Summary
ポストヒトゲノム時代において、ネイティブコンフォメーションにおける組換えタンパク質の可用性は、構造、機能および治療の研究開発に不可欠である。ここでは、テストと組換えタンパク質のさまざまなを生成するために使用することができるヒト胚性腎臓293T細胞における大規模タンパク質発現系を記述します。
Abstract
細菌における組換えタンパク質の発現、一般的にE.大腸菌は 、蛋白質のミリグラム量の発現のための最も成功した戦略であった。しかし、原核生物宿主は、多くの人間は、ウイルスまたは真核生物の外国の高分子の毒性に起因するタンパク質、タンパク質の折り畳み機構の違い、または特定のCO-または細菌の翻訳後修飾の不足のための発現に応じてではありません。酵母（P.パストリスもしくはS.セレビシエ ）1,2、バキュロウイルス感染昆虫（S. frugiperdaまたは T NI）セル3、 および in vitro翻訳システムにおいて 、無細胞に基づく発現系は、2,4は正常にするために使用されている哺乳動物のタンパク質を生成します。直感的に、ベストマッチは、適切な翻訳後修飾を含む組換えタンパク質の生産を確保するために哺乳動物宿主を使用することです。哺乳動物細胞株の数（ヒト胚キッドネイ（HEK）S V40 larget T-抗原（COS）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）などを運ぶO riginで293、C V-1細胞）は、正常ヒトタンパク質の数ミリグラムの量を過剰発現するように利用されてきた5-9しかし、哺乳動物細胞を使用することの利点は、多くの場合、安定発現細胞株を開発するコストが高く、特殊な実験装置の要件は、低タンパク質の収量と、長い時間によって打ち消されています。コストを低く維持しながら、より高速な収率と生産するタンパク質を増加し、多くの学術的、商業的な研究所の主要な要因である。
ここでは、時間とコスト効率に優れ、接着HEK 293T細胞から分泌されるヒトタンパク質の発現のための2つの部分から成る手順を説明します。このシステムは、構造生物物理学的および生化学的研究のために機能的な蛋白質のミリグラム量にグラムを生産することが可能です。最初の部分は、目的の遺伝子の複数の構文が生成さです。並行して一時的に小さなスケールの付着HEK 293T細胞にトランスフェクションのd。細胞培養培地中に分泌された組換えタンパク質の検出および分析は、ベクトルでエンコードされたタンパク質精製タグに対する市販の抗体を用いたウェスタンブロット分析によって実行されます。その後、大規模なタンパク質の生産に適したコンストラクトを一過性に10層の細胞工場でポリエチレンイミン（PEI）を用いてトランスフェクトされる。馴化培地リットルボリュームに分泌されるタンパク質は、抗-HAアフィニティークロマトグラフィーによって精製してタンジェンシャルフローろ過を使用して、管理しやすい量に集中している。このプラットフォームのユーティリティは、サイトカイン、サイトカイン受容体、細胞表面受容体、本質的な制限要因、およびウイルスの糖蛋白質のミリグラム量を表現する能力によって証明されています。このメソッドは、成功した三量体エボラウイルス糖タンパク質5,10の構造決定で使用されています。
2インキュベーター以外の追加の機器は、必要ありません。この手順は、急速にそのようなタンパク質複合体、抗原と抗体、ワクチン、または困難な細胞株の形質導入のためのアデノウイルスまたはレンチウイルスの生産のためのウイルス様粒子の生産の共発現として、より複雑なシステムに拡張することができます。
Protocol
1。準備作業 - 構築および細胞培養
プロトコルを開始する前に、目的の遺伝子は、哺乳動物細胞における発現のためにコドンが最適化されるべきであり、標準的な分子生物学的手法を用いて適当な発現ベクターにクローニングした。成功した発現のための最高のチャンスを確実にするために、目的の遺伝子の複数の亜種を生成する必要があります。多くの哺乳動物発現ベクターは市販されており、様々な精製タグ（ヒスチジン、赤血球凝集素、ストレプトアビジン、HALO-タグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、とりわけ）を持っています。我々は強力なヒトサイトメガロウイルスプロモーター、免疫グロブリンκ分泌シグナル、ヘマグルチニン精製タグをコードするpDISPLAYベクトルを使用することを好む、と原形質膜上で表示するために分泌経路を介してタンパク質をターゲットとするC末端膜貫通アンカーを持っています。我々は通常ベクトルでエンコードされた貫通anchoの前にストップコドンを挿入rは、タンパク質は馴化培地中に分泌できるようにします。
ヒト胎児腎臓（HEK）293T細胞は、広く入手可能であり、容易に培養し、トランスフェクトした。 HEK 293Tには、定期的に哺乳動物タンパク質の発現のために使用されていますが、バイオハザードと考えられており、バイオセーフティレベル2で処理する必要があります。適切な個人防護服を着用してください。作業は無菌テクニックを使用して承認されたバイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。すべての廃棄物や表面が制度や政府のガイドラインに従って消毒しなければならない。それは細胞が使用する前にマイコプラズマ汚染についてテストすることをお勧めします。細胞は、マイコプラズマ属のいずれかのソースを根絶するために10日間シプロフロキサシン（10μg/ mlの）で処理されることがあります。汚染。 HEK 293T細胞を伝播するための一般的なプロトコル（ ボックス1）別々に表示されます。
テストおよび大規模タンパク質発現のための追加の考慮事項がrevieweです11月15日のd。
2。小規模なテスト式
一度構造体を設計し、生成された、小規模なテストトランスフェクションは、HEK 293T細胞を用いて行うことができる、プロセスを要約した回路図は（ 図1）以下に提示されます。
- HEK 293T細胞を成長させ、細胞が100％コンフルエント（ ボックス1）である場合2〜3日ごとにセルを分割するためにT75 cm 2以上T225 cm 2の細胞培養フラスコ（実行するテスト式の数に応じて）を使用します。
- 各ウェルにも細胞分散を確保するためのシード優しく2.5×ウェルあたり10 5 HEK 293T細胞を6ウェルプレートおよび1X pen / strepおよび10％（v / v）のFBSを2ミリリットルDMEMを追加し、渦巻板、 5％CO 2の加湿チャンバー内で37°Cで一晩インキュベートする。
- HEK 293T細胞は40％コンフルエントに達したときに、メディアを破棄し、ウェルに1X pen / strepおよび10％（v / v）のFBSを新鮮なDMEM 2ミリリットルを追加します。実行するトランスフェクションアッセイ。
- 滅菌1.5 mlのマイクロチューブに分注し90μlの無血清DMEMを。ピペット3μlの無血清DMEMにGeneJuiceゆっくりとチューブ（指の渦）を混ぜます。室温で5分間インキュベートします。
- プラスミドDNA（DNA在庫=は100 ng /μl）をDMEM-GeneJuice混合物、指のボルテックスし、室温で15分間インキュベートに精製したミニプレップの1μgを追加します。
- 静かにトランスフェクション混合物の均一な分布を可能にするためにトランスフェクション混合HEK 293T細胞上に滴下し、スワール、6ウェルプレートをピペット。 5％CO 2の加湿チャンバー内で37℃で6ウェルプレートをインキュベートします。
- 別の48時間各ウェルに24時間後にトランスフェクションし、インキュベートする1X pen / strepおよび10％（v / v）のFBSと1ミリリットル新鮮なDMEMを追加します（合計72時間）。
- 室温で10分間16,000 gでサンプルを3日後にトランスフェクションと微量で、各ウェルからの上清の収穫1ミリリットル。ウェスを行うボックス2で詳しく述べられるようにアジサシブロット分析。サンプルは4℃で保存することができます4℃貯蔵の長さは°Cは、タンパク質に依存しています。
3。大規模テストの発現と精製
構造が特定された後に組換え蛋白質のミリグラム量の発現は、10層の細胞工場（; 6360センチメートル2表面領域図2）を用いて付着HEK 293T細胞のPEIトランスフェクションすることにより達成される。より多くの探索的研究については、小さなセル工場やT-フラスコ（ 表1）を使用することができる。
- MaxiPrepプラスミド精製キットを用いてトランスフェクション用のDNAの1mgを精製する。 XL-1 Blue細胞を500mlの一晩培養物は、純粋なDNAの少なくとも1 mgを生成する必要があります。 260/280比を測定することにより、DNAの純度を確認し、1.8以上である必要があります。
- 2.0×10 8細胞にHEK 293T細胞をスケールアップ。各T225 cm 2のフラスコは100％コンフルエントの共同に成長ntainsと〜2.25×10 7細胞の平均。
- 10層のセル工場に5％（v / v）のFBSを1.2 L DMEMを追加します。セル工場に2.0×10 8 HEK 293T細胞を追加し、船舶のすべての層に均等にセルを配信します。それは、セルの工場での細胞のコンフルエントを可視化することは非常に困難である。代替として、10層の容器で実行されるように表面積の比が同じセル番号を使用して、適切な数の細胞をT75 cm 2のフラスコを設定します。成長率は、このフラスコを監視します。セルファクトリを扱う上で命令に関連付けられたビデオを参照してください。細胞の付着と成長を可能にするために、5％CO 2で37℃で一晩インキュベートします。
- 付着HEK 293T細胞が70％コンフルエントである場合、大規模なトランスフェクションを実行します。滅菌T75 cm 2のフラスコを用いてバイオセーフティキャビネットにPEI-DNAトランスフェクション混合物（DNA比3:1（w / w）のPEI）を準備します。滅菌1X PBS 84 mlでDNAの0.84 mgをミックスし、PEI（2 2.5ミリリットルを追加します。5 mgの合計PEI）である。 15分間室温でインキュベートします。解決策は、曇りになるはずです。
- セル工場にゆっくりPEI-DNAトランスフェクション混合物を注ぎ、十分に容器のすべての層を介して配布しています。オプション：増大した発現収量のために、バルプロ酸（4mMの最終濃度）を追加します。四日間、5％CO 2で37℃でインキュベートします。
- 収穫上澄み4日後にトランスフェクション。 4℃で30分間6000×gで馴化培地を遠心℃、さらに0.22μmのStericup真空フィルター装置を用いて上清をフィルタリングします。 10層の細胞の工場を再利用することができ、クリーニング手順については、 ボックス3を参照してください。それはクリーニングが上清収穫後直ちに開始されているキーです。容器表面に細胞が乾燥させません。
- セントラタンジェンシャルフローろ過システムを使用して75ミリリットルに上清を集中しています。
- PBSの500ミリリットルを追加し、75ミリリットルに再集中しています。 3 additを繰り返します。完全にバッファリングするional回は、サンプルを交換します。
- 1X PBS 1 mlの抗-HAアフィニティカラムを平衡と速度<1 ml /分で重力流によって濃縮されたサンプルを適用します。
- 1X PBS-Tween20を30mlでカラムを洗浄します。
- 1X PBS（1.0 mg / ml）と37℃でのHAペプチドを溶解させる
- 抗HAカラムにHAペプチドの1ミリリットルを適用して、ペプチドが樹脂に流入することができます。フロースルーを収集します。ペプチド溶液は、ベッドの高さに達した流れを停止します。
- 15分間37℃で全体の抗HAカラムをインキュベートします。
- 12さらに2回繰り返します。
- それはベッドの高さに達するまで、抗HA列と樹脂への流れに1X PBSを1 mlを適用します。フロースルーを収集します。
- 10ミリリットルの0.1 MグリシンpHは2.2と抗HA列を再生成します。 0.02％（w / v）を含むPBSで°CのNaN 3 4で10 mlのPBSや店舗アフィニティーカラムで洗浄する。
- SDS-PAGE分析およびプールfを実行します。それに応じてractions。注記：HAペプチド280またはブラッドフォードでのタンパク濃度の測定に干渉します。標準としてSDS-PAGEゲル上に存在するタンパク質の量は、負荷5、10、15、BSAの25μgを推定し、バンド強度を比較することができます。
ステップ9から17は、馴化培地から追加のタンパク質をキャプチャするために繰り返すことができます。
4。代表的な結果
この記事では、記述し、その後、構造と機能の研究に使用することができるヒトタンパク質のミリグラム量生産のための便利な表現のプラットフォームを示しています。 6ウェルプレートでHEK 293T細胞を用いたヒトタンパク質構造のスクリーニングは、効率的かつ大規模生産への影響を受けやすい構造を識別するのに効果的です。市販の発現ベクターは、GeneJuice、トランスフェHDやPEなどのトランスフェクション試薬のさまざまな方法を使ってHEK 293T細胞に効率的にトランスフェクトすることができ I.我々は、これらの試薬 は貧しい表現するタンパク質（ 図3）のためのより効果的であるため、テスト式は、そのようなGeneJuiceまたはトランスフェHDとして、市販のトランスフェクション試薬の使用をお勧めします。大規模な発現のために選択されたコンストラクトは、ウェスタンブロット（ 図3）上の適切な分子量に対応する単一の、強い強度のバンドによって特徴付けされるべきである。糖タンパク質は、グリコシル化の不均一性に起因する広いバンドとして移行することができます。我々は、ウイルス糖タンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、および他の表面タンパク質に至るまでの高分子の様々な、発現させ、この一般式のプラットフォームを用いたタンパク質のMillgram実量（ 図4）を得、精製することができることを示している。
図1小規模のトランスフェクションのワークフロー図を示します 。tp_upload/4041/4041fig1large.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。
図2。大規模タンパク質発現のためのコーニング10層のCellSTACK。各レイヤは、セルの添付ファイル636 cm 2の表面積を含んでいます。標準的な実験CO 2インキュベーター（6.0立方フィート）は、快適な4つの10層の細胞工場を保持します。
図3様々な分泌タンパク質の小規模発現我々は、一般的なトランスフェクション試薬を用いた小規模試験の一連の式を実行：。GeneJuice、トランスフェHDとPEIを選択した人間の細胞のタンパク質（tetherin）の（）のウェスタンブロットスクリーニング、受容体（IL-2Rβサブユニット）とサイトカイン（IL-2）。 Tetherinの放出を制限する人間の細胞膜糖タンパク質である新生HIV-1ビリオン16。 tetherinの細胞外ドメインは〜36 kDaのグリコシル化、ジスルフィド結合ダイマーとして存在しています。ここに示すように、還元条件下で、tetherinは〜22kDaの見掛けの分子量を有する単量体として移行されます。インターロイキン-2（IL-2）は、リンパ球の増殖に関与するサイトカイン17（〜17 kDa）のです。それはIL-2Rβsubunitが（〜26 kDa）の成分18になっている、IL-2受容体複合体と相互作用する。 CD21は補体系による活性化および成熟B細胞に関与する膜タンパク質であり、また、エプスタイン - バーウイルスの受容体である。 CD21のグリコシル化細胞外ドメインは〜20kDaの見掛けの分子量を有する単量体として移行されます。選択したサーフェスウイルス糖タンパク質（XMRV envおよびエボラウイルスGP）（b）のウェスタンブロットスクリーニング。 XMRVとエボラウイルス糖タンパク質（膜貫通アンカーが削除された）は三量体スパイクのようなウイルス膜に存在し、宿主細胞接着に関与していると融合。 XMRV envおよびEBOV GPの細胞外ドメインは重く、N-結合型糖鎖で飾られ、それぞれ、70 kDaと75kDaの見かけの分子量で移動されています。
図4。大規模HEK 293T培養物からヒトの細胞のタンパク質を精製した 。すべてのタンパク質は、10層のセルファクトリを使用して発現し、抗HAクロマトグラフィーにより濃縮し、精製した。クマシー染色SDS-PAGE分析で示すように、細胞外ドメインインターロイキン2受容体（IL-2R）αおよびγサブユニットは、それぞれ40 kDaと46 kDaの分子量に移行します。 tetherinの細胞外ドメインは36 kDaの見かけの分子量と、非還元条件下では、二量体として移行されます。 60kDaの見かけの分子量で表示されるいくつかのBSA汚染があることに注意してください。さらに、N-結合型グリカンの異質性は、tetherin上に存在するIL-2RαとIL-2Rγ原因バンドがSDS-PAGEゲル上での広がり。これらの複合型N-結合型糖鎖は、ペプチドを使用して削除することができます：N-グリコシダーゼFで
| 容器 | 表面積 |
| 6ウェルプレート | 9.5センチメートル2（各ウェル） |
| 100ミリメートル料理 | 55センチメートル2 |
| 245ミリメートル料理 | 500センチメートル2 |
| T75 cm 2のフラスコ | 75センチメートル2 |
| T175 cm 2のフラスコ | 175cm 2の |
| T225 cm 2のフラスコ | 225センチメートル2 |
| ローラーボトルレギュラー | 850センチメートル2 |
| ローラーボトル拡張面 | 1700 cm 2と |
| 1層CellSTACK | 636センチメートル2 |
| 2層CellSTACK | 1272センチメートル2 |
| 5層CellSTACK | 3180センチメートル2 |
| 10層のCellSTACK | 6360センチメートル2 |
| 40層CellSTACK | 25440センチメートル2 |
表1。タンパク質発現のために使用される細胞培養容器の比較。
試薬レシピのリスト
100X Ciprofloxacineは、10 mlのソリューションでは、10mgのciprofloxacineに10ミリリットルの脱イオン水を追加します。完全にciprofloxacineを溶解するために10μlの6N塩酸を追加します。
PEIは、（1 mg / mL）は 100ミリリットルソリューションでは、80に脱イオン水と熱で25 kDaの線形PEIの100 mgを溶解℃に室温まで冷却ソリューションは、7.2にpHを調整し、滅菌0.22μmフィルター、-20℃でアリコートと凍結温度イオンのCグラムの長期保存。
8.0グラムのNaCl、0.2グラムのKCl、1.4グラムのNa 2 HPO 4（無水）、0.24グラムのKH 2 PO 4：1 L水溶液の1X PBS。 7.4に溶液のpHを調整し、1.0 Lに埋める
8.0グラムのNaCl、0.2グラムのKCl、1.4グラムのNa 2 HPO 4（無水）、0.24グラムのKH 2 PO 4、1ミリリットルのTween-20：1 L水溶液の1X PBS-Tween-20を 。 7.4に溶液のpHを調整し、1.0 Lに埋める
3.0グラムのトリス塩基、14.4グラムのグリシン、150 mLのメタノール：1 L水溶液1X転送バッファ 。
3.0グラムのトリス塩基、14.4グラムのグリシン、1.0グラムSDS：1X SDS-PAGEは、1リットルの水溶液は、 バッファを実行している 。
0.6グラムSDS、3 mlのグリセロール、1.8ミリリットル1.0のTris-HCl pH 6.8で、1 mgのブロモフェノールブルー、5％（v / v）の2 -メルカプトエタノール：10 ml溶液のサンプル緩衝液を還元SDS-PAGE。
- 37℃10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）、1Xペン/連鎖球菌を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）℃、5％CO 2の加湿雰囲気の中でC言語でHEK 293T細胞を成長させる。
- 倒立顕微鏡下で細胞を観察します。細胞がコンフルエントに100％であるとき、培地を除去し、廃棄します。
- 血清の痕跡を削除するには、滅菌1X PBS 5 mlで細胞を洗浄します。 PBS洗浄を破棄します。
- T225 cm 2のフラスコ（またはT75 cm 2のフラスコのために0.05％の1ミリリットル（w / v）のトリプシン-EDTA）に0.05％の2ミリリットル（w / v）のトリプシン-EDTA溶液を加えると、細胞が剥離するまで室温でインキュベート表面から。それはHEK 293T細胞を分離するために、滅菌1X PBS-EDTAを使用することも可能です。
- トリプシン反応を阻害するT225 cm 2のフラスコ（または10％DMEM 9mlの（v / v）のFBS T75 CMの2フラスコ）に10％（v / v）のFBSを含むDMEM 13 mlを加える。
- cを分割するells 1時05分。 T225 cm 2のフラスコには、新しい培養容器に1X pen / strepおよび10％（v / v）のFBSを新鮮なDMEM 27 mlに細胞懸濁液の3 mlを加える。 T75 cm 2のフラスコでは、新鮮な増殖培地8 mlに細胞懸濁液2 mlを追加します。 2加湿雰囲気、5％COで37℃で培養をインキュベートします。細胞は2日以内にコンフルエントに100％に成長する必要があります。
ボックス2。ウエスタンブロット分析
- 10μlのSDS-PAGE30μlの細胞培養上清をサンプルバッファーを減らすことを追加します。 1時間175 V、または分子量マーカーがうまく解決されるまでバッファを実行している1X SDS-PAGEを使用して、負荷サンプルとジウム分子量マーカーポリアクリルアミドゲル上にし、電気泳動させる。
- アクティブにするには1分間、100％メタノール中でPVDFイモビロン-Pメンブレンを浸します。
- ウェスタンブロット装置を組み立てる。 PVDF膜は正極に直面していることを確認し、1X転送バッファで濡れたすべてのコンポーネントを保持します。アヴォポリアクリルアミドゲルとメンブレンの間でIDの泡。
- 完全に100℃で1時間1X転送バッファと転送で電気室を埋めるV.
- 室温で1時間1X PBS-Tween20を5％（w / v）のスキムミルクで膜をブロックするか、または一晩4℃で
- 4℃、室温または一晩で1時間の5％に溶解したモノクローナル一次抗体（すなわち、1:1000希釈の抗HAモノクローナル抗体または他の適切な抗体）（w / v）の1X PBS-Tween20をでスキムミルク℃でインキュベート
- 10分間1X PBS-Tween20をで膜を洗浄します。 2余分な回繰り返します。
- 室温で1時間アルカリホスファターゼ（5％の1:1000希釈（w / v）の1X PBS-Tween20をでスキムミルク）と結合するモノクローナル二次抗体でインキュベートし、または一晩4℃で
- 10分間1X PBS-Tween20をで膜を洗浄します。 2余分な回繰り返します。
- 小さな容器に膜を置き、5ミリリットルアルカリホスファターゼsubstraを追加するTE（BCIP / NBT）ソリューションを提供します。カラー展開は1-5分以内に発生する必要があります。一度所望のバンド強度に達すると、脱イオン水と乾燥空気で洗浄する。カラーは、時間の経過とともに退色することができる。電子的に一度乾燥した膜をスキャンします。
ボックス3。細胞培養容器の清掃·リサイクル
セル工場はシングルユースになるように設計されていますが、これらの船舶は以下の洗浄プロトコルを使用して、追加の大規模なトランスフェクションのために再利用することができます。
- すぐに10層の細胞工場から上清をデカントした後、20％（v / v）の漂白剤を追加したり、セルを分離するために積極的に振る。 3時間室温でインキュベートします。
- 容器を空にして新鮮な20％（v / v）の漂白剤と室温で一晩インキュベートを追加します。
- 容器を空にし、脱イオン水1.5Lで洗浄する。を3回繰り返します。
- 10層の細胞の工場、空、10を添加した無菌の1X PBSを0.5 Lを追加するX抗生物質/抗真菌ソリューションを提供します。室温で容器を格納し、次の使用前にポート（標準の33ミリメートルのねじキャップ）を充填するためのベントキャップを交換してください。注：すべての層が洗浄後は完全に明確にする必要があり、そうでない場合、機関のガイドラインに従ってセルファクトリを使用し、処分しないでください。
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Discussion
10層の細胞の工場は、蛋白質のミリグラム量の生産のための効果的な容器です。このようなローラーボトル、振盪フラスコまたはスピナーフラスコのような他の伝統的な船、上のセルファクトリを使用する主な利点は、追加の実験装置を購入する必要がないということです。標準的なCO 2インキュベーター（〜6.0立方フィート）は、簡単に4つの10層の細胞工場（ 図2）を収容します。さらに、これらの血管は細胞やタンパク質を生成するためにディッシュ、フラスコ、ローラーボトルより少ない労働力やスペースを必要とします。1つの10層の細胞の工場は、7.5正規のローラーボトル（ 表1）の使用と同等です。さらに重要なことは、HEK 293T細胞は、血管内にうまく適応するため、市販のトランスフェクション試薬に低コストで効果的なオプションを提供し、PEIによる一過性トランスフェクションに非常に適している。セル工場は使い捨ての細胞培養プラスチック容器になるように設計されていますが、我々は、bを持っているしたがって、大幅に使用当たりのコストを削減し、汚染問題なく複数回これらの血管を効率的に清掃して再使用することができEEN。 10層のセルファクトリを使用して、一過性タンパク質発現は、生産〜、（ 図4）タンパク質を精製したタンパク質およびその変更に応じて1-10 mgをすることが可能です。これは、クローニングや小規模の式から約3-4週間での大規模発現と精製の完了へ行くことが出来ます。要約では、これが分泌されるヒトまたはウイルス表面タンパク質の生産に非常に有用である急速な、一般的なプラットフォームです。また、このプラットフォームはまた、遺伝子導入用の抗体、ウイルス様粒子、およびアデノウイルス及びレンチウイルスを表現するために使用することができます。
我々は、一般的な問題および潜在的な解決策の下に表示しています。詳細なトラブルシューティングガイドについては、14を参照してください。
- ないか、または非常に低いタンパク質の発現：
- 貧しいHマイコプラズマ汚染の可能性とテストのためにトリパンブルーを用いて細胞を染色細胞のealth。細胞は、高継数（> 25継代）を持ってゆっくりと成長している場合は、新しいHEK 293T細胞を用いた新鮮開始します。トランスフェクション効率とタンパク質の生産は、培養中の細胞の年齢の影響を受けています。
- 貧しい一過性トランスフェクション細胞は40％のコンフルエントレベルでトランスフェクトされるべきである。トランスフェクション試薬へのDNAの比が最適化する必要があります。
- タンパク質は、不溶性のタンパク質を細胞ペレットを折り返しチェックが不安定だったりではありません。他の構成要素または相同タンパク質の発現をテストします。
- いいえタンパク質がカラムから溶出されていません。
- 蛋白質は0.1 MグリシンpHは2.2でカラム溶出で、目的のタンパク質を保持し、ウェスタンブロットにより解析する。蛋白質が保持されている場合は、溶出のための合成HAペプチドの高い濃度を使用するか、または長期間にわたって37℃でカラムをインキュベートします。
- 抗HA Columnが破損している間、された列は、洗浄し、適切に保存された場合、複数回再利用することができ、カラムの効率が時間の経過とともに減少します。新しい抗HAカラムを使用しています。
- タンパク質は、プロテアーゼ阻害剤の劣化の追加や全体の精製プロセスの間に氷の上にタンパク質を保持します。
- タンパク質が不安定な場合は、列タンパク質が上に析出または集約されており、タンパク質の安定性を向上させるために別の構造体やバッファ条件（すなわちpHは、塩、添加剤など）を試してみてください。
- カラム-HA-タグへのバインドに失敗したタンパク質は、埋葬またはアクセスできない可能性があります。タンパク質が流れたり、洗濯されていないことを確認してください。
- 血清アルブミン汚染：
（BSA）ウシ血清アルブミン、抗HA樹脂に非特異的に結合して、HAペプチド溶出を汚染する可能性がある傾向があります。図。 4、BSAは〜60から65 kDaの見かけの分子量でコンパクトなバンドとして移行されます。このケースでは、1X PにTween-20を濃度を高めるBS-Tween20を0.2％（v / v）の洗浄と洗浄の量を増やします。また、BSA汚染は、サイズ排除、イオン交換クロマトグラフィーを用いて削除される可能性があります。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、JEL、およびHA、FCA、とJDCのトロントフェローシップの大学にオンタリオ州のHIV治療ネットワーク研究オペレーティング·グラント（ROG-G645）と保健研究の新しい奨励賞のカナダ研究所（MSH-113554）でサポートされていました。著者らは、細胞を提供するためのスクリップス研究所（カリフォルニア州ラホーヤ）、エボラウイルスGPの発現ベクターと一般的なアドバイスでマーニーフスコ、Dafnaアベルソン博士とエリカOllmannサファイアに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0x10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab')2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
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