Imuno-histoquímica para Topografia Wholemount cerebrais, Complexo

Summary

Circuitos neurais são topograficamente organizados em compartimentos funcionais específicas com perfis moleculares. Aqui, apresentamos os passos práticos e técnicos para revelar topografia cérebro global usando uma abordagem de coloração imuno-histoquímica wholemount versátil. Nós demonstrar a utilidade do método utilizando o citoarquitetura bem compreendida e os circuitos de cerebelo.

Abstract

A arquitetura repetida e bem-entendido celular do cerebelo torná-lo um sistema modelo ideal para explorar a topografia do cérebro. Subjacente a sua citoarquitetura relativamente uniforme é um complexo conjunto de domínios parassagitais de expressão gênica e protéica. A compartimentação molecular do cerebelo é espelhada pela organização anatômica e funcional das fibras aferentes. Para apreciar plenamente a complexidade da organização do cerebelo que anteriormente uma abordagem refinada coloração wholemount para análise de defeitos de alto rendimento de padronização no cerebelo mouse. Este protocolo descreve em detalhes os reagentes, instrumentos e medidas práticas que são úteis para o sucesso revelar padrões de expressão de proteínas no cerebelo do rato adulto usando imunomarcação wholemount. Os passos em destaque aqui demonstrar a utilidade do presente método utilizando a expressão de zebrinII / aldolaseC como um exemplo de como a topografia fina do cérebro pode ser revelado na suaconformação tridimensional nativa. Também descritos são adaptações para o protocolo que permite a visualização de expressão da proteína em projeções aferentes e cerebelo grande para estudos comparativos de topografia molecular. Para ilustrar estas aplicações, os dados de coloração aferente do cerebelo de rato estão incluídos.

Protocol

1. Perfusão Animal e Dissection Cerebelo

1. Dependendo da proteína, a perfusão pode ser essencial para ^1,2 coloração bem sucedida. Perfusão intracardíaca é um procedimento invasivo, o procedimento não-sobrevivência que exige o uso adequado de anestésicos. Treinamento correto, aprovação institucional, e aprovação IACUC são todos necessários antes de tentar o procedimento. É sempre uma boa idéia consultar veterinários da instituição para obter ajuda na identificação de requisitos experimentais e adquirindo o treinamento correto. Antes do procedimento, o animal deve ser profundamente anestesiados e não responsivos a estímulos tais como a febre ou pitada cauda. Usando uma tesoura faça um corte na pele abdominal e parede muscular e, em seguida, continuar a abrir a caixa torácica, cortando apenas ao lado do esterno em cada lado. Além disso, o experimentador pode criar um maior espaço de trabalho interno cortando a fáscia circundante do diafragma. Ao levantar a parede abdominal e torácica Superiorly, o coração irá agora ser exposta. Fazer um pequeno corte no átrio direito para permitir que o sangue flua para fora e imediatamente inserir a agulha de perfusão para o ventrículo esquerdo. Uma bomba de hidrostática de base é o preferido para produzir as soluções de perfusão (ver Tabela 1 para detalhes). Primeiro, lave o sangue para fora com fosfato 0,1 M tamponada salina (PBS, ver Tabela 3), até o fluido corre claro. Em seguida, desligar a bomba hidrostática, mudar rapidamente o tubo de entrega de solução a um recipiente de paraformaldeído a 4% (PFA, ver Tabela 3) diluído em PBS e depois ligar a bomba de volta para entregar o fixador. A utilização de uma bomba não é necessário: com a prática, duas seringas cheias com o PBS e 4% PFA pode ser usado para produzir as soluções lentamente.
2. É crítico para dissecar cuidadosamente o cérebro para fora do crânio sem a introdução de quaisquer lesões ao tecido. Mesmo pequenas lacerações no cérebro durante a dissecção irá expandir gradualmente em fendas visíveis queanticorpos armadilha e causar manchas artefactual durante o processamento do tecido (por exemplo, asteriscos vermelhas na Fig. 2). Para dissecações cerebelares, é típico para cortar a pele para baixo no meio da cabeça e depois suavemente provocar as abas à parte para expor o crânio. Cortar o crânio de anterior para posterior ao longo da linha média dorsal, e também lateralmente ao longo de ambos os lados do crânio. Não corte além do bregma como esta corre o risco de entalhar o cerebelo. Utilizando uma pinça suavemente levantar a parte frontal do crânio longe do cérebro com cuidado para não rasgar o tecido cerebral que está ligado para as meninges. Sever dos nervos cranianos, no lado ventral do cérebro.
3. Separação do cerebelo do resto do cérebro é importante por duas razões. Primeiro, ele permite a exploração de padrões de expressão nos lóbulos anteriores, que estão escondidos da visão pela colículos in situ. A segunda é que a separação do tecido em menores, regiões isoladas permite mminério de fixação completa, o que pode facilitar a coloração de algumas proteínas. Durante esta etapa dissecção final, cuidados devem ser tomados para não tocar no cerebelo, com as pontas dos fórceps. Inserir as pontas de um par de pinças para o meio das colículos superiores e inferiores. Com um segundo conjunto de pinça lentamente provocar afastado o colículo inferior a partir do cerebelo. Em seguida, coloque o cerebelo para que sua face anterior é voltada para baixo e do tronco cerebral está apontando para cima. Inserir a pinça para o quarto ventrículo entre o tronco encefálico e IX lóbulos / X do cerebelo. Cortar os pedúnculos apertando com a pinça de ambos os lados e então suavemente levantar o cerebelo de distância a partir do tronco cerebral. Uma vez que o cerebelo é isolado, pós-corrigi-lo por imersão em PFA a 4% a 4 ° C durante um mínimo de 24-48 horas. O cerebelo podem ser armazenados em PFA a 4% durante um período prolongado de tempo. As meninges deve ser removido antes ou depois da coloração para melhor visibilidade dos padrões de expressão.Se o experimentador escolhe para remover as meninges antes da coloração existe uma forte possibilidade de que o cerebelo será cortado durante o processo. Descascar as meninges no final do procedimento de coloração é muito mais simples, porque eles se tornam mais fáceis de localizar após adquirem a coloração de fundo fraco e tornar-se frágil pós-processamento.

2. O processamento do tecido para a coloração Wholemount

Como a abordagem de coloração wholemount demora mais do que coloração imuno-histoquímica de secções de tecido, é útil para planear a linha de tempo para cada um dos experimentos como mostrado no calendário exemplo fornecido (Tabela 2). Antes de começar, há várias coisas fundamentais para se manter em mente. 1) Os microtubos contendo o tecido deve ser rodada em um nutator em todos os momentos, excepto durante o processo de congelamento / descongelamento. 2) Várias soluções deve ser feito fresco para cada experiência (Ver Tabela 3 para as receitas de solução). 3)Durante todo o protocolo, quando mudar soluções, gentilmente deitar fora a solução passou em vez de remover o cerebelo com uma pinça, para evitar tocar no cerebelo. Então, depois de misturar a solução de novo no outro recipiente, utilizar uma pipeta para suavemente adicionar a solução de fresco para o tubo.

2,1 Dia 1:

1. Fixar o cerebelo em ³ Dent correção à temperatura ambiente por 6-8 horas balançando suavemente na nutator. Se metanol é destrutivo para o seu antígeno, considere substituindo passos 2.1a através 2.3a com um método de recuperação antigênica. O calor e os amortecedores usados ​​para recuperação antigênica vai ajudar a preparar o tecido para a penetração de anticorpos.
2. Cerebelo Bleach o em Bleach Dent ³ durante a noite a 4 ° C.

2,2 Dia 2:

1. Desidratar o cerebelo em duas rondas de MeOH a 100% à temperatura ambiente durante 30 min cada.
2. Em seguida, para aumentar a penetração das soluções, sujeitoo tecido a uma série de congelamento / descongelamento ciclos. Cuidadosamente colocar o tubo num recipiente com gelo seco e congelamento durante 30 min. Em seguida, remover o tubo e deixá-la à temperatura ambiente na bancada durante 15 minutos. O passo de congelamento / descongelamento deve ser realizada quatro vezes (pelo menos).
3. Após a última descongelamento do tecido, colocar o tubo num congelador -80 ° C durante a noite.
4. O tecido pode ser armazenado por períodos prolongados de tempo a -80 ° C, quer imediatamente antes ou depois dos passos de congelação / descongelação. Caso contrário, o protocolo deve ser continuado.

2,3 Dia 3:

1. Re-hidratar o cerebelo, lavando-o em 50% MeOH/50% de PBS, 15% MeOH/85% de PBS, e 100% de PBS durante 60-90 minutos cada à temperatura ambiente.
2. Em seguida, para o adulto rato cerebelos, sujeita o tecido a digestão enzimática com 10μg/ml proteinase K em PBS durante 2-3 minutos. No processo de digestão é necessária para cerebelo de animais jovens (P5 ou menos, no mouse). Mais digestion é sugerido para cérebros maiores. Por exemplo, a digestão pode ser tão elevada quanto 5-6 minutos para cérebros de primatas ^4.
3. Após a digestão, lave o cerebelo em PBS três vezes durante 10 minutos cada à temperatura ambiente para remover o K. Proteinase
4. Bloquear o tecido em PMT (ver Tabela 3) durante a noite a 4 ° C. Leite em pó é muitas vezes a primeira escolha quando se selecciona um agente de bloqueio para o trabalho de proteína porque é barato, reduz eficazmente a coloração de fundo, e tipicamente não interfere com a ligação do anticorpo ou o acesso ao antigénio. Soros de animais também podem ser usados, embora o experimentador deve estar ciente do custo adicional e deve primeiro testar a qualidade soro para com reactividade cruzada imunoglobulinas e capacidade para produzir um sinal ideal para relação de ruído.

2,4 Dia 4-5:

1. Incubar o tecido em anticorpos primários diluídos em DMSO PMT suplementadas com 5% durante 48 horas a 4 ° C (larger cerebelos exigirá tempos de incubação maiores).

2,5 Dia 6:

1. Lavar o cerebelo 2-3 vezes por 2-3 horas cada em PMT a 4 ° C para remover os anticorpos não ligados primários.
2. Em seguida, o tecido incubar em anticorpos secundários em uma solução contendo PMT com DMSO a 5% a 4 ° C durante a noite (maior cerebelos pode requerem tempos de incubação maiores).

2,6 Dia 7:

1. Lavar o cerebelo 2-3 vezes por 2-3 horas cada em PMT a 4 ° C.
2. Dar o tecido de uma lavagem final com PBT (ver Tabela 3) durante 1-2 horas. Este passo remove o excesso de leite e aumenta a clareza da coloração.
3. Finalmente, incubar o tecido em DAB (3,3 '-diaminobenzidina) solução até que a intensidade da coloração óptimo é atingido. O produto da reacção castanho deve ser claramente visíveis dentro ~ 10 minutos. É melhor usar DAB no escuro como a luz faz com que o cromógeno a precipitaçãote, o que pode aumentar a coloração de fundo.

2,7

Quando a intensidade de coloração óptimo é atingido, parar a reacção colocando o cerebelo em PBS com azida de sódio 0,04%. O tecido pode ser armazenada a longo prazo nesta solução. A azida de sódio é um potente inibidor do crescimento bacteriano, mas deve ser evitado até este passo como também inibe a peroxidase de rábano.

2,8 procedimento de amplificação opcional:

seguir o protocolo normal, mas estas etapas devem ser realizadas no local das etapas 2.5b-2.7 acima.

1. Incubar o tecido durante a noite a 4 ° C em biotina-anticorpos secundários conjugados em PBST (ver Tabela 3) com DMSO a 5%.
2. Lavar o tecido durante 2-3 horas cada em mudanças de 3-4 PBST à temperatura ambiente.
3. Incubar o cerebelo durante a noite a 4 ° C em solução de complexo ABC em PBST.
4. Lavar o tecido durante 2-3 horas cada emtemperatura ambiente em mudanças de PBS 3-4.
5. Incubar o tecido em recém-preparado solução DAB, como descrito acima.
6. Quando a coloração é óptima, parar a reacção por lavagem o cerebelo em PBS com azida de sódio 0,04%.

3. Imagem do tecido manchado

1. Imagens Wholemount pode ser capturada utilizando, por exemplo, uma Leica DFC3000 câmara FX montado sobre um estereomicroscópio Leica FA MZ16 executando Leica Application Suite software FX. Se desejado, a microscopia de desconvolução pode ser usada para adquirir múltiplas imagens consecutivas em diferentes planos focais, com cada imagem tendo apenas um único lóbulo em foco crocante. Em seguida, as imagens podem ser comprimidos em uma única pilha e software processado para remover a distorção. A imagem composta final irá ilustrar os padrões de expressão de superfície do cerebelo com toda a padronização visível no foco claro.
2. Tecido manchado Wholemount deve ser trabalhada enquanto imersa em PBS (ou outro meio que dará umíndice de refração ótimo). A fim de posicionar facilmente o wholemount para imagiologia, fazer um gel de agar a 1% em uma placa de Petri de plástico. Cortar pequenos orifícios no gel. Os furos vai permitir que o cerebelo de ser preso na orientação desejada.
3. Os dados brutos são importados para o Adobe Photoshop CS4 e ajustado para os níveis de contraste e brilho.

Animais

Todos os estudos em animais foram realizadas ao abrigo de um protocolo animal aprovado IACUC acordo com as diretrizes institucionais no Albert Einstein College of Medicine. Macho e fêmea outbred suíça Webster (Taconic, Albany, NY) os ratinhos foram mantidos no nosso colónia e utilizado para todos os estudos. Ratos adultos submetidos a eutanásia foram gentilmente cedidas pelo Dr. Bryen Jordan (Albert Einstein College of Medicine). Todos os animais foram pelo menos um mês de idade.

4. Os resultados representativos

O cerebelo é compartimentalizada pela expressão molecular em quatro zonas transversais:a zona anterior (AZ: ~ lóbulos IV), a zona central (CZ: ~ lóbulos VI-VII), a zona posterior (PZ: ~ lóbulos VIII-dorsal IX) e na zona de nodular (NZ: ~ lóbulos IX e X ventral ) 5. Cada zona contém um único conjunto de listras parasagital ^1,2,5,6 (Fig. 1). ZebrinII expressão em células de Purkinje revela listras no AZ e PZ (Fig. 2) e de expressão uniforme no CZ e NZ (Fig. 2). A organização parassagital de células de Purkinje é espelhada pela topografia campo terminal de fibras aferentes. Transcrição cocaína-anfetamina e regulamentado (CART) peptídeo é expresso em subconjuntos de fibras de escalada (Fig. 3) que se projetam para faixas de dendritos das células de Purkinje na camada molecular do córtex cerebelar ⁷ (Fig. 3b). Com as modificações adequadas, tais como amplificação ^7, o protocolo wholemount permite a visualização de padrões olivocerebellar sem a need para um laboriosos, tempo reconstruções consumir a partir de secções de tecido de coloração (Fig. 3b).

Figura 1. A. ZebrinII / aldolaseC expressão revela bandas sagitais em seções transversais do cerebelo. Barra de escala = 500 uM. B. ZebrinII / aldolaseC é expresso exclusivamente em Purkinje somata celular e dendritos. Barra de escala = 150μm (gl = camada granular; pcl = camada de células Purkinje; ml = camada molecular).

Figura 2. Um cerebelo wholemount coradas para ZebrinII / aldolaseC mostrando as listras de células de Purkinje em imagens do anterior (AZ), central (CZ), e posterior (PZ) zonas do cerebelo. Aqui também mostram um exemplo da consequência negativa da nicking o cerebelo. A coloração resultante artefactual é indicadocom asteriscos vermelhos. Barra de escala = 1 mm (LS = simplex lobulus; PML = paramediana lóbulo; COP = cópula Pyramidis).

Figura 3. CART A. é expressa em escalar terminais de fibras na camada molecular. Barra de escala = 100 mm. (Ml = camada molecular; pcl = camada de células Purkinje; gl = camada granular) B. imunohistoquímica Wholemount de expressão CART na NZ. Barra de escala = 2 mm (COP = cópula Pyramidis; PML = paramediana lóbulo; PFL = paraflocculus; FL = flóculus).

Discussion

Nós descrevemos os detalhes técnicos necessários para a coloração wholemount sucesso utilizando uma abordagem versátil imuno-histoquímica para expressão da proteína reveladora no cérebro em desenvolvimento e adultos. Usando esta abordagem, complexos moleculares padrões de expressão podem ser analisadas e topografia cérebro apreciado sem a necessidade de trabalhoso e demorado procedimentos de secção consumindo de tecidos.

Este protocolo foi usado para revelar a expressão padronizada de várias proteínas das células de Purkinje em ambos adulto, o ^1,2,8,9 e cerebelo do rato pós-natal ^10,11,12. Os nossos estudos originais também demonstrada a utilidade da abordagem wholemount pela análise de expressão de antigénios de células de grânulos e ^uma anterogradamente rastreados fibras musgosas ^2, que residem ~ 250 uM abaixo da superfície pial em camada granular. Além disso, vários estudos têm feito modificações no protocolo original para a coloração de proteínas bem sucedida icélulas de Purkinje n ^1,13 (recuperação de antigénio) e fibras aferentes ^7,14 (amplificação de sinal; Fig. 2.). Além disso, a coloração imuno-histoquímica wholemount também tem sido aplicado ao cerebelos de múltiplas ^4,15 mamíferos e de aves ^16,17 espécies, utilizados para mapear a perda de células de Purkinje modelado em modelos de ratos de doenças neurodegenerativas ^18,19, e modificado para corar coração ^20, pulmão ^21, nervos cranianos e nervos da córnea ^{22 23.} A partida principal do actual protocolo a partir de descrições anteriores do método de ^1,2 wholemount é que aqui nós fornecemos não apenas detalhes atualizados para um melhor sucesso na utilização do procedimento, mas também um guia completo para a fixação do tecido, dissecando o tecido e um em ilustração de vídeo profundidade da técnica.

Existem várias limitações de coloração wholemount. Em primeiro lugar, apenas padrões de superfície são tipicacamente visualizadas sem posterior dissecação e coloração ou sem aumentar a duração do tempo que o tecido é incubado em anticorpos. Além disso, a coloração não vai chegar no fundo do córtex se ele está escondido devido a ^1,2 foliação. No entanto, o tecido corado wholemount pode ser seccionado após processamento e restained, com o mesmo anticorpo ou outra, para revelar perfis de expressão celular mais profundo no interior da ^1,2 tecido. Em segundo lugar, o protocolo de coloração de base wholemount é longo. Sugerimos que cada experimentador determinar empiricamente a eficiência de coloração dos seus anticorpos e encurtar o tempo de pós-fixação, encurtar o número eo comprimento de lavagens, e / ou encurtar a duração da incubação em os anticorpos primários. Com esses ajustes o protocolo pode ser completada em um tempo consideravelmente menor. Em terceiro lugar, para cerebelos grande o protocolo de coloração wholemount requer grandes volumes de as soluções de anticorpos, que podem ser caros e / ou apenas disponível em quant limitadodades. No entanto, é possível guardar os anticorpos primários após cada ensaio por congelamento a solução a -20 ° C. Cada pesquisador terá que determinar se o anticorpo pode resistir à congelação antes de ser reutilizada. Conseguimos coradas tecido utilizando alíquotas previamente congeladas de zebrinII. Em quarto lugar, nem todos os anticorpos são compatíveis com a abordagem de base wholemount. Por exemplo, o anticorpo usado para detectar a expressão da proteína listrado pequeno choque térmico, HSP25, requer que o tecido ser primeiro processado para a recuperação de antigénio ^13. Independentemente disso, como para os cortes de tecido de coloração, os métodos tradicionais de solução de problemas de ligação anticorpo-antígeno também tem se mostrado útil para otimizar coloração wholemount.

Estamos atualmente explorando a possibilidade de adaptar o nosso protocolo wholemount para uso com fluorescente-etiquetados anticorpos secundários. Com o microscópio apropriado equipado com a capacidade de luoro imagem colorida diferenteHores em baixa potência, um seria capaz de não só analisar a organização de mapas de Purkinje vários celulares em um mesmo animal, mas também examinar a relação entre os padrões de células de Purkinje de banda e da topografia do WGA-Alexa rotulados fibras aferentes em três dimensões ^2,4.7,24. Além disso, a recente disponibilidade de bases de dados em larga escala de expressão gênica (Allen Cérebro Atlas, Genepaint, Brain mapa de expressão gênica) abriram novos caminhos para a incorporação de nossa abordagem wholemount alto rendimento com análises do genoma inteiro para analisar a topografia molecular de todo o cérebro.