Wholemount иммуногистохимии для выявления сложной топографии мозга

Summary

Нейронных цепей топографически организованы в функциональные отсеки с конкретным молекулярным профилей. Здесь мы предлагаем практические и технические меры для выявления глобальной топографии мозга с помощью универсального подхода wholemount иммуногистохимического окрашивания. Мы продемонстрировать полезность метода с помощью хорошо понятных цитоархитектонике и схема мозжечка.

Abstract

Повторяется и хорошо понимал сотовой архитектуры мозжечка делают его идеальной модели системы для изучения мозга топографии. В основе ее относительно равномерным цитоархитектонике это сложный комплекс парасагиттальных областях генов и экспрессии белков. Молекулярной фрагментации мозжечка отражается на анатомические и функциональные организации афферентных волокон. Чтобы в полной мере оценить сложность мозжечка организации мы ранее уточнены wholemount подход окрашивания высокой пропускной способности анализа паттернов дефектов мыши мозжечка. Этот протокол описывает подробно реактивы, инструменты и практические шаги, которые являются полезными для успешного выявление закономерностей экспрессии белка во взрослом мозжечке мыши с помощью wholemount окрашивания. Шаги, подчеркнул здесь продемонстрировать полезность этого метода с использованием выражения zebrinII / aldolaseC как пример того, как мелкий рельеф мозга могут быть выявлены вродной трехмерной конформации. Описываются также адаптации к протоколу, что позволяет для визуализации экспрессии белка в афферентных проекций и большой мозжечка для сравнительного исследования молекулярной топографии. Для иллюстрации этих приложений, данные из афферентных окрашивания мозжечка крысы включены.

Protocol

1. Перфузии животных и мозжечка Dissection

1. В зависимости от белка, перфузии могут быть необходимы для успешного ^1,2 окрашивания. Transcardiac перфузии является инвазивной, не выживание процедура, которая требует правильного использования анестетиков. Правильная подготовка, институциональное утверждение и одобрение IACUC все необходимые Перед процедурой. Это всегда хорошая идея консультироваться ветеринары учреждения, чтобы получить помощь в определении потребностей эксперимента и получения правильного обучения. Перед процедурой, животное должно быть глубоко под наркозом и не реагируют на стимулы, такие как ноги или хвост шнура. Используя ножницы сделать разрез в брюшной кожи и мышц стене, а затем продолжают открывать грудную клетку за счет сокращения только рядом с грудиной на каждой стороне. Кроме того, экспериментатор может создать больше внутреннего рабочего пространства за счет сокращения фасции окружающие диафрагмы. Поднимая брюшной и грудной стенки SuperIOжелезная дорога, сердце теперь будет подвергаться. Сделайте небольшой надрез в правом предсердии, чтобы позволить крови течь, и сразу же вставить перфузии иглу в левый желудочек. Основной насос гидростатической предпочтительнее поставить перфузионные растворы (см. таблицу 1 для подробностей). Во-первых, очистить кровь с фосфатным буферным раствором 0,1 (PBS, см. таблицу 3), пока жидкость не потечет чистая. Затем выключите гидростатический насос, быстро переключаться трубки решение доставки контейнеров на 4% параформальдегида (PFA, см. таблицу 3) разводят в PBS, а затем включить насос снова поставить фиксатор. Использование насоса не требуется: с практикой, два шприца заполненные PBS и 4% PFA может быть использован для доставки медленно решений.
2. Очень важно тщательно анализировать мозг из черепа без введения каких-либо повреждений на ткани. Даже небольшие разрывы в мозг во время вскрытия будет постепенно расширяться в видимые трещины, чтоловушка антител и вызвать искусственной окраски в процессе обработки тканей (например, звездочки красного рис. 2). Для вскрытия мозжечка, это характерно для порезать кожу вниз по середине головы, а затем аккуратно дразнить закрылки на части, чтобы подвергать черепа. Вырезать черепа спереди назад по средней линии спины, боков, а также по обе стороны черепа. Ничего не вырезано за темя, как это рискует уменьшение поперечного сечения мозжечка. Используя щипцы осторожно поднимите переднюю часть черепа от мозга стараясь не оторвать ткани головного мозга, который прилагается к мозговым оболочкам. Север черепных нервов на вентральной стороне головного мозга.
3. Разделение мозжечка от остальной части мозга важна по двум причинам. Во-первых, это позволяет для исследования экспрессии в передней дольки, которые скрыты от глаз холмов на месте. Во-вторых, разделение тканей на более мелкие, изолированных регионах позволяет мруды полной фиксации, которая может способствовать окрашивание некоторых белков. В течение этого последнего шага вскрытия, следует проявлять осторожность, чтобы не задеть мозжечка с концами пинцета. Вставьте концы пару щипцов в середине верхней и нижней холмов. С второго набора щипцы медленно дразнить от нижних холмов от мозжечка. Затем заложить мозжечка так, чтобы его передняя сторона вниз и мозга направлена ​​вверх. Вставьте щипцы в четвертый желудочек мозга между дольками и IX / X мозжечка. Отрежьте ножки, зажимая пинцетом с обеих сторон, а затем осторожно поднимите мозжечок от мозга. После того, мозжечок изолированы, пост-это исправить путем погружения в 4% PFA при 4 ° С в течение как минимум 24-48 часов. Мозжечка могут быть сохранены в 4% PFA в течение длительного периода времени. Оболочек должны быть удалены до или после окрашивания для лучшей видимости выражения моделей.Если экспериментатор выбирает для удаления оболочек перед окрашиванием есть большая вероятность, что мозжечок будет порезал во время процесса. Пилинг от мозговых оболочек в конце процедуры окрашивания намного проще, потому что они стали легче найти после того, как они приобретают слабое окрашивание фона и становятся хрупкими пост-обработки.

2. Обработка тканей для окрашивания Wholemount

Поскольку wholemount подход окрашивания занимает больше времени, чем иммуногистохимического окрашивания срезов тканей, полезно планировать сроки для каждого из экспериментов, как показано на примере календаря при условии (табл. 2). Прежде чем начать, есть несколько ключевых вещей, чтобы держать в уме. 1) микропробирок содержащие ткань должна быть повернута на nutator во все времена, за исключением замораживания / оттаивания процесса. 2) Некоторые решения должны быть свежим для каждого эксперимента (см. таблицу 3 для решения рецептов). 3)На протяжении протокола, при изменении решения, осторожно вылейте отработанный раствор, а не удаления мозжечка щипцами, чтобы не прикасаться мозжечка. Затем, после смешивания новое решение в другой контейнер, используйте пипетку осторожно добавить свежий раствор в пробирку.

2,1 1 день:

1. Закрепите мозжечка Fix ³ Дента при комнатной температуре в течение 6-8 часов качания мягко nutator. Если метанол является разрушительным для вашего антигена, можно заменить шаги 2,1 через 2.3a с методом поиска антигена. Тепло и буферов, используемых для поиска антигена поможет подготовить ткани антитела проникновения.
2. Bleach мозжечка в Bleach Дента ³ ночи при 4 ° C.

2,2 2 день:

1. Высушить мозжечка в два этапа в размере 100% метанола при комнатной температуре в течение 30 минут каждый.
2. Затем, в целях повышения проникновения решений, с учетомткани серии циклов замораживания / оттаивания. Аккуратно положите трубку в контейнер с сухим льдом и заморозить в течение 30 мин. Затем снимите трубку и оставьте при комнатной температуре на скамейке запасных в течение 15 минут. Замораживания / оттаивания шаг должен быть выполнен в четыре раза (по крайней мере).
3. После последнего таяния ткань, положите трубку в морозильной камере -80 ° С в течение ночи.
4. Ткани могут храниться в течение длительного периода времени при температуре -80 ° C либо непосредственно до или после замораживания / оттаивания шаги. В противном случае, в протоколе должны быть продолжены.

2,3 3 день:

1. Увлажняет мозжечка путем промывания его в 50% MeOH/50% PBS, 15% MeOH/85% PBS, и 100% PBS в течение 60-90 минут при комнатной температуре.
2. Далее, для взрослой мыши мозжечка, при условии ткани ферментативного расщепления 10μg/ml протеиназы K в PBS в течение 2-3 минут. Нет пищеварения шаг необходим для мозжечка молодых животных (P5 или моложе мыши). Более digestioп предложил для увеличения мозга. Например, пищеварение может быть выше, чем 5-6 минут для приматов мозг ^4.
3. После того, как пищеварение, немедленно промойте мозжечка в PBS в три раза по 10 минут при комнатной температуре, чтобы удалить протеиназы К.
4. Блок ткани в PMT (см. таблицу 3) в течение ночи при 4 ° C. Сухое молоко часто является первым выбором при выборе блокирующий агент белка работу, потому что это недорого, эффективно снижает фон окраски и обычно не влияет на связь или доступ антител с антигеном. Животные сыворотки также может быть использован, хотя экспериментатор должен знать добавленную стоимость и должен сначала проверить качество сыворотки для кросс-реактивный иммуноглобулинов и способность производить оптимальное соотношение сигнал-шум.

2,4 День 4-5:

1. Инкубируйте ткани в первичных антител разводят в ФЭУ с добавлением 5% ДМСО в течение 48 часов при температуре 4 ° C (крупэ мозжечка потребуется увеличить время инкубации).

2,5 6 день:

1. Вымойте мозжечка 2-3 раза в течение 2-3 часов каждый ФЭУ при 4 ° С для удаления несвязанных первичных антител.
2. Затем, инкубировать ткани вторичных антител в растворе, содержащем ФЭУ с 5% ДМСО при температуре 4 ° С в течение ночи (больший мозжечка может потребовать увеличения время инкубации).

2,6 День 7:

1. Вымойте мозжечка 2-3 раза в течение 2-3 часов каждый ФЭУ при 4 ° C.
2. Дайте ткани последней промывки с PBT (см. таблицу 3) в течение 1-2 часов. Этот шаг удаляет избыток молока и повышает четкость окрашивания.
3. Наконец, инкубировать ткани DAB (3,3 '-диаминобензидина) раствора до оптимальной интенсивности окрашивания достигается. Коричневый продукт реакции должен быть отчетливо виден в течение ~ 10 минут. Лучше всего использовать DAB в темноте, как свет вызывает хромоген к осадковте, которые могут увеличить фоне пятен.

2,7

При оптимальной интенсивности окрашивания достигается, остановить реакцию размещения мозжечка в PBS с 0,04% азида натрия. Ткань может быть сохранен долгосрочный этого решения. Азид натрия является мощным ингибитором роста бактерий, но следует избегать до этого шага, поскольку она также ингибирует пероксидазу хрена.

2,8 Дополнительные процедуры усиления:

следить нормальный протокол, но эти шаги должны быть выполнены в месте шагов 2.5b-2.7 выше.

1. Инкубируйте ткань в течение ночи при 4 ° С в биотин-сопряженных вторичными антителами в PBST (см. Таблицу 3) с 5% ДМСО.
2. Промойте ткань в течение 2-3 часов в 3-4 изменения PBST при комнатной температуре.
3. Инкубируйте мозжечка ночи при 4 ° С в ABC комплексное решение в PBST.
4. Промойте ткань в течение 2-3 часов вкомнатной температуре в течение 3-4 изменения PBS.
5. Инкубируйте ткани свежеприготовленные DAB решение, как описано выше.
6. При окрашивании является оптимальным, остановить реакцию стиральная мозжечка в PBS с 0,04% азида натрия.

3. Визуализация Витраж тканей

1. Wholemount изображения могут быть получены с помощью, например, Leica DFC3000 FX камеры, установленной на Leica MZ16 FA стереомикроскоп Leica работы приложений FX программного обеспечения. При желании деконволюции микроскопии может быть использован для приобретения нескольких последовательных изображений в различных фокальных плоскостях, при этом каждый образ, имеющий только одну дольку в четкий фокус. Затем, изображения могут быть сжаты в единый стек и программного обеспечения оказали удалить искажения. Окончательное составное изображение иллюстрирует мозжечковой модели выражение поверхность со всеми видимыми структурирование в четкий фокус.
2. Wholemount ткани окрашенные должны быть отображены в то время как погруженный в PBS (или другой носитель, который дастоптимальный показатель преломления). Для того, чтобы легко позиционировать wholemount для работы с изображениями, чтобы 1% геле агара в пластиковой чашке Петри. Вырежьте маленькие отверстия в геле. Отверстия позволит мозжечка отклоняться в нужную ориентацию.
3. Первичные данные импортируются в Adobe Photoshop CS4 и с учетом контраста и яркости.

Животные

Все животные были проведены исследования по утвержденному протоколу IACUC животных в соответствии с руководящими принципами институциональной колледже Альберта Эйнштейна медицины. Мужчина и женщина беспородных швейцарский Вебстер (Taconic, Олбани, Нью-Йорк) мышей сохраняется в нашей колонии, и для всех исследований. Эвтаназии взрослых крыс были любезно предоставлены доктором Bryen Иордания (Альберт Эйнштейн медицинский колледж). Все животные, по крайней мере один месяц.

4. Представитель Результаты

Мозжечка делится на ячейки на молекулярном выражение в четырех поперечных зон:передней зоне (А-Я: ~ долек IV), в центральной зоне (CZ: ~ дольки VI-VII), задние зоны (ПЗ: ~ дольки VIII-IX спинной) и узловой зоне (Новая Зеландия: ~ дольки IX и X вентральной ) 5. Каждая зона содержит уникальный массив парасагиттальных полосы ^1,2,5,6 (рис. 1). ZebrinII экспрессии в клетках Пуркинье показывает полосы в АЗ и PZ (рис. 2) и равномерное выражение в Чехии и Новой Зеландии (рис. 2). Парасагиттальных организации клеток Пуркинье отражается на терминале топография области афферентных волокон. Кокаин и амфетамин-регулируемый транскрипт (CART) пептид выражается в подмножества восхождение волокон (рис. 3а), что проект полосы дендритов клеток Пуркинье в молекулярном слое коры мозжечка ⁷ (рис. 3б). При соответствующей модификации, такие как усиление ⁷ wholemount протокол позволяет визуализировать olivocerebellar модели без урожденнаяг для трудоемкий, занимающий много времени реконструкции с окрашиванием срезов ткани (рис. 3б).

Рисунок 1. А. ZebrinII / aldolaseC выражение показывает, сагиттальной полосы в поперечном сечении мозжечка. Шкала бар = 500 мкм. Б. ZebrinII / aldolaseC выражается исключительно в Пуркинье somata клетки и дендриты. Шкала бар = 150 мкм (GL = зернистого слоя, PCL = клеток Пуркинье слоя; мл = молекулярного слоя).

Рисунок 2. Wholemount мозжечка окрашивали ZebrinII / aldolaseC показывает полосы клеток Пуркинье в образах передних (А-Я), центральный (Чехия) и задний (PZ) зонах мозжечка. Здесь мы также покажем пример негативным последствием уменьшение поперечного сечения мозжечка. В результате искусственной окраски указываетс красными звездочками. Шкала бар = 1 мм (LS = lobulus симплекс, PML = парамедианной дольки, COP = связка pyramidis).

Рисунок 3. А. корзину выражается в скалолазании волокна терминалов в молекулярный слой. Шкала бар = 100 мкм. (Мл = молекулярный слой, PCL = слой клеток Пуркинье, GL = зернистого слоя) B. Wholemount иммуногистохимии ТЕЛЕГИ выражение в Новой Зеландии. Шкала бар = 2 мм (КС = связка pyramidis; PML = парамедианной дольки; ПФЛ = paraflocculus, FL = хлопья).

Discussion

Мы описали технические детали, необходимые для успешного окрашивания wholemount помощью универсальной иммуногистохимический подход для выявления экспрессии белка в развивающемся и взрослом мозге. Используя этот подход, сложных молекулярных моделей выражения могут быть проанализированы и оценены топографии мозга без необходимости трудоемкого и трудоемким процедурам срезов тканей.

Этот протокол был использован для выявления узорной выражение из нескольких белков клетки Пуркинье в обоих взрослых ^1,2,8,9 и раннем послеродовом мозжечка мыши ^10,11,12. Наши оригинальные исследования также показали полезность wholemount подход для изучения ЗК экспрессии антигенов ¹ и anterogradely прослеживается мшистых волокон ^2, который находится ~ 250 мкм ниже пиальных поверхности зернистого слоя. Кроме того, несколько исследований, сделали изменения в первоначальный протокол для успешного окрашивания белков яN клеток Пуркинье ^1,13 (антиген поиска) и афферентные волокна ^7,14 (усиление сигнала, рис 2.). Кроме того, wholemount иммуногистохимического окрашивания применяется также к мозжечка нескольких млекопитающих и птиц ^{4,15 16,17} виды, используемые для карты рисунком потеря клеток Пуркинье в мышиных моделях нейродегенеративных заболеваний, ^18,19, и изменение в сердце пятно ^20, легких ^21, черепно-мозговых нервов роговицы ²² и нервов ^23. Основной уход текущий протокол от предыдущего описания wholemount ^1,2 метода является то, что здесь мы предоставляем не только обновленную информацию для лучшего успеха при использовании процедуры, а также полное руководство для крепления ткани, рассечение тканей и в Глубина иллюстрации видео техники.

Есть несколько ограничений wholemount окрашивания. Во-первых, только модели поверхности типичнойчески визуализируется без дальнейшего вскрытия и окрашивания или без увеличения времени, что ткань инкубировали в антителами. Кроме того, окрашивание не проникают глубоко в коре, если он скрыт из-за слоения ^1,2. Тем не менее, wholemount окрашенных тканях можно разделить после обработки и restained, с тем же антителом или иначе, раскрыть клеточный профиль выражения в глубине тканей ^1,2. Во-вторых, основной протокол окрашивания wholemount долго. Мы предполагаем, что каждый экспериментатор эмпирически определить окрашивания эффективности их антителами и сократить после фиксации времени, сократить количество и продолжительность мойки и / или сократить продолжительность инкубации в первичных антител. С этим корректировки протокол может быть завершена в значительно более короткие сроки. В-третьих, для больших мозжечка wholemount протокол окрашивания требует больших объемов антител решений, которые могут быть дорогими и / или доступны только в ограниченном квантities. Тем не менее, можно сохранить первичных антител после каждого запуска путем замораживания раствора при -20 ° C. Каждый экспериментатор будет определить, является ли их антитела могут выдерживать замораживание до его повторного использования. Мы успешно окрашивают ткани, используя ранее замороженные аликвоты zebrinII. В-четвертых, не все антитела, которые совместимы с основными wholemount подход. Например, антитела широко используются для определения полосатый выражение малого белка теплового шока, HSP25, требует, чтобы ткань быть предварительно обработаны для поиска антигена ^13. Несмотря на это, как для окрашивания срезов тканей, традиционные методы поиска и устранения неисправностей антиген-антитело обязательным также оказались полезными для оптимизации wholemount окрашивания.

Настоящее время мы изучаем возможность адаптации наших wholemount протокол для использования с люминесцентными с метками вторичными антителами. С соответствующим микроскоп с возможностью изображения разноцветных fluorophores при низкой мощности, можно было бы иметь возможность не только проанализировать организацию нескольких клеток Пуркинье карты того же животного, но и изучение взаимосвязи между клеток Пуркинье полосы модели и топографии WGA-Alexa меченых афферентных волокон в трех измерениях ^2,4.7,24. Кроме того, недавно наличие крупных баз данных масштаба выражение генов (Allen мозга Атлас, Genepaint, Brain экспрессии генов Map) открыли новые возможности для объединения наших высоких подход wholemount пропускную целом анализ генома для изучения молекулярной топографии весь мозг.