Wholemount Immunohistokemi för att avslöja Complex Brain Topography

Summary

Nervbanor är topografiskt organiserade i funktionella fack med specifika molekylära profiler. Här ger vi de praktiska och tekniska åtgärder för att avslöja den globala hjärnan topografi med hjälp av en mångsidig wholemount immunhistokemisk färgning strategi. Vi demonstrerar användbarheten av metoden med användning av väl förstått cellarkitekturen och kretsarna i lillhjärnan.

Abstract

Den upprepade och väl förstod cellulär arkitektur lillhjärnan gör det till en idealisk modell för att utforska hjärnan topografi. Bakom den relativt enhetliga cellarkitekturen är en komplex uppsättning parasagittal domäner gen-och proteinuttryck. Den molekylära uppdelning av lillhjärnan speglas av anatomiska och funktionella organisation afferenta fibrer. För att till fullo uppskatta komplexiteten i lillhjärnan organisation vi förfinat tidigare en wholemount färgning metod för hög genomströmning analys av mönstring defekter i musen lillhjärnan. Detta protokoll beskriver i detalj de reagens, verktyg och praktiska åtgärder som är användbara för att framgångsrikt avslöja mönster proteinuttryck i den vuxna möss lillhjärnan med wholemount immunfärgning. De steg som lyfts fram här visar nyttan av denna metod att använda uttrycket av zebrinII / aldolaseC som ett exempel på hur den fina topografi hjärnan kan avslöjas i sinnativa tredimensionella konformation. Också beskrivet är anpassningar till protokollet att möjliggöra visualisering av proteinuttryck i afferenta prognoser och stora cerebella för jämförande studier av molekylära topografi. För att illustrera dessa program är data från afferenta färgning av råttcerebellum ingår.

Protocol

1. Animal perfusion och Cerebellum Dissection

1. Beroende på proteinet, kan perfusion vara avgörande för en framgångsrik färgning ^1,2. Transkardial perfusion är en invasiv och icke-överlevnad förfarande som kräver en korrekt användning av bedövningsmedel. Korrekt utbildning, institutionella godkännande och lACUC godkännande är alla nödvändiga innan proceduren. Det är alltid en god idé att konsultera institutionens veterinärer för att få hjälp att identifiera experimentella krav och skaffa rätt utbildning. Innan förfarandet bör djuret vara djupt sövd och inte svarar på stimuli såsom mul eller svans nypa. Med sax gör ett snitt i buken huden och muskel väggen och sedan fortsätta att öppna bröstkorgen genom att skära precis intill bröstbenet på varje sida. Dessutom kan den som utför experimentet skapa en större inre arbetsutrymmet genom att skära fascia omger membranet. Genom att lyfta mag-och bröstkorg väggen Superiorly kommer hjärtat nu exponeras. Göra ett litet snitt i höger förmak för att tillåta blod att strömma ut och omedelbart in perfusionen nålen in i den vänstra ventrikeln. En grundläggande hydrostatisk pump är föredraget att leverera de perfusionslösningar (se tabell 1 för detaljer). Först, spola blodet ut med 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS, se tabell 3) tills vätskan är klart. Stäng sedan den hydrostatiska pumpen snabbt växla röret lösningen leverans till en behållare med 4% paraformaldehyd (PFA, se tabell 3) utspädd i PBS och slå sedan på pumpen igen för att leverera fixativ. Användningen av en pump är inte nödvändigt: med praktiken två sprutor fyllda med den PBS och 4% PFA kan användas för att långsamt avge de lösningar.
2. Det är kritiskt att noggrant dissekera hjärnan av skallen utan att införa några lesioner på vävnaden. Även små sår till hjärnan under dissektionen successivt expandera synliga sprickor somfälla antikroppar och orsaka artefaktuella färgning under bearbetningen av vävnaden (t.ex. röd asterisk i figur 2). För cerebellära dissektioner, är det typiskt att skära in i huden i mitten av huvudet och sedan försiktigt retas flikarna isär för att exponera skallen. Skära skallen från anterior till posterior längs den dorsala mittlinjen och också i sidled längs båda sidor av skallen. Klipp inte utanför bregma eftersom det riskerar att hackning lillhjärnan. Använd pincett försiktigt lyfter den främre delen av skallen från hjärnan var noga med att inte slita undan hjärnvävnaden som är ansluten till hjärnhinnorna. Avskära de kraniala nerverna på den ventrala sidan av hjärnan.
3. Separation av cerebellum från resten av hjärnan är viktigt av två skäl. Först gör det för utforskning av uttryck mönster i främre lobules, som döljs av colliculi in situ. Den andra är att separera vävnaden i mindre, isolerade regioner möjliggör mmalm fullständig fixering, vilket kan underlätta färgningen av vissa proteiner. Under hela denna sista dissektion steg bör försiktighet iakttas för att inte röra lillhjärnan med spetsarna på pincetten. Sätt spetsar en pincett i mitten av de överlägsna och underlägsna colliculi. Med en andra uppsättning av pincett retas långsamt bort den nedre colliculi från lillhjärnan. Sedan låg lillhjärnan så att dess främre sidan är vänd nedåt och hjärnstammen pekar uppåt. Sätt tången i fjärde ventrikeln mellan hjärnstammen och lobules IX / X lillhjärnan. Skär skaft genom att nypa med pincetten på båda sidor och sedan försiktigt lyfta lillhjärnan från hjärnstammen. När väl cerebellum isoleras, efter-fixera den genom nedsänkning i 4% PFA vid 4 ° C under ett minimum av 24-48 timmar. Lillhjärnan kan lagras i 4% PFA under en utsträckt tidsperiod. Meningerna skall avlägsnas antingen före eller efter färgning för bättre sikt av uttrycksmönstren.Om den som utför experimentet väljer att avlägsna meningerna innan färgning finns det en stark möjlighet att den lillhjärnan kommer att nicked under processen. Peeling bort hjärnhinnorna i slutet av färgningsproceduren är mycket enklare eftersom de blir lättare att hitta när de får svaga bakgrundsfärgning och bli svaga efterbearbetning.

2. Behandling av Mjukpapper för Wholemount färgning

Eftersom wholemount färgningen strategi tar längre tid än immunhistokemisk färgning av vävnadssnitt, är det bra att planera tidslinjen för varje experiment som visas i exemplet kalendern som (tabell 2). Innan du börjar, finns det flera viktiga saker att tänka på. 1) De mikrorör innehållande vävnaden skall rullas på en nutator vid alla tidpunkter utom under frysnings / tinings-förfarande. 2) Flera lösningar måste göras färsk varje experiment (se tabell 3 för lösning recept). 3)I hela protokollet, vid byte av lösningar, försiktigt hälla ut den förbrukade lösning snarare än att ta bort lillhjärnan med pincett för att undvika att röra vid lillhjärnan. Sedan, efter blandning av den nya lösningen i en annan behållare, använda en pipett för att försiktigt tillsätta färsk lösning till röret.

2,1 Dag 1:

1. Fäst lillhjärnan i Dent: s fix ³ i rumstemperatur i 6-8 timmar gunga försiktigt på nutator. Om metanol är destruktivt för din antigen, överväga att ersätta stegen 2.1a via 2.3a med ett antigenåtervinning metod. Värmen och buffertar används för antigenåtervinning kommer att förbereda vävnaden för antikropp penetration.
2. Bleach lillhjärnan i Dent: s Bleach ³ natten vid 4 ° C.

2,2 Dag 2:

1. Dehydratisera lillhjärnan i två omgångar av 100% MeOH vid rumstemperatur under 30 min vardera.
2. Sedan, för att förhöja penetrationen av lösningarna, under förutsättningvävnaden till en serie av frysnings / tiningscykler. Försiktigt placera röret i en behållare med torr is och frysa i 30 minuter. Ta sedan bort röret och lämna den i rumstemperatur på bänken i 15 minuter. Frys / tö steget bör utföras fyra gånger (åtminstone).
3. Efter den sista upptining av vävnaden genom att placera röret i en -80 ° C frys över natten.
4. Vävnaden kan lagras under förlängda tidsperioder vid -80 ° C, antingen före eller efter frysning / tining steg. Annars bör protokollet skall fortsätta.

2,3 Dag 3:

1. Rehydratisera cerebellum genom att tvätta den i 50% MeOH/50% PBS, 15% MeOH/85% PBS och 100% PBS under 60-90 minuter vardera vid rumstemperatur.
2. Därefter för en vuxen mus cerebella, förutsatt att vävnaden för enzymatisk digerering med 10 M-g/ml Proteinas K i PBS under 2-3 minuter. Ingen nedbrytning steg är nödvändig för cerebella av unga djur (P5 eller yngre i mus). Längre digestion föreslås för större hjärnor. Till exempel kan matsmältningen vara så hög som 5-6 minuter för primater hjärnor ^4.
3. Efter digerering, skölj cerebellum i PBS tre gånger under vardera 10 minuter vid rumstemperatur för att avlägsna det proteinas K.
4. Blockera den vävnad i PMT (se tabell 3) över natten vid 4 ° C. Mjölkpulver är ofta det första valet när man väljer en blockerande medel för protein arbete eftersom det är billigt, effektivt sänker bakgrundsfärgning, och typiskt inte stör antikroppsbindning eller tillträde till antigenet. Animaliska serum kan också användas, även om försöksledaren bör vara medveten om den tillkommande kostnaden och måste först testa serum kvalitet för korsreaktiva immunoglobuliner och förmåga att producera en optimal signal-brusförhållande.

2,4 Dag 4-5:

1. Inkubera vävnaden i primära antikroppar utspädda i PMT kompletterat med 5% DMSO i 48 timmar vid 4 ° C (largER cerebella kommer att kräva ökade inkubationstider).

2,5 Dag 6:

1. Tvätta cerebellum 2-3 gånger under 2-3 timmar vardera vid PMT vid 4 ° C för att avlägsna obundna primära antikroppar.
2. Därefter, inkuberas vävnaden i sekundära antikroppar i en lösning innehållande PMT med 5% DMSO vid 4 ° C över natten (större cerebella kan kräva ökad inkubationstider).

2,6 Dag 7:

1. Tvätta cerebellum 2-3 gånger under 2-3 timmar vardera vid PMT vid 4 ° C.
2. Ge vävnaden en slutlig tvätt med PBT (se tabell 3) under 1-2 timmar. Detta steg tar bort överflödig mjölk och ökar tydligheten i färgning.
3. Slutligen inkubera vävnaden i DAB (3,3 '-diaminobensidin) lösning tills optimal färgningsintensitet uppnås. Den bruna Reaktionsprodukten ska vara tydliga i ca 10 minuter. Det är bäst att använda DAB i mörker som ljus gör kromogen för nedfallte, som kan öka bakgrundsfärgning.

2,7

När den optimala färgningsintensitet nås, stoppa reaktionen genom att placera lillhjärnan i PBS med 0,04% natriumazid. Vävnaden kan lagras långvarig i denna lösning. Natriumazid är en potent hämmare av bakteriell tillväxt, men bör undvikas tills detta steg, eftersom det också inhiberar pepparrotsperoxidas.

2,8 Valfritt amplifieringsförfarandet:

Följ normala protokollet men dessa åtgärder bör genomföras i stället för steg 2,5 b-2.7 ovan.

1. Inkubera vävnaden över natten vid 4 ° C i biotin-konjugerade sekundära antikroppar i PBST (se tabell 3) med 5% DMSO.
2. Skölj vävnaden under 2-3 timmar vardera vid 3-4 byten av PBST vid rumstemperatur.
3. Inkubera cerebellum natten vid 4 ° C i ABC-komplex-lösning i PBST.
4. Skölj vävnaden i 2-3 timmar vardera vidrumstemperatur i 3-4 byten av PBS.
5. Inkubera vävnaden i nyframställd DAB-lösning, såsom beskrivits ovan.
6. När färgningen är optimala, stoppa reaktionen genom att tvätta lillhjärnan i PBS med 0,04% natriumazid.

3. Imaging det färgade Tissue

1. Wholemount bilder kan fångas med hjälp av till exempel monterat en Leica DFC3000 FX kamera på en Leica MZ16 FA stereomikroskop kör Leica Application Suite FX programvara. Om så önskas kan avfaltning mikroskopi kan användas för att förvärva flera bilder i följd i olika fokalplan, med varje bild endast har en enda lob i skarp fokus. Sedan kan bilderna komprimeras till en enda stapel och mjukvara gjort för att ta bort distorsion. Den slutliga sammansatt bild illustrerar cerebellära mönster yta uttryck med allt synligt mönster i tydligt fokus.
2. Wholemount färgade vävnader bör avbildas samtidigt fördjupa dig i PBS (eller annat medium som ger enoptimala brytningsindex). För att lätt placera wholemount för avbildning, gör en 1% agar-gel i en petriskål av plast. Skära små hål in i gelén. Hålen tillåter cerebellum att kilas in i den önskade orienteringen.
3. Rådata importeras i Adobe Photoshop CS4 och justerat för kontrast och ljusstyrka nivåer.

Djur

Samtliga djurstudier utfördes under en godkänd lACUC djur protokollet enlighet med de institutionella riktlinjerna vid Albert Einstein College of Medicine. Manliga och kvinnliga utavlat schweiziska Webster (Taconic, Albany, NY) möss bibehölls i vår koloni och används för alla studier. Euthanized vuxna råttor vänligen tillhandahållen av Dr Bryen Jordan (Albert Einstein College of Medicine). Alla djur var minst en månad gammal.

4. Representativa resultat

Lillhjärnan kompartmentaliseras av molekylär uttryck i fyra tvärgående zoner:den främre zonen (Ö: ~ lobulus IV), den centrala zonen (CZ: ~ lobulus VI-VII), den bakre zonen (PZ: ~ lobulus VIII-dorsala IX) och den nodulära zonen (NZ: ~ lobulus IX ventrala och X ) 5. Varje zon innehåller en unik samling av parasagittal ränder ^1,2,5,6 (Fig. 1). ZebrinII expression i Purkinje-celler avslöjar ränderna i AZ och PZ (fig 2) och enhetligt uttryck i CZ-och NZ-(fig. 2). Den parasagittal organisation Purkinje celler speglas av terminalen området topografi afferenta fibrer. Kokain-amfetamin och reglerad transkript (CART)-peptiden uttrycks i delmängder av klättrande fibrer (fig 3a) som skjuter till remsor av Purkinje-celler dendriter i den molekylära skiktet i cerebellar cortex ⁷ (fig 3b). Med lämpliga modifieringar, såsom amplifiering ^7, tillåter wholemount protokoll för visualisering av olivocerebellar mönster utan need för en arbetskrävande, tidsödande rekonstruktioner från fläckning vävnadssnitt (fig. 3b).

Figur 1. A. ZebrinII / aldolaseC uttryck visar sagittala band i tvärgående snitt i cerebellum. Skalstreck = 500 ^ m. B. ZebrinII / aldolaseC uttrycks enbart i Purkinje-cell somata och dendriter. Skala bar = 150 pm (gl = granulärt skikt; PCL = Purkinje cellagret, ml = molekylär layer).

Figur 2. En wholemount lillhjärnan färgas för ZebrinII / aldolaseC visar Purkinje cell ränder i bilder av den främre (AZ), central (CZ) och bakre (PZ) zoner i lillhjärnan. Här visar vi också ett exempel på den negativa konsekvensen av hackning cerebellum. Den resulterande artefaktuella färgning indikerasmed röda asterisker. Skala bar = 1 mm (LS = lobulus simplex; PML = paramedian lob; COP = copula pyramidis).

Figur 3. A. CART uttrycks i klättring fiber terminaler i den molekylära lagret. Skala bar = 100 m. (Ml = molekylär lagret; PCL = Purkinje cellagret, gl = granulärt skikt) B. Wholemount immunohistokemi av antiretroviral uttryck i NZ. Skala bar = 2 mm (COP = copula pyramidis; PML = paramedian lob; PFL = paraflocculus; FL = flocculus).

Discussion

Vi har beskrivit de tekniska uppgifter som krävs för en lyckad wholemount färgning med hjälp av en mångsidig immunhistokemisk metod för avslöjande protein uttryck i utvecklande och vuxna hjärnan. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan komplexa molekylära uttryck mönster analyseras och hjärnan topografi uppskattade utan mödosamma och tidskrävande vävnad snittning.

Detta protokoll har använts för att avslöja den mönstrade uttrycket av flera Purkinje cellproteiner i både vuxna och ^1,2,8,9 tidiga postnatala möss cerebellum ^10,11,12. Vår ursprungliga studier visade också användbarheten av wholemount tillvägagångssätt för att pröva granul uttryck cellantigen ¹ och anterogradely spåras mossfibrer ^2, som vistas ~ 250 | im under pial ytan i granulära skiktet. Dessutom har flera studier gjort ändringar i det ursprungliga protokollet för framgångsrik färgning av proteiner in Purkinje celler ^1,13 (antigenåtervinning) och afferenta fibrer ^7,14 (signalförstärkning, Fig. 2.). Dessutom har wholemount immunhistokemisk färgning också tillämpas på cerebella av flera däggdjur ^4,15 och aviär ^16,17 arter, som används för att kartlägga mönstrade Purkinje cell förlust i musmodeller för neurodegenerativa sjukdomar ^18,19, och modifierade för att färga mitt ^20-, lung- ^21, kranialnerver ²² och hornhinnans nerver ^23. Den största avgången av det nuvarande protokollet från tidigare beskrivningar av wholemount metoden ^1,2 är att vi här ger inte bara uppdaterade detaljer för bättre framgång när du använder förfarandet, men också en komplett guide för att fixera vävnad, dissekera vävnaden och en i djup video illustration av tekniken.

Det finns flera begränsningar wholemount färgning. Första, enda ytmönster är typiskttiskt visualiserades utan ytterligare dissekering och färgning eller utan ökning av längden av tid att vävnaden inkuberas i antikroppar. Vidare kommer färgning inte att nå djupt inne i cortex om det är dolt på grund av foliering ^1,2. Emellertid kan wholemount färgades vävnad sektioneras efter bearbetning och restained, med samma antikropp eller en annan, för att avslöja cellulära expressionsprofiler djupare i vävnaden ^1,2. För det andra är den grundläggande wholemount färgningsprotokollet lång. Vi föreslår att varje försöksledaren empiriskt bestämma den färgning effektiviteten i antikroppar och förkorta tiden efter fixering tid, förkorta antalet och längden av tvättarna, och / eller förkorta längden av inkubation i de primära antikropparna. Med dessa justeringar i protokollet kan fyllas i en betydligt kortare ledtid. Tredje för stora cerebella att wholemount färgningsprotokollet kräver stora volymer av antikroppar lösningar, vilket kan vara dyrt och / eller endast i begränsad kvantitetersamhet. Emellertid är det möjligt att spara de primära antikropparna efter varje körning genom frysning av lösningen vid -20 ° C. Varje försöksledaren måste avgöra om deras antikroppar tål frysning innan den återanvänds. Vi har framgångsrikt färgas vävnad med hjälp av frysts alikvoter av zebrinII. Fjärde, inte alla antikroppar är kompatibla med den basiska wholemount tillvägagångssätt. Exempelvis kräver den antikropp som vanligen används för att detektera den randiga expression av den lilla värmechockprotein, HSP25, att vävnaden först behandlas för antigenåtervinning ^13. Oberoende, som för färgning vävnadssnitt har traditionella metoder för felsökning antikropp-antigenbindning visat också användbara för att optimera wholemount färgning.

Vi undersöker för närvarande möjligheten att anpassa vår wholemount protokollet för användning med fluorescerande-märkta sekundära antikroppar. Med den lämpliga mikroskop utrustat med möjligheten att avbilda olika färgade fluoropHores enligt strömsnål, skulle man kunna inte bara analysera organisationen av flera kartor Purkinje cell i samma djur, men också undersöka förhållandet mellan Purkinje mönster celler rand och topografi WGA-Alexa märkta afferenta fibrer i tre dimensioner ^2,4.7,24. Dessutom senaste tillgången av stora uttryck skala gendatabaser (Allen Brain Atlas, Genepaint, Brain Gene Expression Map) har öppnat nya vägar för att slå samman vår höga strategi genomströmning wholemount med hela genomet analyser för att undersöka molekylära topografi hela hjärnan.