Summary
이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.
Abstract
세균에서 재조합 단백질 발현, 일반적으로 E. 대장균은 단백질의 밀리그램 수량 표현을위한 가장 성공적인 전략이었습니다. 그러나, prokaryotic 호스트는 종종 박테리아 특히 공동 또는 사후 translational 수정의 부족으로 인해 인간, 바이러스성 또는 진핵세포 외국 macromolecule의 독성으로 인해 단백질, 단백질 폴딩 기계의 차이, 또는 표현에 따라 않습니다. 효모 (P.의 pastoris 혹은 S. cerevisiae의) 1,2, baculovirus에 감염된 곤충 (S. frugiperda 또는 T. NI) 셀 3, 체외 번역 시스템의 셀 - 무료를 기반으로 표현 시스템은 2,4가 성공적으로 사용되었습니다 포유 동물 단백질을 생산하고 있습니다. 직관적으로, 최고의 경기는 적절한 사후 translational 개조를 포함하는 재조합 단백질의 생산을 보장하기 위해 포유류의 호스트를 사용하는 것입니다. 포유 동물 세포 라인 (인간 배아 키즈의 숫자네이 (HEK) 293은 S V40 larget T-항원 (COS), 중국 햄스터 난소 (CHO), 그리고 다른 사람을 운반 O rigin에서 C V-1 세포)가 성공적으로 인간 단백질 개수 밀리그램 수량 overexpress 위해 활용되었습니다 5-9. 그러나 포유 동물 세포를 사용의 이점은 주로 안정적인 표현 세포 라인을 개발하기 위해 높은 비용, 전문 실험실 장비의 요구 사항, 낮은 단백질 수율, 그리고 긴 시간으로 반박하고 있습니다. 적은 비용을 유지하면서, 빠른 수율 및 생산 단백질의 증가, 많은 학술 및 상업 실험실을위한 주요 요소입니다.
여기서는 시간과 점착 성의 HEK 293T 세포에서 분비 인간 단백질의 표현을위한 비용 효율적인 두 부분으로 절차를 설명합니다. 이 시스템은 구조적 biophysical 및 생화 학적 연구를위한 기능성 단백질의 밀리그램 수량에 마이크로 그램 제작이 가능합니다. 첫 번째 부분은 관심있는 유전자의 여러 구조는 생산이다병렬 및 transiently 작은 규모의 점착 성의 HEK 293T 세포로 transfected에서 D. 세포 배양 배지로 분비 재조합 단백질의 검출 및 분석은 벡터 인코딩된 단백질 정제 태그 향한 상용화된 항체를 사용하여 서양 얼룩 분석에 의해 수행됩니다. 그 후, 대규모 단백질 생산에 적합한 구조는 transiently 10 층 전지 공장에서 polyethyleneimine (PEI)를 사용 transfected 있습니다. 에어컨 매체의 리터 - 볼륨으로 분비 단백질은 안티 - HA 친화성 크로마 토그래피에 의해 정제 다음에 접선 유동 여과를 사용하여 관리 가능한 금액으로 집중되고있다. 이 플랫폼의 유틸리티는 크린 시토킨, 시토킨 수용체, 세포 표면 수용체, 본질적인 제한 요인과 바이러스 glycoproteins의 밀리그램 수량을 표현하는 기능에 의해 입증된다. 이 방법은 또한 성공적으로 trimeric ebolavirus의 당단백질의 5,10의 구조 결정에 사용되었다.
2 배양기 이외의 추가적인 장비는, 필요하지 않습니다. 이 절차는 신속하게 이러한 단백질 단지, 항원과 항체, 백신 생산을위한 바이러스 같은 입자, 또는 어려운 셀 라인 도입에 대해 adenoviruses 또는 lentiviruses 생산의 공동 표현과 같은 큰 복잡한 체제를 지원하기 위해 확장할 수 있습니다.
Protocol
1. 준비 작업 - 구조 및 세포 배양
프로토콜을 시작하기 전에, 관심있는 유전자는 포유 동물 세포의 표현을 위해 코돈 - 최적화 및 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 적절한 발현 벡터에 복제해야합니다. 성공적인 표현을위한 최고의 기회를 보장하기 위해, 관심있는 유전자의 여러 변종이 생성되어야합니다. 많은 포유류의 표현 벡터 상용 가능하며 다양한 정화 태그 (polyhistidine, 적혈구응집소, streptavidin, 할로 - 태그, 글루타티온 S-transferase, 다른 중에서) 있습니다. 우리는 강한 인간 사이토 메갈로 바이러스 프로 모터, IG κ 분비 신호, 적혈구응집소 정화 태그를 인코딩합니다 pDISPLAY 벡터를 사용하는 것을 선호하고, 플라즈마 막에 표시 분비 경로를 통해 단백질을 타겟으로하는 C-말단 transmembrane 앵커가 있습니다. 우리는 일반적으로 벡터로 인코딩된 transmembrane ancho 앞에 정지 코돈을 삽입R은 단백질이 갖추어진 매체로 분비 수 있도록합니다.
인간의 배아 신장 (HEK) 293T 세포가 광범위하게 사용할 수 있고 쉽게 배양해와 transfected. HEK 293T 제품은 정기적으로 포유 동물 단백질의 표현을 위해 사용되지만, biohazardous 간주되어 biosafety 레벨 2에서 다루어 져야합니다. 적절한 개인 보호복을 착용하십시오; 작품은 무균 기술을 사용하여 승인된 biosafety 캐비닛에서 수행해야합니다. 모든 폐기물 및 표면 기관 및 정부 지침에 따라 소독하여야한다. 그것은 세포를 사용하기 전에 mycoplasma 오염 물질에 대한 검사를하는 것이 좋습니다. 세포는 mycoplasma SPP의 어떤 소스를 근절하기 위해 열흘 동안 * 시프 로플 록 사신 (10 μg / ml) 쇼핑으로 치료할 수 있습니다. 오염. HEK 293T 세포를 전파하기 위해 일반 프로토콜 (박스 1) 별도로 제공됩니다.
시험과 대규모 단백질 표현을위한 추가 고려 사항 reviewe 있습니다11-15에서 D.
2. 소규모 테스트 표현
일단 구조가 설계되었으며 생성, 소규모의 테스트 transfections는 HEK 293T 세포를 사용하여 수행할 수 있으며, 과정을 요약 배선도는 (그림 1) 아래에 제공됩니다.
- HEK 293T 세포 성장과 세포가 100 %의 지류 (박스 1) 때마다 2~3일 세포를 분할 T75 cm 2 또는 T225 cm 2 세포 배양 flasks을 (수행되어야하는 테스트 표현의 수에 따라)를 사용합니다.
- 종자 2.5 6 잘 판에 잘마다 X 10 5 HEK 293T 세포 1X 펜 / strep와 10 % (V / V) : 2 개 ML DMEM을 추가 FBS, 소용돌이 모양의 접시는 가볍게 서로 잘 심지어 세포 분산을 보장하고,하기 5 % CO 2 humidified 챔버에서 37 ° C에서 밤새 품어.
- HEK 293T 세포 40 % confluency 도달하면 미디어를 버리고 FBS 우물에 1X 펜 / strep와 10 % (V / V)로 신선이 ML DMEM를 추가합니다. 수행transfection의 assays.
- 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 90 μl 혈청이없는 DMEM합니다. 피펫 3 μl 혈청이없는 DMEM으로 GeneJuice하고 부드럽게 튜브 (손가락 소용돌이)를 섞는다. 상온에서 5 분 품어.
- 플라스미드 DNA (유전자 재고가 = 100 NG / μl) DMEM-GeneJuice 혼합물, 손가락 소용돌이, 그리고 실온에서 15 분 동안 품어으로 투석을 MiniPrep 1 μg을 추가합니다.
- 부드럽게 transfection 혼합물이라도 배포를 허용하도록 transfection 혼합물의 HEK 293T 세포를 향해 dropwise, 그리고 소용돌이 6 잘 접시를 피펫. 5 % CO 2 humidified 챔버에서 37 ° C에서 6 잘 접시를 품어.
- 각도 24 시간 1X 펜 / strep 1 개 ML 신선한 DMEM와 10 % (V / V) FBS 추가 다른 48 시간 후 transfection과 부화 (총 72시간).
- 상온에서 10 분 16,000g 세 일 후 transfection하고 microcentrifuge 샘플 각 우물에서 뜨는의 수확 1 ML. 웨스을 수행박스 2의 상세한 등 제비 갈매기 얼룩 분석. 샘플은 4 ° C.에 저장될 수 4에 스토리지의 길이 ° C는 단백질에 따라 달라지게된다.
3. 대규모 테스트 표현과 정제
구조가 확인되면 재조합 단백질의 밀리그램 수량 표현 10 레이어 전지 공장 (; 6,360cm이 표면적 그림 2)을 사용하여 자기편 HEK 293T 세포의 PEI의 transfection에 의해 이루어진다. 자세한 답사의 연구 내용은 작은 셀 공장이나 T-flasks (표 1) 사용할 수 있습니다.
- MaxiPrep 플라스미드 정제 키트를 사용하여 transfection을위한 DNA의 1 밀리그램을 정화. XL-1 블루 세포의 500 ML 야간 문화가 순수한 DNA의 최소 1 밀리그램을 생산한다. 260 / 280의 비율을 측정하여 DNA의 순도를 확인합니다; 1.8 이상이어야합니다.
- 2.0 X 10 8 셀로 HEK 293T 세포를 잡고. 각 T225 cm 2 술병이 100 % confluency 공동으로 성장ntains하고 ~ 2.25 X 10 7 세포의 평균.
- 10 층 전지 공장에 5 % (V / V) FBS와 1.2 L DMEM을 추가합니다. 세포 공장에 2.0 X 10 8 HEK 293T 세포를 추가하고 선박의 모든 계층에 골고루 세포를 배포합니다. 그것은 세포 공장에서 세포의 confluency을 시각화하는 것은 매우 어렵습니다. 대안으로서, 10 층 선박과 수행으로 표면적 비율에 동일한 휴대폰 번호를 사용하여 세포의 적절한 숫자로 T75 cm 두 플라스크를 설정합니다. 성장률이 플라스크를 모니터링합니다. 셀 공장을 취급에 관한 교육을위한 관련 동영상을 참조하십시오. 세포 부착과 성장을 가능하도록하기 위해서 5 % CO 2 ° C ~ 37시 야간 알을 품다.
- 자기편 HEK 293T 세포의 70 % 합류 때 대규모 transfection을 수행합니다. 멸균 T75 cm 두 플라스크를 사용하여 biosafety 캐비닛에 PEI-DNA를 transfection 혼합물 (DNA의 비율 3시 1분 w / W PEI)를 준비합니다. 멸균 1X PBS의 84 ML과 함께 DNA의 0.84 MG를 혼용 후 PEI (2 2.5 ML을 추가합니다.5 MG 총 PEI). 15 분 동안 상온에서 품어. Solution은 흐리다한다.
- 세포 공장으로 천천히 PEI-DNA를 transfection 혼합물을 붓고 철저히 선박의 모든 레이어를 통해 배포할 수 있습니다. 선택 사항 : 증가 발현 수율을 위해, valproic 산성 (4 MM 최종 농도)를 추가합니다. 나흘 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 품어.
- 하베스트 뜨는 사일 후 transfection. 4에서 30 분간 6,000 X g에서 에어컨 미디어를 원심 ° C. 또한 0.22 μm의 Stericup 진공 필터 장치를 사용하여 표면에 뜨는을 필터링합니다. 10 층 전지 공장을 재사 용할 수있는 지침을 청소 박스 3을 참조하십시오. 그것은 청소가 뜨는 수확 직후 시작되는 핵심이며 선박 표면 세포가 건조하지 않습니다.
- Centramate 접선 유동 여과 시스템을 사용하여 75 ML에 뜨는을 집중해라.
- PBS 500 ML을 추가하며 75 ML에 다시 집중. 세 addit를 반복완전 버퍼에 ional 시간은 샘플을 교환할.
- 1X PBS로 1 ML 안티 HA 친화성 컬럼을 평형과 속도 중력 흐름 <1 ML / 분으로 농축 샘플을 적용합니다.
- 1X PBS-Tween20 30 ML과 칼럼을 씻으십시오.
- 1X PBS (1.0 밀리그램 / ML)의 HA 펩타이드를 해산 37에 품어 ° C.
- 안티 - 하 열로 HA의 펩타이드 1 ML을 적용하고 펩타이드가 수지로 흐를 수 있습니다. 을 통해 흐름을 수집합니다. 펩타이드 솔루션은 침대 높이에 도달 흐름을 중지합니다.
- 15 분 동안 37 ° C에서 전체 안티 HA 열을 품어.
- 12 두 개의 추가 번 단계를 반복합니다.
- 그것이 침대의 높이에 도달할 때까지 반 HA 열 및 수지에 흐름에 1X PBS 1 ML을 적용합니다. 을 통해 흐름을 수집합니다.
- 10 ML 0.1 M 글리신의 산도 2.2과 안티 HA 컬럼을 다시 생성. 0.02 % (W / V)와 PBS에서 ° C ~ 난이 3 4 10 ML PBS 및 매장 친화성 컬럼으로 씻는다.
- SDS-PAGE 분석과 수영장 f를 수행그에 따라 ractions. 참고 : HA의 펩타이드는 280 또는 브래드 포드에 의해 단백질 농도 측정에 방해가됩니다. 표준으로 SDS-PAGE 젤로 단백질 존재의 양을, 부하 5, 10, 15, BSA의 25 μg을 계산하고 밴드 농도를 비교합니다.
절차 9-17는 에어컨 매체에서 추가 단백질을 캡처하는 반복 수 있습니다.
4. 대표 결과
이 문서에서는 설명하고 이후 구조 및 기능 연구에 사용할 수있는 인간의 단백질 밀리그램 - 수량 생산을위한 편리한 표현 플랫폼을 보여줍니다. 인간 단백질의 심사 6 - 웰 플레이트에 HEK 293T 세포를 사용하여 구조하는 것은 효율적이고 큰 규모의 생산 의무가 구조를 식별하는 데 효과적입니다. 상업 발현 벡터는 같은 GeneJuice, FuGene HD 또는 체육 등 transfection 시약의 다양한 사용하여 HEK 293T 세포에 효율적으로 transfected 수 I. 우리는 이들 시약은 가난한 표현 단백질 (그림 3)에 대한 더 효과적으로 테스트 표현에 대해, 그러한 GeneJuice 또는 FuGene HD로 상용 transfection 시약의 사용을 권장합니다. 큰 규모 표현하기 위해 선택한 구성 요소가 서양의 얼룩 (그림 3)에 대한 적절한 분자량에 해당하는, 하나의 강한 강도 대역을 특징으로한다. Glycoproteins는 글리코 실화의 이질로 인한 광범위한 밴드로 마이그레이션할 수 있습니다. 우리는 바이러스성 glycoproteins, 크린 시토킨, 시토킨 수용체 및 기타 표면 단백질에서부터 macromolecules 다양한는, 표현이 일반적인 표현 플랫폼을 이용하여 단백질의 millgram 수량 (그림 4) 양보하는 정화 수있는 것으로 나타났습니다.
그림 1. 소규모 transfections의 워크플로우 개략도.tp_upload/4041/4041fig1large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 큰 규모로 단백질 발현을위한 코닝 10 층 CellSTACK 있습니다. 각 레이어 셀 첨부 파일 636cm 2 표면적이 포함되어 있습니다. 표준 실험실 CO 2 배양기 (6.0 세제곱. 피트)은 편안하게 네 10 층 전지 공장을 보유합니다.
.. 그림 3 다양한 분비 단백질의 소규모의 표현은 우리가 일반적인 transfection의 시약을 사용하여 소규모의 테스트 표현하는 일련의 수행 :. GeneJuice, FuGene HD 및 PEI를 선택한 사람 세포 단백질의 () 서양 얼룩 심사 (tetherin), 수용체 (IL-2R의 β subunit)과 크린 시토킨 (IL-2). Tetherin가의 석방을 제한하는 인간 막 당단백질입니다초기 HIV-1 virions 16. tetherin의 세포외 도메인은 ~ 36 kDa의 glycosylated, 체인이 황을 통해 연결된 이량체로 존재합니다. 여기에 그림과 같이 조건을 감소에서 tetherin는 ~ 22 kDa의 겉보기 분자량과 단량체로 마이 그 레이션합니다. 인터루킨 -2 (IL-2) 림프구 증식 17에 관여 시토킨 (~ 17 kDa)입니다. 그것은 IL-2R βsubunit합니다 (~ 26 kDa) 구성 요소 18 중, IL-2 수용체 복잡한와 상호 작용합니다. CD21는 보완 시스템에 의해 활성화 및 성숙 B-세포에 관련된 멤브레인 단백질이며, 또한 엡스타인 - 바 바이러스에 대한 수용체이다. CD21의 glycosylated 세포외 도메인 ~ 20 kDa의 겉보기 분자량과 단량체로 마이 그 레이션합니다. 선택된 표면 바이러스성 glycoproteins (XMRV 유럽 표준안 및 ebolavirus GP)의 (B) 서양 얼룩 검사도. XMRV 및 ebolavirus의 glycoproteins (transmembrane 앵커는 삭제) trimeric 스파이크와 같은 바이러스 세포막에 존재하고 숙주 세포 부착에 관여하고그리고 융합. XMRV 유럽 표준안과 EBOV GP의 ectodomain는 크게 N-연결된 glycans으로 장식하고 각각 70 kDa과 75 kDa의 명백한 분자 무게로 마이 그 레이션됩니다.
4 그림. 대규모 HEK 293T 문화에서 인간의 세포 단백질 정화. 모든 단백질은 10 층 전지 공장을 이용하여 표현하고, 집중 및 안티 HA 크로마 토그래피에 의해 정화되었다. 마찬가지로 Coomassie 묻은 SDS-PAGE 분석으로 표시된 인터루킨-2 수용체의 세포외 도메인 (IL-2R)은 α와 γ subunits는 각각 40 kDa과 46 kDa의 분자 무게로 마이 그 레이션. tetherin의 세포외 도메인은 36 kDa의 겉보기 분자량으로 비 감소 상황에서, 이합체로 마이 그 레이션합니다. 60 kDa의 겉보기 분자량에 나타나는 몇 가지 BSA 오염이 있습니다. 또한, N-연결된 glycans의 이질은 tetherin에 존재IL-2R α와 IL-2R γ 원인 밴드는 SDS-PAGE 젤을 확대. 이러한 복합 형 N-연결된 glycans는 펩타이드를 사용하여 제거할 수 있습니다 : N-glycosidase F.
| 용기 | 표면적 |
| 6 - 잘 플레이트 | 9.5 cm 2 (각도) |
| 100mm 요리 | 55cm이 |
| 245mm 요리 | 500cm 2 |
| T75 cm 두 플라스크 | 75cm이 |
| T175 cm 두 플라스크 | 175cm 2 |
| T225 cm 두 플라스크 | 225cm 2 |
| 롤러 병 - 정규 | 850cm 2 |
| 롤러 병 - 확장된 표면 | 1700 cm 2 |
| 1 층 CellSTACK | 636cm 2 |
| 2 층 CellSTACK | 1,272cm이 |
| 5 층 CellSTACK | 3천1백80센티미터이 |
| 10 층 CellSTACK | 6,360cm이 |
| 40 층 CellSTACK | 25,440cm이 |
표 1. 단백질 표현에 사용되는 세포 배양 혈관의 비교.
시약 요리법 목록
100X Ciprofloxacine 10 ML 솔루션의 경우, 10 MG의 ciprofloxacine에 10 ML 탈이온수를 추가합니다. 완전히 ciprofloxacine를 해산하는 데 10 μl 6N HCL을 추가합니다.
PEI (1 밀리그램 / ML) 100 ML 솔루션의 경우 80 탈이온수와 열 25 kDa 선형 PEI의 100 밀리그램을 용해 ° C. 실온에 시원한 해결책은, -20에서 7.2, 소독 0.22 μm의 필터 나누어지는 및 동결로 산도를 조정 ° 경도를위한 CG-장기 보관.
8.0 g NaCl 0.2 g KCl, 1.4 g 나 2 HPO 4 (무수), 0.24 g KH 2 PO 4 : 1 패 수용액에 대한 1X PBS. 7.4에 솔루션의 산도를 조정 및 1.0 L.로 채우기
8.0 g NaCl 0.2 g KCl, 1.4 g 나 2 HPO 4 (무수), 0.24 g KH 2 PO 4, ML 십대 초반-20 : 1 패 수용액의 경우 1X PBS-십대 초반 - 20. 7.4에 솔루션의 산도를 조정 및 1.0 L.로 채우기
3.0 g 트리스베이스, 14.4 g 글리신, 150 ML의 메탄올 : 1 패 수용액에 대한 1X 전송 버퍼.
3.0 g 트리스베이스, 14.4 g 글리신, 1.0 g SDS : 1X SDS-PAGE 1 패 수용액의 경우 버퍼를 실행.
0.6 g SDS, 3 ML의 글리세롤, 1.8 ML 1.0 트리스-HCL pH는 6.8, 1 밀리그램 bromophenol 파란색, 5 % (V / V) 2 - 메르 캅 토 에탄올 : SDS-PAGE는 10 ML 솔루션에 대한 샘플 버퍼를 줄여.
- 2 humidified 분위기 5 % CO에서 37 ° C에서 10 % (V / V) 태아 소 혈청 (FBS), 1X 펜 / strep과 보완 Dulbecco의 수정일 이글 배지 (DMEM)에 HEK 293T 세포를 성장.
- 거꾸로 현미경으로 세포를 관찰. 세포가 100 % confluency에있는 경우 제거하고 배지를 버리고.
- 혈청 성분을 제거하는 살균 1X PBS의 5 ML로 세포를 씻어. PBS 세척 폐기하십시오.
- 0.05 %의 2 ML (W / V) T225 cm 두 플라스크 (또는 T75 cm 두 플라스크에 대해 0.05 %의 1 ML (W / V) 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가하고 세포를 분리 때까지 상온에서 부화 표면에서. 그것은 HEK 293T 세포를 분리하기 위해 무균 1X PBS-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하는 것도 가능합니다.
- 트립신 반응을 억제하는 T225 cm 두 플라스크 (또는 10 %를 DMEM 9 ML (V / V) FBS T75 cm 2 플라스크)로 10 % (V / V) FBS으로 DMEM 13 ML을 추가합니다.
- C를 분할ells 1시 5분. T225 cm 두 플라스크 들어, 새로운 문화 선박에 1X 펜 / strep와 10 % (V / V) FBS와 신선한 DMEM의 27 ML에 세포 현탁액 3 ML을 추가합니다. T75 cm 두 플라스크의 경우 신선한 성장 매체의 8 ML에 세포 현탁액의 2 ML을 추가합니다. 2 humidified 분위기 5 % CO에서 37 ° C에서 문화를 품다. 세포는 두 일 이내 confluency 100 %로 성장한다.
박스 2. 서양 얼룩 분석
- 10 μl SDS-PAGE 감소 샘플 버퍼 뜨는 30 μl 세포 배양에 추가합니다. 로드 샘플과 1 시간 동안 175 V에서 또는 분자량 마커까지 1X SDS-PAGE 실행 버퍼를 사용하여 polyacrylamide의 젤, 그리고 electrophorese 진입 prestained 분자량 마커가 잘 해결되었습니다.
- 일분 활성화를 위해 100 % 메탄올로 PVDF Immobilon-P 막을 만끽해보세요.
- 서양 얼룩 장치를 조립. PVDF 막가 긍정적인 전극에 접해 확인하고 1X 전송 버퍼와 젖은 모든 구성 요소를 유지. Avopolyacrylamide 겔와 멤브레인 사이에 아이디 거품.
- 완전히 100에서 1 시간 동안 1X 전송 버퍼와 전송로 전기 영동 챔버를 채우는 V.
- 상온에서 1 시간 1X PBS-Tween20의 5 % (W / V) 탈지 우유와 멤브레인를 차단하거나, 하룻밤 4에 ° C.
- 4에서 한 상온에서 시간 또는 하룻밤 동안 1X PBS-Tween20에 탈지 우유 5퍼센트 (W / V)에 녹아있는 단클론 항체 일차 (예 : 1:1000 희석 방지 HA mAb 또는 다른 적절한 항체) ° C.로 품어
- 10 분 1X PBS-Tween20의 세포막을 씻으십시오. 이 여분의 시간을 반복합니다.
- 상온에서 1 시간 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (5 %에서 1:1000 희석 (W / V) 1X PBS-Tween20의 탈지 우유)와 복합 단클론 이차 항체로 품어, 또는 하룻밤 4에 ° C.
- 10 분 1X PBS-Tween20의 세포막을 씻으십시오. 이 여분의 시간을 반복합니다.
- 작은 용기에 멤브레인를 놓고, 5 ML 알칼리성 인산 가수 분해 효소 substra 추가테 (BCIP / NBT) 솔루션입니다. 컬러 개발 1~5분 이내에 발생한다. 일단 원하는 밴드 강도에 도달, 탈이온수 건조 공기 씻는다. 색상은 시간이 지남에 사라질 수 있으며, 전자 번은 드라이 세포막을 검사합니다.
박스 3. 세포 배양 혈관을 청소 및 재활용
전지 공장은 단일 사용되도록 설계되어 있지만,이 선박은 다음 청소 프로토콜을 사용하여 추가적인 대규모 transfections 위해 재활 용할 수 있습니다 :
- 바로 10 층 전지 공장에서 뜨는을 decanting 후, 20 % (V / V) 표백제를 추가하고 세포를 분리하기 위해 적극적으로 악수. 세 시간 동안 실온에서 품어.
- 혈관을 비우 신선한 20% (V / V) 표백제와 하룻밤 실온에서 부화를 추가합니다.
- 혈관을 비우 및 탈이온수 1.5 L로 씻는다. 세 번 반복합니다.
- 10 층 전지 공장을 비울 및 멸균 1X PBS 0.5 L을 추가 10과 보충X 항생제 / Antimycotic 솔루션입니다. 실온에서 혈관을 저장하고 다음 사용 이전 포트 (표준 33mm 나사 뚜껑)을 작성을위한 방출 모자를 교체하십시오. 참고 : 모든 레이어가 청소 후 완전히 명확해야 없으면, 제도적 지침에 따라 전지 공장을 사용하고 폐기하지 않습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
10 층 전지 공장 단백질 밀리그램 양의 생산을위한 효과적인 선박입니다. 이러한 롤러 병, 흔들 flasks 또는 회전자 flasks 같은 다른 전통적인 혈관, 이상 세포 공장 사용의 가장 큰 장점은 추가적인 실험실 장비의 구입을 요구하지 않는다는 것입니다. 표준 CO 2 배양기는 (~ 6.0 세제곱. 피트) 쉽게 사 10 층 전지 공장 (그림 2)를 수용합니다. 또한, 이러한 혈관 요리 flasks 또는 세포와 단백질을 생산하기 위해 롤러 병보다 적은 노동과 공간을 필요로, 한 100 레이어 전지 공장은 7.5 일반 롤러 병 (표 1)를 사용하는 것과 동일합니다. 더 중요한 건, HEK 293T 세포는 혈관에 잘 적응하기 때문에 상업적인 transfection의 시약으로 적은 비용과 효과적인 옵션을 제공 PEI에 의한 일시적인 transfection에 매우 의무가 있습니다. 전지 공장은 일회용 세포 배양 plasticware되도록 설계하고 있지만, 우리는 B를 가지고효율적으로 사용함으로써 현저하게마다 비용을 줄이고, 오염 문제없이 여러 번 청소하고 이러한 선박에게 다시 사용할 수있게 18 이요. 10 층 전지 공장을 사용하여 과도 단백질 표현이 생산 ~, (그림 4) 단백질을 정제 단백질과 수정에 따라 1-10 밀리그램을 수있을 것입니다. 그것은 복제와 소규모의 표현에서 약 3~4주의 대규모 표현과 정화 완료에 갈 수 있습니다. 요약하면,이 분비 인간이나 바이러스 표면 단백질의 생산에 매우 유용 급속한, 일반 플랫폼입니다. 또한,이 플랫폼은 또한 항체, 바이러스 같은 입자와 adenoviruses 및 유전자 전달을위한 lentiviruses을 표현하는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 일반적인 문제 및 잠재적인 솔루션 아래에 나열했습니다. 더 자세한 문제 해결 가이드의 경우, 14 페이지를 참조하십시오.
- 없음 또는 매우 낮은 단백질 발현 :
- 불쌍한 Hmycoplasma 오염에 대한 생존 및 테스트를 위해 trypan 파랑을 사용하여 세포 - 청바지의 세포 ealth. 세포가 높은 통과 번호 (> 25 구절)이 천천히 성장하고있다면, 새로운 HEK 293T 세포 신선한 시작합니다. Transfection 효율과 단백질 생산 문화에 세포의 나이에 의해 영향을받습니다.
- 나쁨 과도 transfection-세포는 40 % confluency 수준으로 transfected해야합니다. transfection 시약에 DNA의 비율을 최적화해야합니다.
- 단백질은 불용성 단백질에 대한 세포 펠렛을 접으면 - 체크 불안정하거나하지 않습니다. 다른 구조 또는 동종 단백질의 표현을 테스트합니다.
- 어떤 단백질은 칼럼에서 eluted하지 않습니다 :
- 단백질은 0.1 M 글리 산도를 2.2로 열 Elute에 관심 단백질을 보유하고 서부 얼룩으로 분석합니다. 단백질이 유지되는 경우 용출을위한 합성 HA의 펩타이드의 높은 농도를 사용하거나 긴 기간 동안 37 ° C에서 열을 품어.
- 안티 HA합니다칼럼, 청소하고 적절하게 보관하면 여러 번 재사 용할 수 olumn는 있지만 손상 -, 컬럼의 효율은 시간이지나면서 줄어 듭니다있다. 새로운 안티 HA 컬럼을 사용합니다.
- 단백질은 단백 분해 효소 억제제를 저하 - 추가하고 전체 정제 과정에서 얼음 단백질 보관하십시오.
- 단백질은 계속 시켰던 또는 집계했다 열 경우 단백질이 불안정, 단백질의 안정성을 향상시키기 위해 다른 구성 요소 또는 버퍼 조건 (ie. 산도, 소금, 첨가제 등)을보십시오.
- 단백질은 열에-HA-태그가 묻힌하거나 액세스할 수에 바인딩하지 못했습니다. 을 통해 단백질이 흐름에없는 것을보고 씻어 확인하십시오.
- 혈청 알부민 오염 :
알부민 혈청 소는 (BSA) 안티 - HA 수지에 비 구체적으로 바인딩하고 HA 펩티드 elutions를 오염시킬 수 있습니다 경향이있다. 그림에서. 4, BSA는 ~ 60-65 kDa의 겉보기 분자량의 컴팩트 밴드로 마이 그 레이션합니다. 이 경우, 1X P에서 십대 초반-20 농도를 증가BS-Tween20은 0.2 % (V / V)에 세척과 세척의 볼륨을 증가시킵니다. 또는 BSA 오염은 크기 배제하거나 이온 교환 크로마 토그래피를 사용하여 제거할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 HA, FCA, 그리고 JDC에 온타리오 에이즈 치료 네트워크 연구 운영 그랜트 (로저-G645) 및 보건 연구 새로운 탐정 수상 (MSH-113554)의 캐나다 연구소 JEL까지, 토론토 장학금의 대학에 의해 지원되었다. 저자 제공 세포, ebolavirus GP의 발현 벡터 및 일반 조언 스크립스 연구소 (라 Jolla, CA)에서 마니 Fusco, Dafna 아벨 박사 에리카 Ollmann Saphire 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0x10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab')2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
