alta pureza y de las poblaciones de macrófagos están aislados de los estudios funcionales utilizando CD11c y CD11b magnética activadas por cuentas de células de clasificación seguido por la selección de células.
Protocol
1. La disección y la disociación de las células intestinales
Preparación de los reactivos y equipos:
- Cálido Ca 2 + / Mg 2 + libre de PBS (CMF PBS) a temperatura ambiente.
- Caliente Ca 2 + / Mg 2 +-libres HBSS con FBS al 5% (HBSS CMF / FBS) y 2 mM EDTA a temperatura ambiente.
- Cálido agitador orbital a 37 º C.
Nota: Los pasos de 1,1 a 1,7 debe realizarse lo más rápidamente posible para minimizar el grado de muerte celular y para lograr el máximo rendimiento celular.
- La eutanasia de los ratones en una cámara de CO 2 y etanol al 70% de pulverización en el abdomen y el tórax.
- Hacer una pequeña incisión horizontal en el centro del abdomen con una tijera y remueva la piel para exponer el peritoneo.
- Proceder a separar el estómago en el intestino delgado superior por el corte en el esfínter pilórico. Tease de distancia del mesenterio con unas pinzas y cortar de nuevo enla válvula ileocecal para liberar todo el intestino delgado del intestino grueso. Haga un corte en el orificio anal y otra vez separar el mesenterio del intestino grueso hasta que esté libre.
- Cortar los dos puntos longitudinalmente con tijeras y lavar contenido fecal y el moco de la luz intestinal en CMF PBS a temperatura ambiente.
- Con unas tijeras y pinzas de disección macroscópica de las placas de Peyer a lo largo de la superficie antimesentérico del intestino delgado y se abre el intestino delgado en sentido longitudinal.
- Lavar el lumen del intestino delgado de contenido fecal y moco en CMF PBS a temperatura ambiente.
- Por otro corte en el intestino delgado / de gran tamaño en aproximadamente 1,5 cm de piezas y ponerlas en diferentes tubos de 50 ml cónicos que contienen 30 ml de pre-calentado HBSS CMF / FBS y EDTA 2 mM. No agregue más de un intestino por 50 ml tubo cónico.
- Horizontalmente colocar cada tubo cónico de 50 ml en un agitador orbital y agitar durante a 250 rpm durante 20 min a 37 ° C. </ Li>
- Colocación de un filtro de malla de alambre sobre un solo cubo de la basura y verter el contenido de cada tubo cónico de 50 ml a través de recuperar las piezas de 1,5 cm de intestino y colocarlos en diferentes tubos de 50 ml cónicos que contienen 30 ml de precalentado CHBSS / FBs con 2 mM EDTA.
- Repita 1.8.
2. La digestión del tejido y aislamiento de las células intestinales
Preparaciones de reactivos y equipamiento:
- Colagenasa solución: 1,5 mg / ml de colagenasa tipo VIII disolvió en pre-calentado HBSS CMF / FBS con 40 mg / ml de DNasa I.
- Pre-caliente CMF HBSS / FBS y EDTA 2 mM.
- Pre-caliente agitador orbital a 37 º C.
- Helada CMF HBSS / SFB.
- Después de la segunda ronda de agitación, verter el contenido de cada tubo cónico de 50 ml a través del filtro y transferir 1,5 cm piezas de intestino a un pequeño de plástico pesan barco después frotando suavemente el exceso de material de distancia usando una toalla de papel.
- Rápidamente el picadillo de un.5 Piezas cm de intestino usando tijeras directamente en el bote de peso y añadir intestino picada a 20 ml de solución de colagenasa. Horizontalmente colocar cada tubo cónico de 50 ml en un agitador orbital y digerir a 200 rpm durante 10-20 min a 37 ° C. Por favor, ver más adelante en relación con la optimización.
- Brevemente vórtice para asegurar la disociación completa de cualquier tejido restante intestinal y filtrar a través de un colador micras 100 células directamente en un tubo cónico de 50 ml.
- Parte superior de cada tubo cónico de 50 ml con HBSS CMF / SFB y se centrifuga a 1500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Si un sólido precipitado no se observa para las muestras de colon después de la centrifugación, las muestras deben ser centrifugadas de nuevo por 3,5 min. Repita este paso de lavado, una vez más.
- Retirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en el hielo frío HBSS CMF / SFB y muestras lugar en el hielo.
- Proceda a la Sección 3 para la adquisición de FACS / o análisis de la Sección 4 de cordón magnético de enriquecimiento para celular sorti de alta velocidadng.
3. Anticuerpos de tinción para el Análisis de Flujo Multi-Color de citometría de países en desarrollo y los macrófagos
Preparaciones de reactivos y equipamiento:
- Helado de PBS CMF.
- Helado de buffer de tinción (CMF PBS + 5% de SFB).
- Prepare la mancha de células muertas en el hielo frío CMF PBS a una dilución 1:1000 con LIVE / DEAD Se fija Kit de Aqua Dead Cell Mancha.
- Preparar el cóctel tinción de anticuerpos mediante la adición de los siguientes fluorescencia-etiquetados anticuerpos monoclonales (mAb) a la tampón enfriado con hielo tinción: CD45-PerCP, PE-CD103, CD11c APC-, MHC II-(IA b)-Alexa Fluor 700, CD11b -eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.
- Transferir las células en un 5 poliestireno ml de fondo redondo (FACS) del tubo.
- Lave las células dos veces en helado CMF PBS.
- Incube las muestras con células muertas mancha durante 15 minutos en hielo en la oscuridad.
- Lave las células dos veces en helado CMF PBS.
- Las células de bloques con 2.4G2 anti-FcγRIII/II en helado tincióntampón durante 10 minutos en hielo.
- Lavar las células en tampón de tinción enfriado con hielo.
- Incubar las muestras con cóctel de anticuerpos tinción durante 20 minutos en hielo en la oscuridad.
- Lavar las células con tampón enfriado con hielo tinción dos veces y resuspender las muestras en 400 l de tampón enfriado con hielo tinción y pasar a través de la tapa 40 micras filtro en tubos FACS.
- Adquirir muestras de LSR II citómetro (BD), según la definición de la estrategia de puerta en la Sección 5 y la Figura 1.
4. El enriquecimiento de los países en desarrollo y los macrófagos en el intestino
Preparaciones de reactivos y equipamiento:
- Helado de buffer de tinción (CMF PBS + 5% de SFB).
- Incubar única suspensión celular obtenida de la etapa con 2,5 CD11b y perlas MACS CD11c de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Lavar las células con tampón de tinción enfriada con hielo, seguido por centrifugación.
- Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en un tampón de tinción ml enfriado con hieloy pasar a través de un colador micras 100 celular, seguido por un filtro de células 40 micras.
- Enriquecer de bolas magnéticas adheridas a las células por la selección positiva utilizando MACS columna LS magnético.
- Repita el paso 4.2 y desechar el sobrenadante.
- Se incuban las células con mAbs marcador de superficie tal como se describe en el paso 3,7.
- Lavar magnéticos talón enriquecidos con células dos veces con tampón de tinción enfriado con hielo. Resuspender sedimentos celulares en tampón de 500 l tinción helado sin azida de sodio, y pasan a través de 40 micras filtro de células en un tubo FACS.
- Proceda a la FACS, la clasificación en el Clasificador de BD ARIA de la célula para ordenar II DC intestinal y / o subconjuntos de macrófagos de interés.
5. Estrategia para la apertura de puerta LP APC
Nota: Obsérvese que no teñidas células intestinales se puede utilizar como un control negativo para ayudar en la colocación correcta de las puertas para separar poblaciones positivas y negativas.
- Como se muestra en la Figura1, crear un diagrama de puntos y no incluyen células que son positivas para la tinción de células muertas (fig. 1A), seguido por la exclusión de eventos doblete (Fig. 1B y C). Entonces, la puerta de las células de interés de acuerdo para avanzar y dispersión lateral asegurarse de excluir a los residuos (Fig. 1D).
- Crea otro gráfico de puntos y la puerta sobre CD45 + y b + IA células, lo que caracteriza fenotípicamente APC (Fig. 1E).
- En un gráfico de puntos por separado, el análisis de la expresión de CD11b y CD11c para distinguir las DC específico y subconjuntos de macrófagos (R1, R2 y R3;. Fig. 1F). Las células de R1 son CD11c + CD11b mate / - las células. La región, R2, se delinea de manera que estas células tienen niveles similares de expresión en la superficie para CD11c como en las células de R1 pero las células de R2 también CD11b expresa. Después de ello, la región R3 es designado para las células que son + CD11b y opaco / CD11c -.
- Uncatalizar regiones R1, R2, R3 y de expresión adicional para F4/80 y CD103 para diferenciar los macrófagos y las poblaciones de CC, respectivamente. El CD11c + CD11b aburrida / - las células de R1 expresan niveles elevados de la integrina αE, CD103, y bajos niveles de F4/80 (Fig. 1G). CD11b + CD11c + en las células de R2 se componen de los países en desarrollo y los macrófagos sobre la base de su expresión dicotómica de CD103 y F4/80 (Fig. 1H). Por último, CD11b + CD11c mate / - las células de los macrófagos constituyen R3 en función del perfil fenotípico de F4/80 + y CD103 - (Fig. 1i) 16.
6. Los resultados representativos
Figura 1. La estrategia de apertura de puerta para los países en desarrollo y los macrófagos intestinales. Las células muertas (A) y dobletes (B y C) fueron excluidos del análisis primero y luego pequeños intestinalnales células fueron separadas de acuerdo a la dispersión frontal y lateral (D), y vehículos blindados se define como CD45 + IA + B (E). Los macrófagos y los DC se identificaron mediante la expresión de CD11b y CD11c (F). CD103 y F4/80 expresión para células pre-bloqueado en R1 (G), R2 (H) y R3 (I) se analizó la población.
Figura 2. Rendimiento de la célula y la calidad tinción de anticuerpos depende del tiempo de digestión. CD11b y CD11c patrón de tinción y el rendimiento total de células de bajo-(A, D), de manera óptima-(B, E) o más digerido-(C, F) del tejido intestinal.
Células intestinales fueron aisladas de un intestino ratón C57BL / 6 pequeño y los DC y los macrófagos se analizaron por FACS en el II BD LSR. Voltaje y la indemnización se establece mediante teñidas y de un solo fluorocromo manchadas de esplenocitos. Las células muertas (Fig. 1A) y dobletes (Fig. 1B y C) fueron excluidos de primerael análisis. Las células de interés se analizaron a continuación de acuerdo con frontal y lateral de dispersión (Fig. 1D), seguido por inyección en CD45 + b + e IA células (Fig. 1E). Posteriormente, CD11b y CD11c expresión se evaluó entre el CD45 + IA b + células para delinear tres regiones (R1, R2 y R3;. Fig. 1F). CD103 y F4/80 expresión en las tres regiones se evaluó para distinguir entre los DC y macrófagos, respectivamente. El CD11c + CD11b aburrida / - las células de R1 expresaron altos niveles de la integrina αE, CD103, y bajos niveles de F4/80 (Fig. 1G). CD11b + CD11c + en las células de R2 se compone de los dos países en desarrollo y los macrófagos sobre la base de su expresión dicotómica de CD103 y F4/80 (Fig. 1H), mientras que CD11b + CD11c mate / - las células de R3 constituyen los macrófagos basados en el perfil fenotípico de F4 / 80 + y CD103 - (
La relación entre la duración de la digestión del tejido sobre el rendimiento total de células y la expresión de CD11b y CD11c se ilustra en la Figura 2. Tejido intestinal que se digirió durante 3 minutos (bajo-digestión) produjo bajo número total de células (Fig. 2D) y por lo tanto pocos países en desarrollo y macrófagos disponibles para la caracterización (Fig. 2A). Digestión de tejido durante 11 minutos produce un rendimiento sólido de células vivas (Fig. 2E) con poblaciones de países en desarrollo y los macrófagos que expresaban altos niveles de CD11b y CD11c y eran fenotípicamente distinta (Fig. 2C). En contraste, la digestión durante 50 min (sobre-digestión) resultó en un rendimiento celular similar cuando compared a la digestión optimizada (Fig. 2E y F), sin embargo, la delineación de diferentes poblaciones de células que utilizan CD11b y CD11c se hizo más oscuro como la expresión de CD11c disminuida (Fig. 2C) y el número de células muertas se incrementó (datos no presentados).
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Discussion
Figura 3. Factores importantes para la optimización del rendimiento de la célula y la expresión del antígeno de superficie. Rendimiento de la célula y la expresión del antígeno de superficie son afectados directamente por la duración de la digestión del tejido, las características específicas de la colagenasa, el grado de tejido picado, y la presencia o ausencia de inflamación, que puede afectar a la integridad del tejido y celularidad. Digestión del tejido prolongada puede resultar en disminución de la viabilidad celular y la expresión del antígeno de superficie mientras que la digestión del tejido inadecuado puede resultar en una escasez de células para su análisis.
En este sentido, se detalla una metodología para el aislamiento rápido de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales de ratones para la caracterización fenotípica con múltiples colores citometría de flujo y para el enriquecimiento de microesferas de Mac y celulares de clasificación para la realización de estudios funcionales de las células purificadas. Optimización de la concentración de la colagenasay la duración de la digestión del tejido es necesario para producir un rendimiento celular robusto sin comprometer la viabilidad y la expresión del antígeno de superficie. En la digestión se obtiene un bajo número total de células y la escasez de los países en desarrollo y los macrófagos para la caracterización (Fig. 2A y D). Por otro lado, el exceso de digestión se obtiene un número total de células similares a las condiciones optimizadas (Fig. 2F), pero el número de células muertas se incrementa apreciablemente (datos no mostrados) y la calidad de la tinción se ve comprometida. Similar a menores de digestión, el exceso de digestión de tejido complicaría caracterización fenotípica y purificación.
Varios parámetros adicionales para su consideración que utilizan este protocolo son el fabricante, tipo y lote específico de la colagenasa, la integridad y la celularidad del intestino, y el grado de tejido picado. Como la variabilidad en la actividad de la colagenasa puede existir entre diferentes fabricantes, tipos de colagenasa, y he aquí la producciónct, la potencia de la digestión puede variar enormemente y requiere optimización. Por lo tanto, la selección del tipo más adecuado de colagenasa es crítico cuando se diseña un experimento como la calidad y la reproducibilidad de los datos puede verse afectada. En nuestra experiencia, la colagenasa tipo VIII obtuvieron de Sigma-Aldrich ha proporcionado los mejores resultados, sin embargo, también hemos tenido éxito en el uso de colagenasa tipo IV de Sigma-Aldrich.
Mientras que el protocolo detallado anteriormente ha sido optimizado para su uso en sanos intestinos delgado y grueso, puede ser utilizado con éxito para el aislamiento de los DC y macrófagos de tejido inflamado que exhiben aumento en la celularidad y distorsión de la arquitectura asociada con la inflamación. La presencia de inflamación intestinal puede afectar dramáticamente la tasa de digestión, a menudo el aumento de la sensibilidad del tejido intestinal a la acción de las enzimas proteolíticas sobre la base de nuestra experiencia. Por lo tanto, la duración de la digestión o la concentration de la colagenasa se debe adaptar en consecuencia a los cambios en la integridad del tejido asociados con la inflamación.
Además, el grado de trituración del tejido afectará a la duración de la digestión del tejido. Picado el tejido en trozos más pequeños aumenta la superficie para la digestión y produce más células pero se deben tomar precauciones, como el tejido puede ser más susceptible a la sobre-digestión. En consecuencia, la duración de la digestión puede ser necesario disminuir. En contraste, pobre picado se traducirá en grandes piezas de tejido que se digieren mal que resulta en un rendimiento total de células bajo. El aumento de la duración de la digestión puede compensar picado pobre en cierta medida.
Al optimizar los parámetros para la digestión de tejido intestinal con colagenasa, una sólida producción de células puede ser rápidamente alcanzado. Como resultado, DC intestinal y poblaciones de macrófagos pueden ser más exactamente caracterizado y purificado para estudios funcionales para evaluar citoquinaproducción, presentación del antígeno, y la regulación de las células inmunes.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Aaron Rae (Universidad de Emory, Departamento de Pediatría y Salud Infantil de núcleo de flujo de Atlanta) para la clasificación de células. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención AA01787001, el Premio de Desarrollo de Carrera de la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of America, y una investigación de Emory-Egleston Children Center de semillas de subvención para TLD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+- and Mg2+-free | |||
| Hank's balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza Inc. | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| DNase I | Roche Group | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD Biosciences | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD Biosciences | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Biosciences | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD Biosciences | ||
| FACSAria II | BD Biosciences |
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