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Neuroscience

खुलासा परिसर मस्तिष्क टोपोग्राफी के लिए wholemount immunohistochemistry

Published: April 5, 2012 doi: 10.3791/4042
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University, 2Department of Cell Biology and Anatomy and the Hotchkiss Brain Institute, Faculty of Medicine, University of Calgary

Summary

तंत्रिका सर्किट भौगोलिक विवरण के अनुसार विशिष्ट आणविक प्रोफाइल के साथ कार्यात्मक डिब्बों में आयोजित कर रहे हैं. यहाँ, हम वैश्विक मस्तिष्क है बहुमुखी wholemount immunohistochemical धुंधला दृष्टिकोण का उपयोग कर स्थलाकृति खुलासा करने के लिए व्यावहारिक और तकनीकी कदम प्रदान करते हैं. हम अच्छी तरह से समझ cytoarchitecture और सेरिबैलम के circuitry पद्धति का उपयोग करके की उपयोगिता प्रदर्शित करता है.

Abstract

सेरिबैलम दोहराया और अच्छी तरह से समझ सेलुलर वास्तुकला यह मस्तिष्क स्थलाकृति की खोज के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाने. इसके अपेक्षाकृत वर्दी cytoarchitecture के अंतर्निहित जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति की parasagittal डोमेन की एक जटिल सरणी है. सेरिबैलम की आणविक compartmentalization अभिवाही फाइबर के संरचनात्मक और कार्यात्मक संगठन द्वारा नजर आता है. को पूरी तरह से अनुमस्तिष्क संगठन की जटिलता की सराहना करते हैं हम पहले माउस सेरिबैलम में patterning के दोष के उच्च throughput विश्लेषण के लिए एक wholemount धुंधला दृष्टिकोण परिष्कृत. इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन अभिकर्मकों, उपकरण, और व्यावहारिक कदम है कि सफलतापूर्वक वयस्क माउस सेरिबैलम में wholemount Immunostaining का उपयोग करके प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न पता चलता है के लिए उपयोगी होते हैं. चरणों पर प्रकाश डाला यहाँ कैसे मस्तिष्क के ठीक स्थलाकृति में अपनी प्रगट किया जा सकता का एक उदाहरण के रूप में zebrinII / aldolaseC की अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए इस पद्धति की उपयोगिता का प्रदर्शनदेशी रचना तीन आयामी. इसके अलावा वर्णित प्रोटोकॉल है कि अभिवाही आणविक स्थलाकृति के तुलनात्मक अध्ययन के लिए और बड़े मस्तिष्क् का पोंस तथा ऑब्लांगाटा के पीछे स्थित एवं इनसे जु्ड़ा भाग, जिसमें बीच का एक भाग् वर्मिस तथा दो पार्श्वीय खण्ड (गोलार्द्ध) होते है अनुमानों में प्रोटीन की अभिव्यक्ति के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए रूपांतरों हैं. इन आवेदनों का वर्णन करने के लिए, चूहा सेरिबैलम के अभिवाही धुंधला से डेटा शामिल हैं.

Protocol

1. पशु परफ्यूज़न और सेरिबैलम विच्छेदन

  1. प्रोटीन पर निर्भर करता है, छिड़काव के सफल धुंधला 1,2 के लिए आवश्यक हो सकता है. Transcardiac छिड़काव एक आक्रामक, गैर अस्तित्व प्रक्रिया है कि anesthetics के समुचित उपयोग की आवश्यकता है. सही प्रशिक्षण, संस्थागत अनुमोदन, और IACUC अनुमोदन प्रक्रिया का प्रयास करने से पहले आवश्यक है. यह हमेशा एक अच्छा विचार है कि संस्थान के पशु चिकित्सकों से परामर्श के प्रयोगात्मक आवश्यकताओं की पहचान करने और सही प्रशिक्षण प्राप्त करने में मदद मिल. प्रक्रिया से पहले, पशु गहरा संवेदनाहृत और पैर या पूंछ चुटकी के रूप में stimuli करने के लिए उत्तरदायी नहीं होना चाहिए. का प्रयोग कैंची पेट की त्वचा और मांसपेशियों की दीवार में एक काट कर और तब प्रत्येक पक्ष पर उरोस्थि के निकट काटने से रिब पिंजरे को खोलने के लिए जारी है. इसके अलावा, experimenter के डायाफ्राम आसपास प्रावरणी काटने से एक बड़ा आंतरिक अंतरिक्ष काम कर बना सकते हैं. पेट और वक्ष दीवार superio उठानेrly, दिल अब उजागर किया जाएगा. सही atrium में एक छोटे से कट बनाने के लिए बाहर प्रवाह करने के लिए और तुरंत बाएं वेंट्रिकल में छिड़काव सुई डालने के लिए रक्त की अनुमति है. एक बुनियादी हीड्रास्टाटिक पंप (विवरण के लिए 1 टेबल देखें) छिड़काव समाधान देने के लिए पसंद है. सबसे पहले, खून बाहर फ्लश 0.1M फॉस्फेट के साथ खारा बफर (Pbs, तालिका 3 देखें) जब तक तरल पदार्थ स्पष्ट चलाता है. फिर, हीड्रास्टाटिक पंप बारी जल्दी 4% paraformaldehyde के एक कंटेनर (पीएफए, तालिका 3 देखें) पीबीएस में पतला समाधान वितरण ट्यूब स्विच और फिर पंप वापस पर लगानेवाला देने के बारी. एक पंप का उपयोग आवश्यक नहीं है: अभ्यास के साथ, दो सीरिंज पीबीएस से भरा है और 4% पीएफए ​​धीरे समाधान देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. यह महत्वपूर्ण है ध्यान से मस्तिष्क ऊतक के किसी भी घावों को शुरू करने के बिना बाहर खोपड़ी के टुकड़े करना. यहां तक ​​कि विच्छेदन के दौरान मस्तिष्क के लिए छोटे lacerations धीरे - धीरे दिखाई दरारों में विस्तार होगा किजाल एंटीबॉडी और ऊतक (उदाहरण के लिए 2 चित्र में लाल तारांकन) के प्रसंस्करण दौरान artifactual धुंधला हो. अनुमस्तिष्क dissections के लिए, यह ठेठ है सिर के मध्य नीचे त्वचा में कटौती और फिर धीरे से flaps के अलावा तंग खोपड़ी बेनकाब. पूर्वकाल से खोपड़ी कटौती के साथ पृष्ठीय midline के पीछे, और भी laterally खोपड़ी के दोनों पक्षों के साथ. कटौती के रूप में इस सेरिबैलम nicking का खतरा नहीं चलाता शीर्षस्थान परे. संदंश का प्रयोग खोपड़ी के सामने धीरे दूर लिफ्ट दिमाग से सावधान किया जा रहा दूर आंसू नहीं मस्तिष्क के ऊतकों कि meninges से जुड़ा हुआ है. मस्तिष्क के उदर पक्ष पर कपाल नसों तोड़.
  3. मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से सेरिबैलम की जुदाई दो कारणों के लिए महत्वपूर्ण है. सबसे पहले, यह पूर्वकाल lobules, जो देखने से बगल में colliculi द्वारा छिपा कर रहे हैं में अभिव्यक्ति पैटर्न के अन्वेषण के लिए अनुमति देता है. दूसरा यह है कि छोटे, अलग क्षेत्रों में अलग ऊतक मीटर के लिए अनुमति देता हैअयस्क पूरा निर्धारण, जो कुछ प्रोटीन का धुंधला की सुविधा कर सकते हैं. इस अंतिम विच्छेदन कदम के दौरान, ध्यान संदंश के सुझावों के साथ संपर्क करने के लिए नहीं सेरिबैलम लिया जाना चाहिए. बेहतर और अवर colliculi के बीच में संदंश की एक जोड़ी के सुझावों को सम्मिलित करें. संदंश की एक दूसरे सेट के साथ धीरे धीरे दूर सेरिबैलम से अवर colliculi के तंग. तो, सेरिबैलम करना इतना है कि पूर्वकाल ओर नीचे का सामना करना पड़ रहा है और brainstem ऊपर की तरफ इशारा कर रहा है. Brainstem और lobules नौवीं / सेरिबैलम के एक्स के बीच चौथे वेंट्रिकल में संदंश डालें. संदंश के साथ दोनों पक्षों पर बन्द रखो peduncles कट और फिर धीरे brainstem से सेरिबैलम दूर उठा. एक बार सेरिबैलम अलग है, यह विसर्जन द्वारा 4% पीएफए ​​में 24-48 घंटे की एक न्यूनतम के लिए पोस्ट-को ठीक 4 डिग्री सेल्सियस पर. सेरिबैलम समय की एक विस्तारित अवधि के लिए 4% पीएफए ​​में संग्रहीत किया जा सकता है. तानिका पहले या अभिव्यक्ति पैटर्न की बेहतर दृश्यता के लिए धुंधला हो जाना के बाद या तो हटा दिया जाना चाहिए.यदि प्रयोगकर्ता के तानिका दूर धुंधला से पहले वहाँ एक मजबूत संभावना है कि सेरिबैलम प्रक्रिया के दौरान nicked जाएगा चुनता है. दूर धुंधला प्रक्रिया के अंत में तानिका छील बहुत आसान है क्योंकि वे आसान करने के लिए पता लगाने के बाद वे कमजोर पृष्ठभूमि धुंधला अधिग्रहण और प्रसंस्करण के बाद कमजोर हो.

2. प्रसंस्करण Wholemount धुंधला के लिए ऊतक

क्योंकि wholemount धुंधला दृष्टिकोण ऊतक वर्गों के immunohistochemical धुंधला से लंबे समय तक ले जाता है, यह उपयोगी है प्रयोगों के प्रत्येक के लिए इस समय की योजना के रूप में प्रदान की (तालिका 2) उदाहरण कैलेंडर में दिखाया गया है. शुरू करने से पहले, वहाँ कई महत्वपूर्ण बातें ध्यान में रख रहे हैं. 1) ऊतक युक्त microtubes हर समय nutator पर घुमाया / फ्रीज पिघलना प्रक्रिया के दौरान छोड़कर होना चाहिए. 2) कई समाधान प्रत्येक प्रयोग के लिए ताजा किया जाना चाहिए (समाधान व्यंजनों के लिए 3 टेबल देखें). 3)प्रोटोकॉल के दौरान, जब समाधान बदल रहा है, धीरे बाहर संदंश साथ सेरिबैलम को हटाने के बजाय खर्च समाधान डालना, लिए सेरिबैलम छू से बचने. फिर, एक कंटेनर में नए समाधान मिश्रण के बाद, पिपेट उपयोग धीरे ट्यूब को ताजा समाधान जोड़ने.

2.1 एक दिन:

  1. कमरे के तापमान पर 6-8 घंटे nutator पर धीरे कमाल लिए सेंध ठीक 3 में सेरिबैलम फिक्स. यदि मेथनॉल अपने प्रतिजन के लिए विनाशकारी है, 2.3a के माध्यम से एक प्रतिजन पुनर्प्राप्ति विधि के साथ 2.1a कदम की जगह पर विचार करें. गर्मी और buffers प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी प्रवेश के लिए ऊतक तैयार करने में मदद करेगा.
  2. ब्लीच 4 में सेंध 3 रातोंरात ब्लीच में सेरिबैलम डिग्री सेल्सियस

2.2 2 दिन:

  1. कमरे के तापमान पर 30 मिनट प्रत्येक के लिए 100% ओह की दो दौर में सेरिबैलम निर्जलीकरण.
  2. फिर, समाधान की पहुंच बढ़ाने के लिए, विषयफ्रीज / पिघलना चक्र की एक श्रृंखला के लिए ऊतक. ध्यान से एक कंटेनर में शुष्क बर्फ और 30 मिनट के लिए फ्रीज के साथ ट्यूब जगह. फिर, ट्यूब को हटाने और कमरे के तापमान पर यह 15 मिनट के लिए बेंच पर छोड़ दें. कदम / फ्रीज पिघलना चार बार कम से कम किया जाना चाहिए.
  3. ऊतक के अंतिम विगलन के बाद, -80 ° सी फ्रीजर में ट्यूब रातोंरात जगह.
  4. ऊतक -80 पर समय की लंबी अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता डिग्री सेल्सियस या तो तुरंत पहले या फ्रीज / पिघलना कदम के बाद. अन्यथा, प्रोटोकॉल जारी रखा जाना चाहिए.

2.3 3 दिन:

  1. यह 50% में धोने से सेरिबैलम Rehydrate MeOH/50% PBS, 15% MeOH/85% Pbs, और 60-90 कमरे के तापमान पर प्रत्येक मिनट के लिए 100% पीबीएस.
  2. अगला, वयस्क माउस मस्तिष्क् का पोंस तथा ऑब्लांगाटा के पीछे स्थित एवं इनसे जु्ड़ा भाग, जिसमें बीच का एक भाग् वर्मिस तथा दो पार्श्वीय खण्ड (गोलार्द्ध) होते है, 2-3 मिनट के लिए, पीबीएस में 10μg/ml proteinase कश्मीर के साथ enzymatic पाचन के लिए ऊतक विषय के लिए. कोई पाचन कदम नहीं युवा पशुओं के मस्तिष्क् का पोंस तथा ऑब्लांगाटा के पीछे स्थित एवं इनसे जु्ड़ा भाग, जिसमें बीच का एक भाग् वर्मिस तथा दो पार्श्वीय खण्ड (गोलार्द्ध) होते है (P5 माउस या छोटी) के लिए आवश्यक है. लंबे समय तक digestion बड़े दिमाग के लिए सुझाव दिया है. उदाहरण के लिए, पाचन के रूप में में रहनुमा 4 दिमाग के लिए 5-6 मिनट के रूप में उच्च किया जा सकता है.
  3. पाचन के बाद, तुरंत पीबीएस तीन बार में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेरिबैलम धोने के लिए proteinase लालकृष्ण निकालें
  4. PMT में ऊतक ब्लॉक (3 टेबल देखें) 4 पर रातोंरात डिग्री सेल्सियस दूध पाउडर अक्सर पहली पसंद है जब प्रोटीन काम के लिए एक अवरुद्ध एजेंट का चयन है, क्योंकि यह सस्ता है, प्रभावी ढंग से पृष्ठभूमि धुंधला कम करती है, और आम तौर पर एंटीबॉडी बंधनकारी या प्रतिजन के लिए उपयोग के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. पशु serums भी इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि experimenter जोड़ा लागत के बारे में पता हो सकता है और पहली बार पार प्रतिक्रियाशील immunoglobulins और शोर अनुपात करने के लिए एक इष्टतम संकेत उत्पादन करने की क्षमता के लिए सीरम की गुणवत्ता का परीक्षण करना चाहिए करना चाहिए.

2.4 4-5 दिन:

  1. PMT में प्राथमिक पतला एंटीबॉडी 4 डिग्री सेल्सियस (larg में 48 घंटे के लिए 5% DMSO के साथ पूरक में ऊतक सेते हैंएर मस्तिष्क् का पोंस तथा ऑब्लांगाटा के पीछे स्थित एवं इनसे जु्ड़ा भाग, जिसमें बीच का एक भाग् वर्मिस तथा दो पार्श्वीय खण्ड (गोलार्द्ध) होते है ऊष्मायन समय में वृद्धि की आवश्यकता होती है) होगा.

2.5 छह दिन:

  1. सेरिबैलम 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 PMT में प्रत्येक घंटे के लिए 2-3 बार अपार प्राथमिक एंटीबॉडी को दूर धो.
  2. फिर, एक 4 में 5% DMSO के साथ पी एम टी युक्त समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी में ऊतक सेते हैं डिग्री सेल्सियस रातोंरात (बड़ा मस्तिष्क् का पोंस तथा ऑब्लांगाटा के पीछे स्थित एवं इनसे जु्ड़ा भाग, जिसमें बीच का एक भाग् वर्मिस तथा दो पार्श्वीय खण्ड (गोलार्द्ध) होते है की आवश्यकता हो सकती है वृद्धि हुई ऊष्मायन बार).

2.6 सात दिन:

  1. सेरिबैलम 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 बार धो 2-3 PMT में प्रत्येक घंटे के लिए
  2. ऊतक 1-2 घंटे के लिए एक पीबीटी (3 टेबल देखें) के साथ अंतिम धो दे. यह कदम अतिरिक्त दूध निकालता है और धुंधला की स्पष्टता को बढ़ाता है.
  3. अंत में, थपका (3,3 '- diaminobenzidine) समाधान में ऊतक सेते हैं जब तक इष्टतम धुंधला तीव्रता के तक पहुँच जाता है. भूरे रंग प्रतिक्रिया उत्पाद स्पष्ट रूप से दिखाई ~ 10 मिनट के भीतर होना चाहिए. यह सबसे अच्छा है अंधेरे में थपका उपयोग के प्रकाश precipita वर्णकोत्पादक का कारण बनता हैते, जो पृष्ठभूमि धुंधला बढ़ा सकते हैं.

2.7

जब इष्टतम धुंधला तीव्रता के तक पहुँच जाता है, पीबीएस में 0.04% सोडियम azide साथ सेरिबैलम रखकर प्रतिक्रिया बंद करो. ऊतक इस समाधान में लंबे समय तक संग्रहीत हो सकता है. सोडियम azide बैक्टीरियल वृद्धि का एक शक्तिशाली अवरोध करनेवाला है, लेकिन जब तक इस कदम से बचा जाना चाहिए के रूप में यह भी हॉर्सरैडिश peroxidase रोकता है.

2.8 वैकल्पिक प्रवर्धन प्रक्रिया:

सामान्य प्रोटोकॉल का पालन करें, लेकिन इन कदम ऊपर 2.5b 2.7 कदम की जगह में किया जाना चाहिए.

  1. ऊतक 4 में रात भर सेते हैं ° PBST में बायोटिन - संयुग्मित माध्यमिक 5% DMSO के साथ (3 टेबल देखें) एंटीबॉडी में सी.
  2. 2-3 3-4 PBST के परिवर्तन में कमरे के तापमान पर प्रत्येक घंटे के लिए ऊतक कुल्ला.
  3. सेरिबैलम रातोंरात 4 ° एबीसी PBST में जटिल समाधान में सी सेते हैं.
  4. प्रत्येक 2-3 घंटे के लिए ऊतक कुल्लापीबीएस की 3-4 परिवर्तन में कमरे के तापमान.
  5. हौसले से तैयार थपका समाधान में ऊतक, जैसा कि ऊपर वर्णित सेते हैं.
  6. जब धुंधला इष्टतम है, पीबीएस में 0.04% सोडियम azide साथ सेरिबैलम धोने के द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो.

3. सना हुआ ऊतक इमेजिंग

  1. Wholemount छवियों का उपयोग कर, उदाहरण के लिए द्वारा कब्जा किया जा सकता है, एक Leica DFC3000 FX कैमरा Leica MZ16 एफए stereomicroscope Leica अनुप्रयोग सूट FX सॉफ्टवेयर चल रहा है पर मुहिम शुरू की. अगर वांछित, deconvolution माइक्रोस्कोपी प्रत्येक छवि होने के साथ ही कुरकुरा ध्यान में एक भी छोटि लो अलग फोकल विमानों में कई लगातार छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फिर, छवियों को एक एकल ढेर और गाया सॉफ्टवेयर विरूपण हटाने में संकुचित किया जा सकता है. अंतिम समग्र छवि स्पष्ट ध्यान में patterning सभी दृश्य के साथ अनुमस्तिष्क सतह अभिव्यक्ति पैटर्न का उदाहरण देकर स्पष्ट करना होगा.
  2. जबकि wholemount दाग ऊतक से पीबीएस में डूबे imaged किया जाना चाहिए है (या किसी अन्य माध्यम है कि एक देंगेइष्टतम अपवर्तक सूचकांक). आदेश में आसानी से में इमेजिंग लिए wholemount की स्थिति के लिए, एक प्लास्टिक पेट्री डिश में एक 1% अगर जेल. जेल में छोटे छेद में कटौती. इस छेद है सेरिबैलम वांछित अभिविन्यास में अंकित करने के लिए अनुमति देगा.
  3. Adobe Photoshop CS4 में कच्चे डेटा आयात कर रहे हैं और इसके विपरीत और चमक स्तर के लिए समायोजित.

पशु

सभी जानवरों के अध्ययन के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन में संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार एक अनुमोदित IACUC पशु प्रोटोकॉल के तहत किए गए. पुरुष और महिला outbred स्विस (Taconic, अल्बानी, NY) वेबस्टर चूहों हमारी कॉलोनी में बनाए रखा गया और सभी के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया. Euthanized वयस्क चूहों कृपया डा. Bryen जॉर्डन (अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन के) द्वारा प्रदान किया गया है. सभी जानवरों के कम से कम एक महीने पुराने थे.

4. प्रतिनिधि परिणाम

सेरिबैलम आणविक अभिव्यक्ति चार अनुप्रस्थ क्षेत्रों में बंटे है:पूर्वकाल क्षेत्र (प्रथम से अंतिम अक्षर तक: ~ lobules चतुर्थ), केंद्रीय क्षेत्र (CZ: ~ lobules छठी, सातवीं), पीछे (PZ: नौवीं ~~ lobules आठवीं पृष्ठीय) क्षेत्र और गांठदार क्षेत्र (न्यूजीलैंड: ~ lobules नौवीं उदर और एक्स ) 5. प्रत्येक जोन parasagittal धारियों 1,2,5,6 (1 छवि) की एक अद्वितीय सरणी शामिल हैं. Purkinje कोशिकाओं में ZebrinII अभिव्यक्ति AZ और PZ (छवि 2) और जेड और न्यूजीलैंड (छवि 2) में समान अभिव्यक्ति में धारियों का पता चलता है. Purkinje कोशिकाओं parasagittal संगठन अभिवाही फाइबर के टर्मिनल क्षेत्र स्थलाकृति से नजर आता है. कोकीन और एम्फ़ैटेमिन विनियमित प्रतिलिपि (कार्ट) पेप्टाइड चढ़ाई फाइबर (छवि 3a) के सबसेट में व्यक्त की है कि Purkinje सेल dendrites के अनुमस्तिष्क 7 प्रांतस्था (3b छवि) की आणविक परत में धारियों के लिए परियोजना. 7 प्रवर्धन के रूप में उचित संशोधनों के साथ, wholemount प्रोटोकॉल nee के बिना olivocerebellar पैटर्न के दृश्य के लिए अनुमति देता हैएक श्रमसाध्य, धुंधला ऊतक वर्गों (3b छवि) से समय लेने के पुनर्निर्माण के लिए चाहते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. ए / ZebrinII के aldolaseC अभिव्यक्ति सेरिबैलम का अनुप्रस्थ अनुभाग में बाण के समान बैंड का पता चलता है. पैमाने बार = 500 माइक्रोन., बी ZebrinII / aldolaseC विशेष रूप से Purkinje सेल somata के और dendrites में व्यक्त किया है. पैमाने बार = 150μm (gl = बारीक परत, pcl = Purkinje सेल परत, मिलीलीटर = आण्विक परत).

चित्रा 2
चित्रा 2. एक wholemount / ZebrinII aldolaseC पूर्वकाल (AZ), केंद्रीय (cz), और सेरिबैलम के पीछे (PZ) क्षेत्रों की छवियों में Purkinje सेल धारियों को दिखाने के लिए दाग सेरिबैलम. यहाँ हम भी सेरिबैलम nicking की नकारात्मक परिणाम का एक उदाहरण दिखा. परिणामस्वरूप artifactual धुंधला संकेत दिया हैलाल तारांकन के साथ. पैमाने बार = 1 मिमी (लोकसभा = lobulus सिंप्लेक्स, पीएमएल है = paramedian छोटि लो, COP = योजक pyramidis के).

चित्रा 3


चित्रा 3. ए कार्ट आणविक परत में फाइबर टर्मिनलों चढ़ाई में व्यक्त किया है. (PCL = Purkinje सेल परत, जीएल = बारीक परत मिलीलीटर = आणविक परत) बी NZ में कार्ट अभिव्यक्ति की Wholemount immunohistochemistry पैमाने बार = 100 माइक्रोन. पैमाने बार = 2 मिमी (COP = योजक pyramidis, पीएमएल = paramedian छोटि लो; पीएफएल paraflocculus =; FL से गुम्फिका =).

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Discussion

हम तकनीकी सफल wholemount विकासशील और वयस्क मस्तिष्क में खुलासा प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक बहुमुखी immunohistochemical दृष्टिकोण का उपयोग कर धुंधला के लिए आवश्यक जानकारी का वर्णन किया है. इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, जटिल आणविक अभिव्यक्ति पैटर्न और विश्लेषण किया जा सकता है मस्तिष्क स्थलाकृति श्रमसाध्य और समय लेने ऊतक सेक्शनिंग प्रक्रियाओं के लिए की आवश्यकता के बिना की सराहना की.

इस प्रोटोकॉल दोनों में 1,2,8,9 वयस्क और जल्दी प्रसव के बाद माउस 10,11,12 सेरिबैलम में कई Purkinje सेल प्रोटीन के नमूनों की अभिव्यक्ति प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हमारे मूल अध्ययनों से यह भी ग्रेन्युल कोशिका प्रतिजन 1 अभिव्यक्ति और anterogradely पता लगाया काई से भरा दो फाइबर, जो बारीक परत में PIAL सतह के नीचे रहते हैं ~ 250 माइक्रोन की जांच के लिए wholemount दृष्टिकोण की उपयोगिता का प्रदर्शन किया. मैं इसके अलावा, कई अध्ययनों प्रोटीन की सफल धुंधला के लिए मूल प्रोटोकॉल में संशोधन किया हैपता Purkinje कोशिकाओं 1,13 प्रतिजन पुनर्प्राप्ति और अभिवाही 7,14 फाइबर (संकेत प्रवर्धन, चित्र 2.). इसके अलावा, wholemount immunohistochemical धुंधला हो जाना भी कई स्तनधारी 4,15 के मस्तिष्क् का पोंस तथा ऑब्लांगाटा के पीछे स्थित एवं इनसे जु्ड़ा भाग, जिसमें बीच का एक भाग् वर्मिस तथा दो पार्श्वीय खण्ड (गोलार्द्ध) होते है और एवियन प्रजातियों 16,17 के, neurodegenerative 18,19 रोगों के माउस मॉडल में नक्शा नमूनों Purkinje सेल नुकसान के लिए इस्तेमाल किया गया है लागू किया गया, और 20 दिल, फेफड़ों के दाग के लिए संशोधित 21, कपाल नसों 22 और corneal 23 नसों. पिछले वर्णन से wholemount विधि 1,2 की वर्तमान प्रोटोकॉल के प्रमुख प्रस्थान है कि यहाँ हम न केवल बेहतर सफलता के लिए अद्यतन विवरण जब प्रक्रिया का उपयोग, लेकिन यह भी ऊतक फिक्सिंग के लिए एक पूरा गाइड है प्रदान करते हैं, और ऊतक में एक विदारक तकनीक की गहराई वीडियो चित्रण.

वहाँ wholemount धुंधला की कई सीमाएं हैं. सबसे पहले, केवल सतह पैटर्न typiबड़ी सफाई से आगे विच्छेदन और धुंधला बिना या कि ऊतक एंटीबॉडी में incubated है समय की लंबाई में वृद्धि के बिना कल्पना. इसके अलावा, धुंधला प्रांतस्था भीतर गहरे तक पहुँच नहीं है अगर यह पत्तियों से सजाना 1,2 के कारण छिपा है. हालांकि, wholemount दाग ऊतक प्रसंस्करण के बाद sectioned हो और restained कर सकते हैं, एक ही एंटीबॉडी या दूसरे के साथ, सेलुलर अभिव्यक्ति प्रोफाइल ऊतक 1,2 के भीतर गहरे प्रकट. दूसरा, बुनियादी wholemount धुंधला प्रोटोकॉल लंबी है. हमारा सुझाव है कि प्रत्येक experimenter के empirically अपने एंटीबॉडी का धुंधला दक्षता का निर्धारण और समय - निर्धारण के बाद कम, संख्या और washes की लंबाई, और / छोटा या प्राथमिक एंटीबॉडी में ऊष्मायन की लंबाई कम है. इन समायोजनों के साथ प्रोटोकॉल एक काफी कम समय में पूरा किया जा सकता है. तीसरा, बड़े मस्तिष्क् का पोंस तथा ऑब्लांगाटा के पीछे स्थित एवं इनसे जु्ड़ा भाग, जिसमें बीच का एक भाग् वर्मिस तथा दो पार्श्वीय खण्ड (गोलार्द्ध) होते है के लिए wholemount धुंधला प्रोटोकॉल एंटीबॉडी के समाधान के बड़ी मात्रा की आवश्यकता है, जो महंगा है और / या केवल उपलब्ध सीमित बल्ली से ढकेलना में हो सकता हैities. हालांकि, यह संभव है प्राथमिक एंटीबॉडी प्रत्येक चलाने के बाद -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान ठंड से बचाने के प्रत्येक experimenter कि उनके प्रतिरक्षी ठंड झेलने से पहले इसे फिर से प्रयोग किया जाता है कर सकते हैं निर्धारित करने के लिए होगा. हम सफलतापूर्वक zebrinII की पहले से जमे हुए aliquots का उपयोग ऊतक दाग है. चौथा, नहीं सभी एंटीबॉडी बुनियादी wholemount दृष्टिकोण के साथ संगत कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, आमतौर पर छोटे गर्मी झटका प्रोटीन, HSP25 की धारीदार अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया, एंटीबॉडी की आवश्यकता है कि ऊतक पहले प्रतिजन 13 पुनर्प्राप्ति के लिए संसाधित किया जाना है. बावजूद, के रूप में धुंधला ऊतक वर्गों के लिए, समस्या निवारण एंटीबॉडी प्रतिजन बाध्यकारी के पारंपरिक तरीकों भी wholemount धुंधला अनुकूलन के लिए उपयोगी सिद्ध कर दिया है.

वर्तमान में हम हमारे wholemount प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट टैग माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ उपयोग के लिए अनुकूल करने की संभावना तलाश रहे हैं. उपयुक्त छवि अलग रंग fluorop करने की क्षमता से लैस खुर्दबीन के साथhores, कम शक्ति के तहत एक ही पशुओं में कई Purkinje सेल नक्शे के संगठन ही नहीं का विश्लेषण करने में सक्षम हो सकता है, लेकिन यह भी Purkinje सेल पट्टी पैटर्न और WGA एलेक्सा की स्थलाकृति तीन आयामों में अभिवाही फाइबर लेबल के बीच संबंधों की जांच 2,4.7,24. इसके अलावा, बड़े पैमाने पर जीन अभिव्यक्ति डेटाबेस के हाल ही में उपलब्धता (एलन मस्तिष्क एटलस, Genepaint, ब्रेन जीन एक्सप्रेशन नक्शा) पूरे मस्तिष्क की आणविक स्थलाकृति की जांच करने के लिए पूरे जीनोम विश्लेषण के साथ हमारे उच्च throughput wholemount दृष्टिकोण के विलय के लिए नए रास्ते खोल दिया है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

आर वी एस Yeshiva विश्वविद्यालय के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन से नया शुरू हुआ धन अन्वेषक के द्वारा समर्थित है.

References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 62 जीन अभिव्यक्ति एंटीबॉडी compartmentalization मस्तिष्क स्थलाकृति circuitry
खुलासा परिसर मस्तिष्क टोपोग्राफी के लिए wholemount immunohistochemistry
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White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, … More

White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography. J. Vis. Exp. (62), e4042, doi:10.3791/4042 (2012).

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