Summary
Отслеживание тонкие изменения в прогрессии и кинетики стадии клеточного цикла может быть достигнуто путем использования сочетания метаболических маркировки нуклеиновых кислот с BrdU и общая окраска геномной ДНК с помощью йодида пропидия. Этот метод позволяет избежать химического синхронизации велосипедного клеток, тем самым предотвращая внедрение неспецифического повреждения ДНК, которые, в свою очередь влияет на прогрессию клеточного цикла.
Protocol
1. Сотовые подготовка
- Пластина клетки для достижения плотности примерно на 60% слияния. Клетки должны быть в логарифмической фазе во время сбора. Для MCF7 клеток, это достигается путем посева на 5 х 10 5 клеток / 10 см пластины в соответствующих средствах массовой информации. HT29 и LS180 клетки высевают на 6 х 10 5 клеток / 6 см тарелку. Мы использовали средства массовой информации DMEM с добавлением 10% FBS и 1 пенициллина / стрептомицина. Будьте уверены, чтобы семена пластины для правильного положительного и отрицательного контроля вдополнение к вашей образцах. Они включают в себя следующее:
| я | положительный контроль | BrdU только |
| II | положительный контроль | П.И. только |
| III | Отрицательный контроль | BrdU негативный, П. отрицательный |
(Следует отметить, что предварительный эксперимент с несколькими моменты времени такой как указано в этом протоколе может быть использована, чтобы сузить временные рамки, в течение которых осуществляют будущей коллекции.)
- Покрытие клетки инкубировали при 37 ° C, 5% СО 2 в течение 24-48 ч, что позволяет клеткам восстановиться и присоединить.
- Для импульсной метки клеток бромдезоксиуридин (BrdU), DMEM заменяется шм свежей среде, содержащей 10 мкМ BrdU. Клетки инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C, 5% CO 2, чтобы обеспечить включение BrdU в ДНК. Обязательно оставьте одну пластину необработанной в качестве отрицательного контроля.
- Импульс маркировки СМИ удаляется, а клетки промываются кратко 1X PBS.
- Свежий медиа роста добавил (минус BrdU) и клетки могут продолжать инкубацию при 37 ° C, 5% СО 2 до соответствующего timepoint для сбора урожая не будет достигнуто.
2. Сбор и фиксация
- Необработанных клетках, начиная с шага 1.3 считается нулевым timepoint. Этот пример может быть собрано вместе с 1 ч. timepoint которые собираются сразу после лечения BrdU.
- Для уборки клетки, средства массовой информации удаляется, а пластины промывают один раз 1X PBS.
- Клетки трипсином, собранные в культивировании СМИ, а затем осаждали центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин Супаernatant отбрасывается.
- Промыть 1-10 х 10 6 клеток в 5 мл ледяной 1X PBS. Центрифуга на 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин супернатант удаляется.
- Осадок клеток затем ресуспендировали в 100 мкл ледяной PBS / 1% FBS. Добавление 1% FBS в PBS средства для предотвращения слипания клетки.
- Добавить эти клетки по капле на 5 мл -20 ° C, 70% этанолом, чтобы исправить клеток.
- Инкубировать на льду в течение 30 мин или хранить при 4 ° С в течение ночи. Это идеальный шаг, на котором заканчивается сбор образцов из различных моменты времени. Образцы можно оставить в этаноле в течение нескольких дней, что позволяет им обрабатывать одновременно через оставшуюся часть протокола.
3. BrdU и PI Окрашивание
- Гранул клеток путем центрифугирования в течение 5 мин со скоростью 1500 оборотов в минуту.
- Снимите фиксатор, но оставить ~ 50 мкл, в котором, чтобы ослабить осадок на вортексе.
- Для денатурации ДНК, медленно добавляют 1 мл 2N HCl / Triton X-100по каплям при встряхивая. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Гранул клеток путем центрифугирования образцов в течение 5 мин со скоростью 1500 оборотов в минуту. Аспирируйте и отказаться от супернатант.
- Ресуспендируйте осадок клеток в 1 мл 0,1 М тетраборат натрия, рН 8,5, для нейтрализации денатурации шаг.
- Центрифуга клеток в течение 5 мин со скоростью 1500 оборотов в минуту. Аспирируйте и отказаться от супернатант.
- Ресуспендируйте осадок клеток в 75 мкл Смесь для окрашивания BrdU (50 мкл 0,5% Твин-20/1% BSA / PBS + 20 мкл FITC сопряженных анти-BrdU + 5 мкл 10 мг / мл РНКазы).
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут защищенном от света месте.
- Чтобы шарик клеток, центрифуги образцов в течение 5 мин со скоростью 1500 оборотов в минуту. Аспирируйте и отказаться от супернатант.
- Ресуспендируйте осадок клеток в 1 мл PBS, содержащий 5 мкг / мл пропидия йодида.
4. Проточной цитометрии
- Для анализа клеток, проточной цитометрии оснащен лазерным 488 нм исоответствующие фильтры необходимо. Анализ программного обеспечения, таких как CellQuest необходимо создать участки описаны ниже.
- При выполнении пробы через проточной цитометрии, создать вперед рассеяния (SSC-H) в зависимости от стороны рассеяния (FSC-Н) для обеспечения правильного распределения размеров клеток (рис. 1А). Оба эти параметры приведены в линейном масштабе.
- Одновременный просмотр участка FL3-H (PI пятна) по сравнению с FL2-W (рис. 1б). Этот участок используется для создания ворота (R3) выделить долю клеток, которые находятся в пределах нормального распределения клеточного цикла. В общем, эта картина распределения характеризуется двумя скопления клеток из 2N и 4N содержание ДНК П.И. окрашивания представляет G1 и G2 фазах клеточного цикла, соответственно. Строка клеток, расположенных между этими 2 кластерами представитель текущей репликации ДНК, что происходит в фазу S клеточного цикла.
- Создать сюжет displayiнг закрытых ячеек (R3) с шагом 4.3, с FL1-H (FITC, журнал участка) по оси ординат и PI (линейный участок) на оси абсцисс (рис. 1в). Этот участок будет использоваться для установки остальных параметров использования различных элементов управления, изложенные в 1.1, а также для сбора данных для анализа.
- Поместите PI только окрашенных образцов на цитометра. Регулировка усиления разместить G1 на ~ 200 на оси абсцисс. Это будет легче представить себе в виде гистограммы сюжет PI пятно.
- Второй элемент управления включает в себя запуск BrdU только образец на проточной цитометрии. Регулировка усиления, так что 2 популяций клеток (BrdU положительные против BrdU отрицательный) появятся на участке. В идеале, BrdU негативные клетки расположены появляться чуть ниже 10 -1.
- Окончательный контроль BrdU / PI отрицательный пример. Запустите этот отрицательный контроль, чтобы клетки не появляются ни в одном из верхней или правой стороны квадранта.
- После того, параметры различных участках были установлены,проточной цитометрии откалиброван и готов к обработке BrdU и PI окрашенных клеток. Не менее 10000 клеток, которые закрытого в правильном часть PI (см. шаг 4.3) следует читать в коллекции.
- Для анализа собранных данных, программное обеспечение, такое как FlowJo или FacsDiva используются. Каждый из вышеупомянутых участков могут быть воссозданы в этих программах, а также количественные и статистический анализ выполняется.
- Конечная точка анализа включает в себя несколько последовательных шагов. Создание участка FITC против PI с ячейками закрытого в качестве ИП положительного от участка PI против FL2-W позволяет различать велосипедные населения. Вторые ворота создается из этого участка, выделяя положительные BrdU населения. Выражая это отличительная населения на гистограмме участка с ИП на оси абсцисс позволяет отслеживать время ход клеточного цикла. Это может быть дополнительно визуализируются построения число BrdU-положительных клеток в G1 или G2 содержание в зависимости от времени.
5. Представитель Результаты
Обычно велосипедные клеток, окрашенных йодистым пропидия имеют разные пики на G1 и G2, соответствующие клетки, содержащие 2N и 4N содержание ДНК, соответственно (рис. 2). Импульсный маркировки с BrdU позволяет избирательный маркировки субпопуляции клеток, активно синтезирующие ДНК (фаза, т.е. S). Вскоре после удаления реагента BrdU, все меченых клеток в S фазе (рис. 3). Ограничивая маркировки на короткий импульс человек способен следовать этому в настоящее время отдельные субпопуляции клеток по всему многочисленные моменты времени, когда они проходят через последующие этапы клеточного цикла. Это могут быть визуализированы в 1 час времени точка на рисунке 3, явный недостаток G1 и G2 пиков.
Дополнительная информация может быть получена из шаг маркировки BrdU. Мало того, что доля активно делящиеся клетки измеряется, но ЭСТimate клеточного цикла стадии распределения между двумя образцами можно определить, как хорошо. Собирая клеток одинаково промежутки времени после удаления реагента BrdU, клетки можно проследить, как они продолжают цикл, прогресс в G2 и, наконец, двигаться до клеточного деления исходной клетки, в конце концов превращается в BrdU-положительных дочерние клетки с G1 Содержание ДНК (рис. 4). Например клеточного цикла количественного этапа и кинетический анализ осуществляется на рисунке 5.
Рисунок 1. (A) вперед по сравнению с Scatter участок бокового рассеяния представителя MCF7 клеточной популяции. (B) PI по сравнению Ширина (FL-W) земельный представитель MCF7 клеточной популяции. Память показана для исключения дубликатов клетки в конечном счете (R3). Сотовые дублетов будет иметь больший импульс, чем ширина одной ячейки, так как они дольше проходить через лазерный луч и therefруды могут быть исключены из анализа. (C) PI по сравнению с FITC (BrdU) земельный представитель MCF7 клеточной популяции. Память показано, включают в себя только FITC (BrdU) положительных клеток (R4).
Рисунок 2. Представителю гистограмма участок общей численности населения обычно велосипеде клеток.
Рисунок 3. Гистограмма участок клетки, которые были собраны 1 час после удаления BrdU импульса, после стробирования для FITC (BrdU)-положительных клеток. BrdU-положительных клеток на ранней timepoint после удаления этикетки показать PI профилями, которые соответствуют образцы отображения содержания ДНК в соответствии с клетками, которые находятся в S-фазе клеточного цикла, подтверждающий успешное маркировки клеток только в синтезе ДНК.
л = "Рисунок 4" />
Рисунок 4. Сравнение клеточного цикла между кинетики раковых клеток линий колоректального рака HT29 (А) и LS180 (B), а также рак молочной железы MCF7 (C). Клетки собирали каждый час в течение 8 часов, после удаления BrdU импульса. В этом эксперименте мы наблюдали четкий профиль ускорения прогрессии клеточного цикла через G2 фазе клеточного цикла в толстой LS180 клеточной линии. Сравнение кинетики между двумя профилями клеток колоректального рака, возникновение пика G1 бросается в глаза при Т = 4 часа после BrdU в LS180 клеток, по сравнению с соответствующим моменту времени для HT-29 клеточная линия которой не хватает этого пика. По сравнению с любой из двух клеточных линий колоректального, MCF7 клетки велосипеде по значительно сниженной ставке. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
RE 5 "/>
Рисунок 5. (А) Количественные клеточного цикла фаза анализа BrdU-меченых клеток рака. Дин / Джетта / Fox алгоритм был применен к HT29, LS180 и MCF7 (показано зеленым цветом). В результате клеточного цикла фазовых распределений из каждого образца выражается в% от общего BrdU-положительных клеток на каждом этапе. Только выбора момента времени для каждой ячейки строки отображается, так как анализы для некоторых более ранних моментов времени производится недействительными результаты. В эти ранние моменты времени, все BrdU-положительных клеток в S-фазе и, следовательно, не имеют различных G1 и G2, пики, которые необходимы для применения алгоритма. (B) Гистограммы раковых клеток показывает кинетики движения через G2 / M фазах клеточного цикла. Прогресс через G2 / M фазах быстрым для LS180 клетки, а затем и HT29 MCF7. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
JPG "ALT =" Рисунок S1 "/>
Рисунок S1. Контроля проточной цитометрии. MCF7 клеток показано, как (А) отрицательный контроль, когда клетки не являются ни ИП, ни BrdU окрашенные. (B) PI только окрашивают. (C) BrdU-FITC помечены образцы.
Рисунок S2. Схематическое изображение, показывающие связь между флуоресцентной спектр излучения ИП по сравнению с FITC (BrdU). Спектрального окна коллекции для люминесцентных канала 1 (FL1 для FITC) и флуоресцентные канала 3 (FL3 для PI) приведены в соответствующих полях. Существует не флуорофора перекрытия спектров между FL1 и FL3 обнаружения. Очевидно, что флуоресценция компенсация не нужна, когда экспериментальные данные PI и FITC-BrdU со-меченых клеток собираются в FL1/FL3 каналов соответственно. Флуоресцентные спектры были получены с сайта BD Biosciences:целевых = "_blank"> http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Объединив проточной цитометрии с включением BrdU, у нас есть необходимые инструменты для изучения кинетики клеточного цикла. Отличительной особенностью BrdU функционировать как аналог тимидина то, что позволяет для содержания ДНК количественное велосипедные клетки. Включение BrdU в растущую нить ДНК дочери в процессе синтеза фазе клеточного цикла, что позволяет следить субпопуляции клеток езда на велосипеде через репликацию ДНК в фазе S, в период роста на G2 и в конечном итоге деления клеток . Дочь BrdU-положительных клеток может быть непрерывно следуют до которого момент этикетки BrdU разбавляется деления клеток в той степени, где сигнал сводится к фоновым уровням.
Использование пропидия йодида для определения общего содержания ДНК, мы можем следовать прогрессии клеточного цикла от S → G2 / M → G1. Возможность отслеживать скорость велосипедного клеток важна и полезна во многих приложениях, в частности, лГ доклинических исследований, связанных с клеточным циклом конкретного повреждения ДНК, вызывающие наркотиков или во время процесса разработки лекарств для определения стадии клеточного цикла чувствительность новых соединений 11. Наиболее очевидное преимущество использования метаболических техника маркировки ликвидации химического синхронизации клеток. Как и большинство химических обработок, которые вызывают остановку клеточного цикла сами генотоксического, рассекая клеточного цикла чувствительность последствия новых соединений в присутствии этих веществ может оказаться невозможным.
Мы показали универсальность этого маркировки BrdU метаболических технику с PI совместного окрашивания. Используя этот протокол, мы успешно продемонстрировали, что увеличение клеточного цикла через G2 / M фазе клеточного цикла можно наблюдать в теломераза-негативных клеток человека, которые были преобразованы в заставили фермент выражение 10. Хотя этот метод является мощным измерения кинетики клетки, как циклы беспересадочныйтьфу несколько этапов, одним ограничением является потерей времени информации во время переходов, а также в рамках G2 и М фазах. В клетках протекают через G2 М, мы не в состоянии отличить не только два этапа, а также суб-G1 населения, основанные исключительно на содержание ДНК. В случаях, когда эта дифференциация не требуется, это потенциально возможного к сотрудничеству пятно BrdU меченых клеток с антителами против циклинов или других клеточных белков, выражения, специфичные для желаемой фазе клеточного цикла 12,13. Дополнительная оптимизация будет необходима для того, чтобы циклин антител совместимы с лейблом BrdU и иммуно-окрашивание протокола. В идеале, чтобы адекватно дифференцировать различные фазы клеточного цикла, некоторые антитела циклин могут быть необходимы для совместного этикетке одного образца одновременно. Наша лаборатория работает на постсоветском пространстве, маркировки BrdU импульса меченых клеток с циклин B и фосфора гистонов 3 антитела, различать клеткив сравнении с M G2 фазе клеточного цикла. Со-маркировки с циклин антител, в дополнение к окрашиванию PI и FITC-BrdU существенно повышает сложность проточной цитометрии как с аппаратной и анализа данных (флуоресценция вопросы компенсации) перспективу. С появлением нового поколения поток цитометрах, успехи в их возможности и функциональность должны решить эти технические проблемы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Энди Джонсон из Центра биомедицинских исследований в UBC для помощи в анализе FACS. Cancer Research финансирование в Вонг лаборатории обеспечивается канадской онкологическое общество Научно-исследовательский институт (рабочее грант № 019250), а также исследований реинвестирования средств факультет фармацевтических наук, UBC. JMYW поддерживается исследований кафедр и Канады Майкл Смит Фонд исследований в области здравоохранения программ развития карьеры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | BD Biosciences | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher Scientific | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | BD Biosciences |
References
- Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).
- Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention. Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).
- Dickson, M. A., Schwartz, G. K. Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy. Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).
- van Opstal, A., Boonstra, J. Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells. Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).
- Gasnereau, I. Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis. Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).
- Pedrali-Noy, G. Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin. Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).
- Merrill, G. F. Cell synchronization. Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).
- Fleisig, H. B., Wong, J. M. Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells. Oncogene. , (2011).
- Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9. Cancer Res. 66, 435-444 (2006).
- Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. Analysis of cell cycle by flow cytometry. Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).
- Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry. Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).
