Summary
Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.
Abstract
Bakterilerde rekombinant protein ekspresyonu, tipik E. coli, proteinlerin miligram miktarı ifadesi için en başarılı bir strateji olmuştur. Bununla birlikte, çoğu zaman prokaryotik hosts bakteriler, özellikle co-veya post-translasyon modifikasyonların eksikliğinden kaynaklanan, insan, viral veya ökaryotik yabancı makromolekülün toksisite bağlı proteinler, protein katlama makine farklılıklar, ya da ifade için uygun değildir. Maya (P. pastoris ya S. cerevisiae), 1,2,-bakülovirüs bulaştırılmış böcek (S. frugiperda veya T. ni) hücreler 3, in vitro ve in sistemleri için hücre içermeyen temel ekspresyon sistemleri 2,4 başarıyla için kullanılmıştır memeli proteinleri üretmek. Muhtemelen iyi eşleşme post-translasyon uygun değişiklikler içeren rekombinant proteinlerin üretimini sağlamak için bir memeli konak kullanmaktır. Memeli hücre çizgileri (insan embriyonik Çocuk bir diziney (HEK) 293, S V40 larget T-antijen (COS), Çin Hamsteri Över (CHO), ve diğerleri taşıyan O rigin C V-1 hücreleri) başarılı bir şekilde insan proteinleri bir dizi miligram miktarlarda olarak artmış için kullanılmıştır 5-9. Ancak, memeli hücrelerinde kullanmanın avantajları genellikle istikrarlı ifade hücre hatları geliştirmek için yüksek maliyetleri, özel laboratuvar ekipman ihtiyacı, düşük protein verimi ve uzun zamanlar göre karşılık. Maliyetleri düşük tutarken, daha hızlı verim ve üretim protein artırılması, pek çok akademik ve ticari laboratuarlar için önemli faktörlerdir.
Burada, bir zaman ve yapışık HEK 293T hücrelerinden salgılanan insan proteinlerinin ifadesi için maliyet-etkin, iki bölümlü bir prosedür tanımlamaktır. Bu sistem, yapısal biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalar için işlevsel proteinin miligram miktarda mikrogram üretme kapasitesine sahiptir. İlk bölümde, ilgi genin birden yapıları üretmek vardırparalel ve geçici olarak küçük ölçekli yapışık HEK 293T hücrelerine transfekte d. Hücre kültürü aracı maddesine salgılandı rekombinant protein saptama ve analiz Bir vektör olarak kodlanmış proteine karşı yöneltilmiş saflaştırma etiketi ticari olarak mevcut antikorlar kullanılarak Western blot analizi ile gerçekleştirilir. Daha sonra, büyük ölçekli bir protein üretime uygun yapıları geçici 10-tabaka hücre fabrikalarda polietilenimin (PEI) ile transfekte edilir. Şartlandırılmış orta litrelik-hacim içine salgılanan proteinler, anti-HA afinite kromatografisi ile saflaştırma, ardından teğet akış filtrasyonu kullanılarak kontrol edilebilir miktarlar halinde konsantre edilmiştir. Bu platformun programı sitokinler, sitokin reseptörleri, hücre yüzey reseptörleri, içsel kısıtlama faktörler ve viral glikoproteinler miligram miktarlarda ifade yeteneğini kanıtladı. Bu yöntem de başarılı bir şekilde trimeric ebolavirus glikoprotein 5,10 yapısal tayini kullanılmıştır.
CO2 inkübatöründe haricinde hiçbir ilave ekipman, gereklidir. Bu prosedür, hızlı protein kompleksleri, antijenler ve antikorlar, aşılar için üretim virüse benzer parçacıklar, ya da zor bir hücre hatları transdüksiyonu için adenovirüsler ya Lentivirüs üretimi müşterek ifadesinden olarak daha büyük bir karmaşıklık sistemleri için genişletilebilir.
Protocol
1. Hazırlık Çalışması - Oluşumlar ve Hücre Kültürleri
Protokolü başlamadan önce, ilgi genindeki memeli hücrelerinde ifadesi için kodon optimize edilmiş, ve standart moleküler biyoloji teknikleriyle uygun bir ifade vektörünün içine klonlandı olmalıdır. Başarılı ifadesi için yüksek şansı sağlamak amacıyla, ilgi genindeki çeşitli türevleri elde edilmelidir. Birçok memeli ifade vektörleri, ticari olarak mevcuttur ve çeşitli saflaştırma etiketler (polyhistidine, hemaglutinin, streptavidin, halo-Tag, glutation S-transferaz, diğerleri arasında) sahiptir. Biz güçlü bir insan sitomegalovirüs organizatörü, bir Ig κ salgılanması sinyali, hemaglutinin arıtma etiketi için kodlar pDISPLAY vektör, kullanmayı tercih ve plazma membran gösterim için salgı yolağı üzerinden proteini hedef için bir C-terminal transmembran çapa sahiptir. Biz genellikle vektör-kodlanmış transmembran ancho önünde bir stop kodonu eklemekr proteini şartlandırılmış ortama salgılanan izin vermek için.
İnsan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücrelerinde yaygın olarak kullanılabilir ve kolayca kültüre ve transfekte. HEK 293T rutin memeli proteinleri ifade için kullanılır, ancak biyolojik tehlikeli olarak kabul edilir ve biyogüvenlik düzeyi 2 de ele alınmalıdır. Uygun kişisel koruyucu giysi Lütfen, çalışma aseptik teknik kullanarak onaylı bir biyogüvenlik kabini yapılmalıdır. Tüm atık ve yüzeyler kurumsal ve toplum kurallarına uygun olarak dezenfekte edilmelidir. Bu hücreler kullanmadan önce mycoplasma kontaminasyon için test edilmesi önerilir. Hücreler Mycoplasma spp herhangi bir kaynaktan ortadan kaldırmak için on gün süreyle siprofloksasin (10 ug / ml) ile muamele edilebilir. kontaminasyon. HEK 293T hücrelerin yayılmasına Genel protokolleri (Kutu 1) ayrı ayrı sunulmuştur.
Test-ve büyük-ölçekli protein ifadesi için ek konuları reviewe vardır11-15 d.
2. Küçük ölçekli Testi İfade
Bir kez yapılar tasarlanmış ve üretilmiş, küçük ölçekli test transfeksiyonlar HEK 293T hücreleri kullanılarak yapılabilir; süreci özetleyen bir şema (Şekil 1) aşağıda sunulmuştur.
- HEK 293T hücrelerin büyümesine ve hücrelerin% 100 konfluent (Kutu 1) olduğunda her 2-3 günde bir hücrelerin bölünmesini T75 cm 2 veya T225 cm 2 hücre kültürü şişeleri (yapılacak testi ifadelerin sayısına bağlı olarak) kullanın.
- Tohum 2,5, 6-kuyucuklu plak in oyuk başına 5 x 10 HEK 293T hücreleri ve 1X kalem / Strep ve% 10 (v / v) ile 2 ml DMEM ilave FBS, girdap plakası yavaşça her oyuğa bile hücre dağılma sağlamak, ve % 5 CO2 nemlendirilmiş odacık içinde 37 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.
- HEK 293T hücrelerin% 40 konfluense ulaştığınızda, medya atıp FBS kuyulara 1X pen / strep ve% 10 (v / v) ile taze 2 ml DMEM ekleyin. Yapmaktransfeksiyon deneyleri.
- Steril 1,5 ml mikrosantrifüj tüpe tablet 90 mikrolitre serum içermeyen DMEM. Pipet 3 ul serumsuz DMEM içine GeneJuice ve yavaşça tüp (parmak girdap) karıştırın. Oda sıcaklığında, 5 dakika süreyle inkübe edilir.
- Plazmid DNA (DNA stok = 100 ng / ul) DMEM-GeneJuice karışımı, parmak girdap ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe içine saflaştırılmış MiniPrep 1 ug ekleyin.
- Yavaşça transfeksiyon karışımın eşit dağılımını sağlamak için transfeksiyon karışımı HEK 293T hücreleri üzerine, damla damla ve girdap 6-kuyucuklu plak Pipeti. % 5 CO2 nemlendirilmiş odacık içinde 37 ° C'de 6-kuyucuklu plak inkübe.
- Her oyuğa 24 saat için 1X kalem / Strep ile 1 ml taze DMEM ve% 10 (v / v) FBS ekleme bir başka 48 saat boyunca post-transfeksiyon ile inkübe (toplam 72 saat).
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16.000 g'de üç gün post-transfeksiyon ile mikrosantrifüj örnekleri, her sıra ile süpernatan hasat 1 ml. Wes yürütmekKutu 2 ayrıntılı olarak sumru blot analizi. Numuneler 4 ° C'de saklanabilir 4 at depolama uzunluğu ° C proteini bağlıdır.
3. Büyük ölçekli test İfade ve Arıtma
Bir yapı tespit edildiğinde rekombinant proteininin ifadesi 10 miligram miktarı tabaka hücre fabrikaları (; 6360 cm 2 yüzey alanı Şekil 2) kullanılarak yapışık HEK 293T hücrelerinin PEI transfeksiyon ile elde edilir. Daha keşif çalışmaları için, küçük hücre fabrikalarda ya da T-şişeler (Tablo 1) de kullanılabilir.
- Bir MaxiPrep plazmid arındırma kiti kullanılarak transfeksiyon için DNA 1 mg saflaştırmak. XL-1 Mavi hücrelerin bir gece boyunca 500 ml saf kültürü DNA, en az 1 mg üretmek gerekir. A 260 / A 280 oranını ölçerek DNA'nın saflık kontrol edin; 1.8 üzerinde olmalıdır.
- 2.0 x 10 8 hücrelere HEK 293T hücreler kadar ölçeklendirilebilir. Her T225 cm 2 şişe% 100 birbirine karışmış işbirliği büyüdüntains ve ~ 2.25 x 10 7 hücrelerin ortalama.
- Bir 10-tabaka hücre fabrika 5% (v / v) FBS ile 1.2 L DMEM ekleyin. Hücre fabrikaya 2.0 x 10 8 HEK 293T hücreleri ekleyin ve geminin tüm katmanlarına eşit şekilde hücrelere dağıtır. Bu, hücre fabrikada hücrelerinin konfluent görselleştirme çok zordur. Bir alternatif olarak, 10 katmanı tankı ile gerçekleştirilir gibi yüzey alanına oranı aynı hücre sayısı kullanılarak, uygun bir hücre sayısına sahip bir T75 cm 2 şişeye ayarlamak. Büyüme oranları bu şişeyi izleyin. Hücre fabrikası işleme ile ilgili talimatlar için ilgili video görün. Hücre bağlanma ve büyüme sağlamak için% 5 CO 2 ile 37 ° C de bir gece inkübe edin.
- Yapışık HEK 293T hücrelerin% 70 konfluent zaman büyük ölçekli transfeksiyon gerçekleştirin. Steril bir şişeye T75 cm 2 kullanılarak kabini içinde biyogüvenlik PEI-DNA transfeksiyon karışımı (DNA oranı 03:01 w / w PEI) hazırlayın. Steril 1X PBS 84 ml DNA 0.84 mg karıştırın, sonra PEI (2 2.5 ml ekleyin.5 mg toplam PEI). 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. Çözüm bulutlu olmalıdır.
- Hücre fabrikası yavaşça PEI-DNA transfeksiyon karışımı dökün ve iyice geminin tüm katmanları üzerinden dağıtabilirsiniz. İsteğe Bağlı: artış ifade verimi için, valproik asit (4 mM son konsantrasyon) ekleyin. Dört gün süreyle% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.
- Hasat süpernatan dört gün post-transfeksiyon. 4 de 30 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüje şartlandırılmış ortam ° C. Ek bir 0.22 mikron Stericup vakumla filtre cihazı kullanılarak Süpernatan filtre. 10 katmanlı hücre fabrikası yeniden kullanılabilir, temizleme talimatları için Kutu 3'e bakın. Bu temizlik Süpernatant hasattan hemen sonra başlatılan bu anahtarı; gemi yüzeyine hücreleri kuru izin vermeyin.
- Centramate teğet akış filtrasyon sistemi kullanarak 75 ml supernatant Konsantre.
- PBS 500 ml ilave edilir ve 75 ml kadar tekrar konsantre. Üç addit tekrarlayıntamamen tampon ional kez numune alışverişi.
- 1X PBS ile bir 1 ml anti-HA afinite kolonu dengeye ve bir akış hızında yerçekimi <1 ml / dakika ile konsantre Örnek uygulanır.
- 1X PBS-Tween20 ile 30 ml kolon yıkanır.
- 1X PBS (1.0 mg / ml) içinde çözülür ve HA peptid 37 ° C'de inkübe
- Anti-HA kolonuna HA peptid 1 ml uygulamak ve peptidin reçineden içine akmasına olanak tanır. Üzerinden akış toplayın. Peptid çözüm yatak yüksekliği ulaştığı akışını durdurun.
- 15 dakika süreyle 37 ° C 'de, tüm anti-HA kolon inkübe.
- 12 iki ek kez Adımı tekrarlayın.
- Bu yatak yüksekliği ulaşıncaya kadar anti-HA sütun ve reçine içine akması 1X 1 ml PBS de geçerlidir. Üzerinden akış toplayın.
- 10 ml 0.1 M glisin pH 2.2 ile anti-HA kolon rejenere. % 0.02 (a / h) ile PBS ile 3 ° C NaN 4 at 10 ml PBS ve saklamak afinite kolonu ile yıkanır.
- SDS-PAGE analizi ve havuz f gerçekleştirbuna göre kesirlere. Not: HA peptit A 280 veya Bradford ile protein konsantrasyonu ölçümleri engel olacaktır. Standart olarak SDS-PAGE jeli üzerinde protein miktannda, yük 5, 10, 15, 25 ug BSA hesaplamak ve bant yoğunlukları karşılaştırmaktır.
Adımlar 9-17 klimalı ortamdan ek protein yakalamak için tekrar edilebilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Bu yazıda tarif ve daha sonra, yapısal ve işlevsel çalışmaları için kullanılabilir insan proteini miligram-miktar üretimi için uygun bir ifade platformu göstermektedir. Insan proteini eleme 6-kuyucuklu plaklar içinde HEK 293T hücreleri kullanılarak oluşturur verimli ve daha büyük bir ölçekte üretim için müsait yapıları belirlenmesi için etkilidir. Ticari İfade vektörleri örneğin GeneJuice, FuGene HD veya PE olarak transfeksiyon reaktifler kullanılarak çok çeşitli HEK 293T hücreleri, verimli bir şekilde transfekte edilebilir I. Biz bu reaktifler yoksul ifade proteinleri (Şekil 3) daha etkili olduğu gibi, test ifadeler için, örneğin GeneJuice veya FuGene HD gibi bir ticari transfeksiyon reaktif kullanılması tavsiye edilir. Daha büyük ölçekli ifadesi için seçilen yapıları Western blot (Şekil 3) üzerine uygun bir moleküler ağırlığa karşılık olarak, tek bir kuvvetli yoğunluğu grubu ile karakterize edilmelidir. Glikoproteinler glikozilasyon içinde heterojenite nedeniyle daha geniş bir bant olarak göç edebilir. Biz, viral glikoproteinleri, sitokinler, sitokin reseptörleri ve diğer yüzey proteinler arasında değişen çeşitli makromoleküller, ifade ve bu genel ifade platform kullanılarak protein millgram miktarlarda (Şekil 4) vermek üzere saflaştırılmıştır edilebileceğini göstermiştir.
Şekil 1. Küçük ölçekli transfeksiyonlar bir iş akışı şeması.tp_upload/4041/4041fig1large.jpg "target =" _blank "> büyük rakamı görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Büyük ölçekli protein ifadesi için Corning 10 katlı CellSTACK. Her katman hücre eki için 636 cm 2 yüzey alanı içerir. Bir standart laboratuvar CO2 inkübatör (6.0 cu. Ft) rahatlıkla dört 10-katmanlı hücre fabrikaları yapacak.
.. Şekil 3 çeşitli salgılanan proteinler Küçük ölçekli ifade Biz ortak transfeksiyon reaktifler kullanarak küçük ölçekli test ifadeler bir dizi test uyguladı. GeneJuice, FuGene HD ve PEI seçilen insan hücresel proteinlerin (a) Western Blot tarama (tetherin), reseptörler (IL-2R β altbirim) ve sitokinler (IL-2). Tetherin salınımını kısıtlayan bir insan zar glikoproteinidirdoğmakta olan HIV-1 virionlar 16. Tetherin of domeyni ~ 36 kDa glikosilatlı, disülfit bağlı bir dimer olarak bulunur. Burada gösterildiği üzere, indirgeme koşullarında, tetherin ~ 22 kDa arasında belirgin bir moleküler ağırlığa sahip bir monomer olarak geçirir. Interlökin-2 (IL-2) lenfosit proliferasyonu 17 yer alan bir sitokin (~ 17 kDa) 'dir. Bu, IL-2R βsubunit (~ 26 kDa) 18, bir bileşen olduğu, IL-2 reseptör kompleksi ile etkileşime girer. CD21 tamamlayıcı sistemi tarafından aktivasyonu ve olgunlaşmasını B-hücreleri dahil bir zar proteinidir ve aynı zamanda, Epstein-Barr virüsü için bir reseptördür. CD21 ve glikosilatlı domeyni ~ 20 kDa arasında belirgin bir moleküler ağırlığa sahip bir monomer olarak geçirir. Seçilen yüzey viral glikoproteinler (XMRV Env ve ebolavirus GP), (b) Western blot eleme. XMRV ve ebolavirus glikoproteinler (transmembran çapa silindi) trimeric ani olarak viral zar bulunur ve konak hücre ek olarak katılıyorve füzyon. XMRV Env ve EBOV GP ectodomain ağır N-bağlı glikan ile dekore edilmiş ve sırasıyla 70 kDa ve 75 kDa görünürdeki molekül ağırlıkları göç edilir.
Şekil 4. Büyük ölçekli HEK 293T kültürlerden gelen insan hücresel proteinlerin Arıtılmış. Proteinlerin tümünün bir 10-tabaka hücre fabrika kullanılarak ifade ve konsantre edilmiş ve anti-HA kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Coomassie olarak lekeli SDS-PAGE ile analiz ile gösterildiği gibi, interlökin-2 reseptörünün hücre dışı etki (IL-2R) α ve γ alt üniteleri, sırasıyla, 40 kDa ve 46 kDa molekül ağırlıklarında geçirilir. Tetherin of domeyni 36 kDa arasında belirgin bir moleküler ağırlığa sahip, non-indirgeme şartları altında, bir dimer olarak geçirir. 60 kDa belirgin bir molekül ağırlığı az görünen bazı BSA kirlenme olduğunu unutmayın. Buna ek olarak, N-bağlı glukanlardır heterojen, tetherin üzerinde mevcutIL-2R α ve IL-2R γ nedenleri bant SDS-PAGE jeli üzerinde genişletmektedir. Bu, karmaşık-tipi N-bağlı glukanlardır peptid kullanılarak çıkarılabilir: N-glycosidase F.
| Gemi | Yüzey alanı |
| 6-iyi plaka | 9.5 cm 2 (her iyi) |
| 100 mm yemekleri | 55 cm 2 |
| 245 mm yemekleri | 500 cm 2 |
| T75 cm 2 şişeye | 75 cm 2 |
| T175 cm 2 şişeye | 175 cm 2 |
| T225 cm 2 şişeye | 225 cm 2 |
| Rulo şişe düzenli | 850 cm 2 |
| Rulo şişe genişletilmiş yüzey | 1700 cm 2 |
| 1-tabaka CellSTACK | 636 cm 2 |
| 2-tabaka CellSTACK | 1272 cm 2 |
| 5-tabaka CellSTACK | 3180 cm 2 |
| 10 katmanı CellSTACK | 6360 cm 2 |
| 40 katmanı CellSTACK | 25.440 cm 2 |
Tablo 1. Proteininin ifadesi için hücre kültürü kullanılan damarlarının karşılaştırılması.
Reaktif Tarifler Listesi
100X siprofloksasilin'e 10 ml solüsyon için 10 mg siprofloksasin 10 ml deiyonize su ekleyin. Tamamen siprofloksasine çözünmesi için 10 ul 6N HCI ekleyin.
PEI (1 mg / mL), bir 100 ml solüsyon için, 80 deiyonize su ve ısı 25 kDa lineer PEI 100 mg çözünmesi ° C. Oda sıcaklığına kadar soğutulur çözeltisi, -20 az 7.2, sterilize 0.22 um bir filtreden, tablet ve dondurularak için pH'ı ayarlamak için lon ° Cg-vadeli depolama.
8.0 g NaCl, 0.2 g KCI, 1.4 g 2 Na HPO 4 (susuz), 0.24 g KH 2 PO 4: 1 L sulu solüsyon için 1X PBS. 7.4 için çözeltinin pH ayarlama ve 1.0 L. doldurmak
8.0 g NaCl, 0.2 g KCI, 1.4 g 2 Na HPO 4 (susuz), 0.24 g KH 2 PO 4, 1 ml Tween-20: 1 L sulu solüsyon için 1X PBS-Tween-20. 7.4 için çözeltinin pH ayarlama ve 1.0 L. doldurmak
3,0 g Tris baz, 14.4 g glisin, 150 ml metanol: 1 L sulu solüsyon için 1X transferi tamponu.
3.0 g Tris tabanı, 14,4 g glisin, 1,0 g SDS: 1X SDS-PAGE 1 L sulu çözüm için tampon çalışıyor.
0.6 g SDS, 3 ml gliserol, 1.8 ml 1,0 Tris-HCl pH 6.8, 1 mg Bromofenol mavisi, 5% (v / v) 2-merkaptoetanol: SDS-PAGE ile 10 ml solüsyon için numune tamponu azaltır.
- 2-nemlendirilmiş% 5 atmosfere CO 37 ° C 'de 10% (v / v) sığır cenin serumu (FBS), 1X kalem / Strep ile desteklenmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde HEK 293T hücrelerin büyümesi.
- Inverted mikroskop altında hücrelerin gözlemleyin. Hücrelerinin% 100 birbirine karışmış az olduğunda, kaldırmak ve kültür ortamı atın.
- Serum izlerini kaldırmak için steril 1X PBS 5 ml hücreleri durulayın. PBS yıkama atın.
- % 0.05 ile 2 ml (w / v) bir T225 cm 2 şişeye (veya T75 cm 2 şişesinde% 0.05 ml 1 (w / v) tripsin-EDTA) üzere tripsin-EDTA solüsyonu eklenir ve hücre ayırma kadar oda sıcaklığında inkübe yüzeyinden. Bu HEK 293T hücreleri çıkarmak için steril 1X PBS-EDTA kullanmak da mümkündür.
- Tripsin reaksiyonu inhibe etmek için bir T225 cm 2 şişeye (ya da% 10 ile 9 ml DMEM (v / v) FBS T75 cm 2 şişeye) için% 10 (v / v) FBS ile DMEM ile 13 ml ilave edilir.
- C Bölarşın 01:05. Bir T225 cm 2 şişe için, yeni bir kültür kap içinde 1X kalem / Strep ve% 10 (v / v) FBS ile taze DMEM ile 27 ml hücre süspansiyonu 3 ml ilave edilir. Bir T75 cm 2 şişesinde, taze büyüme ortamının 8 ml hücre süspansiyonu 2 ml ilave edilir. 2-nemlendirilmiş% 5 atmosfere CO 37 ° C'de inkübe kültürler. Hücreler iki gün içinde konfluense% 100 büyümek gerekir.
Kutu 2. Western blot analizi
- 10 ul SDS-PAGE azaltarak numune tamponu süpernatan 30 ul hücre kültürü ekle. Yük örnekleri ve 1 saat için 175 V ya da moleküler ağırlık marker kadar 1X SDS-PAGE çalışan tampon kullanarak poliakrilamid jeller ve electrophorese üzerine prestained molekül ağırlığı belirteçleri iyi çözümlenir.
- 1 dakika aktive etmek için% 100 metanol içinde Immobilon-P PVDF zarı emmek.
- Western blot aparatı takılacak. PVDF membran pozitif elektrot karşı karşıya sağlanması ve 1X transferi tamponu ile ıslak tüm bileşenlerini tutmak. Avopoliakrilamid jel ve membran arasındaki id kabarcıkları.
- Tamamen 100 az 1 saat 1X transferi tampon ve transferi ile elektroforez odaya dolması V.
- Oda sıcaklığında 1 saat süreyle PBS-1X Tween20 içinde% 5 (a / h) yağsız süt ile bloke membran veya bir gece boyunca 4 ° C.
- 4 de 1 saat için oda sıcaklığında ya da bir gece için 1X PBS-Tween20 içinde% 5 kaymağı alınmış süt (w / v) içinde çözülmüş monoklonal primer antikor (yani seyreltme 1:1000 anti-HA mAb veya başka uygun bir antikor) ° C ile inkübe
- 10 dakika boyunca 1X PBS-Tween20 içerisinde zarlar yıkanır. Fazladan iki kez tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca alkalin fosfataz (% 5 1:1000 seyreltme (w / v) 1X PBS-Tween20 içinde yağsız süt) ile konjuge edilmiş bir monoklonal antikor ile birlikte inkübe sekonder ya da bir gece boyunca 4 ° C.
- 10 dakika boyunca 1X PBS-Tween20 içerisinde zarlar yıkanır. Fazladan iki kez tekrarlayın.
- Küçük bir kap içine yerleştirin membranı, 5 ml alkalin fosfataz substra eklemete (BCIP / NBT) çözümü. Renk gelişimi 1-5 dakika içinde meydana gelmelidir. İstenilen bant yoğunluğu ulaşıldığında, deiyonize su ve kuru hava ile yıkayın. Renk zaman içinde solabilir; elektronik bir kez kuru membranlar tarayın.
Kutu 3. Hücre kültürü gemilerin temizlenmesi ve geri dönüşümü
Hücre fabrikalar tek kullanımlık olmak üzere tasarlanmış olsa da, bu gemilerin şu temizleme protokolü kullanılarak ek büyük ölçekli Transfeksiyonlar için geri dönüştürülebilir:
- Derhal 10-tabaka hücre fabrikasından Süpernatan dekantasyon sonra, 20% (v / v) ağartıcı ekleyin ve hücreleri çıkarmak için kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Üç saat için oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Damar boşaltılması ve taze 20% (v / v) ağartıcı ve bir gece boyunca oda sıcaklığında inkübe ekleyebilir.
- Gemi boşaltın ve deiyonize su 1.5 L ile yıkayın. Üç kez tekrarlayın.
- 10 katmanı hücre fabrika boşaltılması ve steril 1X PBS 0.5 L ilave 10 ile takviyeX Antibiyotik / Antimikotik çözüm. Oda sıcaklığında gemi saklayın ve bir sonraki kullanım öncesinde portları (standart 33 mm dişli kapaklar) doldurmak için havalandırma kapaklarını değiştirin. Not: Tüm katmanları temizledikten sonra tamamen açık olmalıdır, eğer değilse, kurumsal kurallarına göre hücre fabrikası kullanmak ve atmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
10 katmanı hücre fabrikalarda protein miligram miktarlarda üretilmesi için etkili bir kap olup. Bu tür roller şişeleri, erlenlere veya spinner matara gibi diğer geleneksel gemiler, üzerinde hücre fabrika kullanarak önemli bir avantajı da herhangi bir ek laboratuar ekipman alımı gerekmez olmasıdır. Standart bir CO 2 inkübatör (~ 6.0 cu. Ft) kolayca dört adet 10-katmanlı hücre fabrikalar (Şekil 2) uygun olacaktır. Buna ek olarak, bu kapların tabaklar, şişeler ya hücreleri ve proteinleri üretmek için rulo şişeler daha az iş gücü ve alan gerektirir; bir 10-tabaka hücre fabrika 7,5 düzenli bir rulo şişeler (Tablo 1) kullanımı ile aynıdır. Daha da önemlisi, HEK 293T hücreleri damarlarda daha çok uyum ve böylece ticari transfeksiyon reaktifler için düşük maliyetli ve etkili bir seçenek sağlayarak, PEI şirketi tarafından geçici transfeksiyon için son derece uygundurlar. Hücre fabrikalar tek hücre kültürü plasticware olacak şekilde tasarlanmıştır, biz b varverimli böylece önemli ölçüde kullanım başına maliyet azaltarak, kirlenme sorunları olmadan birden çok kez temizlemeniz ve bu gemiler yeniden kullanabilmek için een. Bir 10-tabaka hücre fabrika kullanılarak geçici ekspresyon üreten ~ (Şekil 4) protein saflaştırılmış proteini ve modifikasyonları bağlı olarak 1-10 mg yeteneğine sahiptir. Klonlama ve küçük ölçekli ifadeden yaklaşık 3-4 hafta içinde büyük ölçekli ifade ve arıtma tamamlanması gitmek mümkündür. Özetle, bu salgılanan insan ya da viral yüzey proteinlerin üretiminde çok faydalı olan bir hızla, genel bir platform. Dahası, bu platform da antikorlar, virüs benzeri parçacıkları ve adenovirüsler ve gen aktarımı için Lentivirüs ifade etmek için kullanılabilir.
Biz ortak sorunları ve olası çözümleri aşağıda listeledik. Daha detaylı bir sorun giderme kılavuzu için, 14 bakın.
- Yok veya çok düşük protein ifadesi:
- Kötü hmycoplasma kontaminasyon için canlılığı ve test için tripan mavi kullanarak hücrelerin-Leke hücrelerin ealth. Hücreleri yüksek geçit sayısı (> 25 pasajlar) var ve yavaş yavaş büyüyor, yeni HEK 293T hücreleri ile taze başlangıç. Transfeksiyon etkililiği, ve protein üretime kültürü hücre yaşı etkilenir.
- Zayıf geçici transfeksiyon-Hücreler% 40 arasında bir seviyede konfluent transfekte edilmelidir. Transfeksiyon reaktiftir DNA oranları optimize edilmesi gerekmektedir.
- Protein çözünmeyen proteinin hücre peleti katlanmış-kontrol kararsız veya değildir. Diğer yapılar ya da homolog proteininin ifadesi test.
- No proteini sütundan elüt edilmektedir:
- Protein 0.1 M glisin pH 2.2 ile kolon-Zehir üzerinde ilgi proteini muhafaza ve western blot ile analiz. Protein korunur ise, elüsyon için sentetik HA peptid daha yüksek bir konsantrasyonu kullanmak veya daha uzun süre 37 ° C'de inkübe edilir sütunu.
- anti-HA csütun, temizlenmeli ve doğru bir şekilde saklandığı takdirde, birden çok kez tekrar kullanılabilir olumn da zarar-, sütun etkinliğini zamanla azalır edilir. Yeni bir anti-HA sütunu kullanın.
- Protein proteaz inhibitörleri bozulması-ekleyin ve tüm arıtma işlemi sırasında buz üzerinde protein tutun.
- Protein üzerine çöktürülmüş veya toplanan etti sütun ise protein istikrarsız, protein istikrarı artırmak için farklı yapılar veya tampon koşulları (yani pH, tuz, katkı maddeleri, vb) deneyin.
- Protein kolon-HA-etiketi gömülmüş ya da erişilemez olabilir bağlamak için başarısız oldu. Yoluyla protein akışı olmadığından görmek veya yıkamak için kontrol edin.
- Serum albümin kontaminasyon:
Bovin serum albümini (BSA), anti-HA reçineye non-spesifik olarak bağlamak ve HA peptid elutions kontamine eğilimindedir. Şek. 4, BSA ~ 60-65 kDa belirgin bir molekül ağırlığı, kompakt bir bant olarak geçirir. Bu durumda, 1X P Tween-20 konsantrasyonunu arttırmakBS-Tween20 0.2% (v / v) ile yıkama ve yıkama hacmini. Alternatif olarak, BSA kirlenme boyutu dışlama veya iyon değişim kromatografisi kullanılarak çıkarılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma HA, FCA ve JDC bir Ontario HIV Tedavi Araştırma Ağı İşletim Grant (ROG-G645) ve Sağlık Araştırması Yeni Araştırmacı Ödülü (MSH-113.554) Kanada Enstitüleri JEL, ve Toronto Bursu Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar sağlayan hücreler, ebolavirus GP ekspresyon vektörü ve genel danışma için Scripps Araştırma Enstitüsü (La Jolla, CA) Marnie Fusco, Dafna Abelson ve Dr Erica Ollmann Saphire teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0x10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab')2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
