Summary
在细胞周期各阶段的进展和动力学跟踪微妙的变化，可以实现通过碘化丙啶与BrdU和总DNA染色核酸代谢标记的组合使用。这种方法避免了化学循环细胞同步的需要，从而防止非特异性的DNA损伤，这反过来又影响细胞周期进程的介绍。
Abstract
通过细胞周期的各个阶段的启动和后续进展的精确控制细胞增殖至关重要。细胞周期分裂，生长和繁殖和细胞周期的关键组成部分的放松管制已在诱发癌变1,2事件有牵连的一个组成部分。分子药物抗癌疗法经常针对负责监管和协调细胞周期分裂3的生物学途径。虽然细胞周期动力学往往根据不同细胞类型，细胞之间的细胞周期的四个阶段的分布是一致而不是在一个特定的细胞株，由于一贯的有丝分裂和生长因子的表达。遗传毒性事件和其他细胞的压力可导致细胞周期进程的一个临时块，在逮捕或在一个特定的细胞周期阶段的暂时停止导致允许instigation适当的反应机制。
实验观察与参考其细胞周期的进展阶段的细胞群的行为的能力是在细胞生物学的重要进展。常见的程序，如丝分裂摆脱，差速离心法或流式细胞仪为基础的排序是用于分离细胞，细胞周期的特定阶段4-6。这些分馏，细胞周期，丰富的人口，然后试验性治疗。产量，纯度和分离组分的可行性，可以经常使用这些物理的分离方法受到损害。同时，分离的细胞群，并开始实验性治疗，使分馏细胞可以进步，从选定的细胞周期阶段之间的时间间隔，可以构成重大的挑战在这些实验的成功实施和解释。
ST其他方法的UDY细胞周期阶段包括化学品的使用同步细胞。治疗的细胞，每个细胞周期阶段的关键代谢过程中的化学抑制剂阻止细胞周期进展到下一阶段的有用。例如，核苷酸还原酶抑制剂羟基脲停止在G1 / S期交界处的细胞限制供应脱氧核苷酸，DNA的积木。其他著名的化学品包括用aphidicolin治疗，G1期阻滞聚合酶阿尔法抑制剂，与秋水仙碱和诺考达唑治疗，这两种干扰有丝分裂纺锤体的形成，以停止在M期细胞，最后，治疗与DNA链终止5-fluorodeoxyridine的启动S期阻滞7-9。这些化学品的处理是同步在某个特定阶段的一个细胞的整个人口的有效手段。去除与化学，细胞归队齐声细胞周期。测试代理以下释放的治疗从细胞周期的阻断化学，确保引起的药物反应是从一个统一的，细胞周期的特定阶段的人口。然而，由于许多化学同步器是已知的基因毒性化合物，戏弄除了参与各种反应途径（与测试代理的同步器），是具有挑战性的。
在这里，我们描述了通过他们从DNA复制阶段的进展，通过他们的女儿细胞的分裂和分离的积极骑自行车细胞亚群，代谢标记方法。再加上流式细胞仪定量测量细胞周期动力学进展，该协议使在没有任何机械或化学诱导细胞强调，通常与其他细胞周期同步方法10。在下面的章节中，我们将讨论的方法，以及一些在生物医学研究中的应用。
Protocol
1。细胞的制备
- 板细胞密度达到了约60％汇合。细胞必须在日志阶段在收集的时间。对于MCF7细胞，这是完成播种在5×10 5细胞/ 10厘米板，在适当的媒体。 HT29和LS180细胞接种在6×10 5细胞/ 6厘米的板。我们用于补充10％胎牛血清和1x青霉素/链霉素的DMEM培养基。要确保正确的阳性和阴性对照种子板除了您的测试样品。它们包括以下内容：
| 我 | 阳性对照 | 尿嘧啶只 |
| 二 | 阳性对照 | 有价证券投资只 |
| 三 | 阴性对照 | 尿嘧啶负，有价证券投资负 |
（应当指出的是，与多个时间点，如在本协议所述的初步实验可以用来缩小的时间框架，在此期间，开展未来的集合。）
- 镀细胞培养在37℃，5％的CO 2为24-48小时，从而使细胞恢复和重视。
- 脉冲溴脱氧尿苷（尿嘧啶）标记细胞，培养液取代无线日含10μM的尿嘧啶的新媒体。细胞在37℃，5％CO 2的BrdU掺入到DNA的允许1小时。是一定要留下一个盘子未经处理作为阴性对照。
- 脉冲标签媒体被删除，简单地用1X PBS冲洗细胞。
- 添加新鲜培养基（零下的BrdU）和细胞被允许继续孵育在37℃，5％CO 2，直到收获的适当时间点到达。
2。采伐和固定
- 从步骤1.3未经处理的细胞被认为是零的时间点。这个范例可以一起用了1小时的时间点所收集的BrdU治疗后立即收获。
- 收获的细胞，媒体被删除，板与1X PBS冲洗一次。
- 是胰酶消化细胞，收集培养媒体，并在1500转离心5分钟支持随后颗粒ernatant被丢弃。
- 在5毫升冰冷1X PBS冲洗1-10×10 6个细胞。在1500转离心5分钟上清被丢弃。
- 然后将细胞沉淀悬浮于100μL冰冷的PBS / 1％FBS。此外，在防止细胞凝集1％FBS的PBS中艾滋病。
- 添加下降到5毫升-20℃，70％的乙醇固定细胞，这些细胞下降。
- 在冰上孵育30分钟或储存在4°C过夜。这是一个理想的步骤，停止从各时间点的样品采集。可以留在乙醇样品数天，让他们同时通过协议的其余部分进行处理。
3。 BrdU和PI染色
- 5分钟1500转离心沉淀细胞。
- 取出固定，但离开〜50μL涡旋颗粒放松。
- 变性的DNA，慢慢加入1毫升2N盐酸/剂Triton X-100滴加而涡旋。室温孵育30分钟的样品。
- 离心5分钟1500转的样品颗粒细胞。吸和弃上清。
- 悬浮细胞沉淀在1毫升0.1M四硼酸钠，pH值8.5，以消除变性步骤。
- 5分钟1500转离心细胞。吸和弃上清。
- BrdU染色混合在75μL（50μL0.5％吐温20/1％的BSA / PBS + 20μLFITC标记的抗BrdU + 5μL10毫克/毫升核糖核酸）重悬细胞沉淀。
- 在室温下孵育45分钟，避光。
- 以颗粒细胞，离心5分钟1500转的样品。吸和弃上清。
- 1毫升含5μg/ ml的碘化的PBS重悬细胞沉淀。
4。流式细胞仪
- 分析细胞，流式细胞仪配备有一个488 nm激光和适当的过滤器是必要的。如CellQuest软件分析是必要的，以创建下面列出的地块。
- 通过流式细胞仪的样品运行时，创建一个前向散射（SSC-H的）与侧散射（FSC-H的）情节，以确保适当的细胞大小分布（ 图1A）。这些参数都被画上的线性度。
- 同时查看FL3-H的（有价证券染色）主场迎战的FL2 - W（ 图1B）阴谋。此图是用来创建一个门（4915）分离的部分细胞内正常的细胞周期的分布格局。在一般情况下，这种分布格局的特点是由两个2N 4N DNA含量的PI染色较G1和G2期的细胞周期，分别从细胞群。正在进行DNA复制发生在细胞周期的S期细胞位于这2个集群之间的字符串代表。
- 创建一个阴谋displayi吴的门细胞从57-H的步骤4.3（FITC标记，日志图）（4915），Y轴在X轴（ 图1C）和PI（线性图）。该地块将用于设置使用1.1中所述的各种控件，以及收集数据进行分析的其余参数。
- 将到流式细胞仪的PI只染样品。调整增益G1 x轴放置在〜200。这将是更容易在直方图的PI染色情节形象化。
- 第二个控制涉及流式细胞仪上运行的只有1尿嘧啶样品。调整增益，使细胞的2种群（BrdU阳性的BrdU负）上出现的情节。理想的情况下，阴性细胞的BrdU定位出现低于10 -1。
- 最终控制的BrdU / PI阴性样品。运行此阴性对照，以确保细胞不会出现在任何上限或右手象限。
- 一旦各个地块的参数已经设置，流式细胞仪校准和准备BrdU和PI染色的细胞进行处理。至少10000个细胞，在正确的PI分数（请参考步骤4.3）的门必须读取每个集合。
- 分析收集到的数据，如FlowJo或FacsDiva软件利用。上述地块可以重新在这些方案，并进行定量和统计分析。
- 分析端点涉及几个连续的步骤。创建的FITC与PI PI PI对比的FL2 - W阴谋积极门与细胞的情节，允许一个区分单车人口。第二个门是从这个小区创建隔离BrdU阳性人口。这种独特的人口直方图情节与x轴PI表示，允许一个追踪细胞周期进程的时间过程。这可以是进一步绘制BrdU阳性细胞数量与G1或G2的内容作为时间的函数的可视化。
5。代表结果
通常用碘化丙啶染色循环细胞有明显的峰值，在G1和G2，对应的细胞，分别含有2N和4N DNA含量（ 图2）。 BrdU标记脉冲允许一个亚群体正在积极合成DNA（即S期）的细胞的选择性标记。拆除的BrdU试剂后不久，所有标记的细胞S期（ 图3）。限制短脉冲的标签之一，是能够按照各地大量的时间点现在不同的细胞亚群体，因为他们通过对细胞周期的后续阶段的传递。这可以是可视化，在1小时的时间点明显缺乏的G1和G2峰图3。
其他信息可从BrdU标记步骤。不仅可以积极分裂的细胞的比例来衡量，而是一种ESTimate两个样本之间的阶段，细胞周期分布以及可确定。等距的BrdU试剂去除后的时间间隔收集细胞，细胞可以追溯到作为他们继续循环，进展到G2，最终移动到细胞的原始细胞的分裂，终于新兴BrdU阳性子细胞与G1 DNA含量（ 图4）。细胞周期的量化和动力学分析的一个例子是在图5。
图1。（一）前向散射对MCF7细胞的人口有代表性的阵营散点图。 （二）PI与宽度（FL-W），剧情一个有代表性的MCF7细胞的人口。浇注被排除在最终的分析（4915）细胞的双峰。细胞双峰脉冲宽度大于一个单细胞，因为它们需要更长的时间，通过激光束和theref通过矿石可以从分析中排除。 （三）有价证券与FITC（尿嘧啶）绘制一个有代表性的MCF7细胞的人口。浇注包括只有FITC（尿嘧啶）（R4）的阳性细胞。
图2。代表总人口的细胞通常骑自行车直方图情节。
图3。已收集后拆除的BrdU脉冲后1h门FITC（尿嘧啶）阳性细胞，细胞直方图的情节。在早期的时间点BrdU阳性细胞，去除标签后显示的PI型材，对应的样本显示DNA含量与细胞，在细胞周期的S期，DNA合成的细胞，只有在确认成功标签一致。
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图4。细胞周期的肿瘤细胞株，大肠癌HT29（A）和LS180（二），以及乳腺癌MCF7（c）之间的进展动力学比较。收集细胞，每隔一小时，8小时后拆除的BrdU脉冲。在这个实验中，我们发现在大肠癌细胞株LS180通过细胞周期G2期的加速细胞周期进程的轮廓清晰。动力学，大肠癌细胞的两个剖面之间的比较是明显的G1峰出现在t = 4H后的BrdU在LS180细胞相比，HT-29细胞缺乏此峰与相应的时间点。要么两个大肠癌细胞株相比，MCF7细胞是骑自行车在率显着降低。 点击这里查看大图 。
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图5（一）定量细胞周期的BrdU标记的癌细胞相分析。院长/杰特/福克斯算法应用于HT29，LS180和MCF7（绿色所示）。表示为％的总BrdU阳性每个阶段的细胞产生的细胞周期相分布，从每个样品。只能选择时间点，每个细胞株显示，一些较早的时间点的分析结果无效。在这些较早的时间点，所有的BrdU阳性细胞在S期，因此，缺乏鲜明的G1和G2的高峰，这是算法的应用所必需的。 （二）癌细胞的直方图显示动力学的进展，通过对细胞周期的G2 / M期。 LS180细胞，HT29和MCF7通过G2 / M期的进展是最快的。 点击这里查看大图 。
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图S1。流式细胞仪控制。 （一）阴性对照细胞既不是PI也不尿嘧啶染色显示MCF7细胞。 （乙）有价证券仅染色。 （三）尿嘧啶-FITC标记的样品。
图S2示意图显示的PI与FITC（尿嘧啶）的荧光发射光谱之间的关系。荧光通道1（FL1，FITC标记）和荧光通道3（FL3，PI）的光谱收集窗口显示在相应的框中。有没有与FL1和FL3检测的荧光光谱重叠。由此可见，荧光补偿是没有必要的PI和FITC-尿嘧啶的实验数据共同标记细胞分别在FL1/FL3渠道收集。荧光光谱获得了BD公司网站：目标=“_blank”> http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer。 点击这里查看大图 。
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Discussion
结合流式细胞仪BrdU掺入，我们有必要的工具来研究细胞周期动力学。运作作为胸苷类似物的BrdU的独特属性是允许单车细胞的DNA含量定量。是什么让一个按照循环细胞亚群，通过S期的DNA复制到G2期的增长，并最终以细胞分裂纳入到越来越多的女儿在合成阶段的细胞周期的DNA链的BrdU 。女儿BrdU阳性细胞可连续之后，直到在时间点的BrdU标签稀释细胞分裂的信号降低到背景水平的程度。
使用碘化确定总DNA含量，我们能够按照从S→→G1的G2 / M期细胞周期进程。能够追踪细胞周期率是重要和有益的，在许多应用中，特别是FOR预临床研究涉及细胞周期特异性DNA损伤诱导的药物或在药物开发过程，以确定细胞周期阶段11个新化合物的灵敏度。使用代谢标记技术的最明显的优势是消除细胞化学同步。由于大多数的化学治疗，诱导细胞周期阻滞本身毒性，解剖存在的这些化学物质在细胞周期的新型化合物的灵敏度影响未必可行。
我们展示了这尿嘧啶代谢与PI联合染色标记技术的通用性。使用这个协议，我们已经成功地证明，在细胞周期的G2 / M期细胞周期进程，通过增加可在人体细胞端粒酶阴性，已转化酶的表达10迫使观察。虽然这种方法是强大的测量它的周期穿过细胞动力学UGH多个阶段，一个限制是过渡期间的损失定时信息，以及在G2和M期。当细胞通过G2继续为M，我们无法区分不仅是分两个阶段，而且亚G1人口，仅仅根据DNA含量。在这种分化是必需的应用程序，它可能是可能的合作染色BrdU标记细胞对细胞周期蛋白的抗体或其他细胞蛋白，其表达具体所需的细胞周期的12,13相。将需要额外的优化，以确保细胞周期蛋白抗体的BrdU标记和免疫染色协议兼容。理想的情况下，要充分分化的细胞周期的各个阶段，几个细胞周期蛋白抗体可能需要一个样本同时共同标签。我们的实验室工作后标签的BrdU脉冲标记细胞与细胞周期蛋白B和磷酸化组蛋白3抗体来区分细胞G2对M期细胞周期的阶段。有限公司与细胞周期蛋白抗体的标签，除了PI和FITC-尿嘧啶染色，大大增加了流式细胞术的并发症，无论从硬件和数据分析（荧光补偿问题）的角度。随着新一代流式细胞仪的问世，其容量和功能的进步，应当减轻这些技术问题。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢安迪·约翰逊在不列颠哥伦比亚大学的生物医学研究中心的协助FACS分析。巨蟹座在黄实验室的研究经费是由加拿大癌症协会研究所（经营赠款＃019250）和药学院，不列颠哥伦比亚大学医学院的研究再投资资金。 JMYW由加拿大研究主席迈克尔·史密斯基金会为卫生研究职业发展计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | BD Biosciences | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher Scientific | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | BD Biosciences |
References
- Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).
- Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention. Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).
- Dickson, M. A., Schwartz, G. K. Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy. Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).
- van Opstal, A., Boonstra, J. Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells. Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).
- Gasnereau, I. Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis. Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).
- Pedrali-Noy, G. Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin. Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).
- Merrill, G. F. Cell synchronization. Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).
- Fleisig, H. B., Wong, J. M. Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells. Oncogene. , (2011).
- Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9. Cancer Res. 66, 435-444 (2006).
- Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. Analysis of cell cycle by flow cytometry. Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).
- Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry. Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).
