Mätning Cell Kinetics cellcykelreglering med metabolisk märkning och flödescytometri

Summary

Spårning subtila förändringar i progression och kinetiken av stegen cellcykelns kan åstadkommas genom användning av en kombination av metabolisk märkning av nukleinsyror med BrdU och totalt genomiskt DNA-färgning via propidiumjodid. Denna metod undviker behovet av kemisk synkronisering av cyklande celler, vilket därigenom förhindrar införandet av icke-specifik DNA-skada, vilket i sin tur påverkar cellcykelprogressionen.

Abstract

Exakt kontroll av initiering och efterföljande progression genom de olika faserna i cellcykeln är av största betydelse i prolifererande celler. Cellcykeln division är en integrerad del av tillväxt och reproduktion och avregleringen av nyckelkomponenter cellcykelns har varit inblandade i de utfällda händelser cancer ^1,2. Molekylära agenter i cancerbehandlingar rikta ofta biologiska vägar som ansvarar för reglering och samordning av cellcykeln Division ^3. Även om cellcykelns kinetik tenderar att variera beroende på celltyp, är fördelningen av celler mellan de fyra stegen av cellcykeln ganska överens med en viss cellinje på grund av konsekvent mönster för mitogen och tillväxtfaktor uttryck. Genotoxiska händelser och andra cellulära stressorer kan resultera i en temporär blockering av cellcykelprogression, vilket resulterar i gripande eller en temporär paus i en särskild cell cykel fas för att möjliggöra institurandet av lämpliga svarsmekanism.

Förmågan att experimentellt observera uppträdandet av en cellpopulation med hänvisning till deras cellcykelprogression steget är ett viktigt framsteg inom cellbiologi. Gemensamma förfaranden som mitotisk skaka, differentiell centrifugering eller flödescytometri-baserad sortering används för att isolera celler i vissa stadier av cellcykeln ^4-6. Dessa fraktionerade, cellcykelinhibitorer fas-berikade populationer utsätts sedan för experimentella behandlingar. Utbyte, renhet och livskraften hos de separerade fraktionerna kan ofta försämras med användning av dessa fysikaliska separationsmetoder. Som väl kan tiden mellan separation av cellpopulationer och i början av experimentell behandling, varvid de fraktionerade cellerna kan utvecklas från den valda cellcykeln skede innebära stora utmaningar i den framgångsrika genomförandet och tolkningen av dessa experiment.

Andra metoder för study cellcykelns steg innefattar användning av kemikalier för att synkronisera cellerna. Behandling av cellerna med kemiska inhibitorer av viktiga metaboliska processer för varje cellcykelsteget är användbara vid blockering av progressionen av cellcykeln till nästa steg. Till exempel inhiberar ribonukleotidreduktas hydroxiurea stoppar celler vid G1 / S skede genom att begränsa utbudet av deoxinukleotider, de byggstenar av DNA. Andra anmärkningsvärda kemikalier innefattar behandling med afidikolin, att en polymeras-alfa-hämmare för G1 gripande, behandling med kolchicin och nokodazol, vilka båda påverkar mitotiska spolen bildning stoppa celler i M-fasen och slutligen, att behandling med DNA-kedjeterminator 5-fluorodeoxyridine initiera S fasstillestånd ^7-9. Behandling med dessa kemikalier är ett effektivt sätt att synkronisera en hel population av celler vid en viss fas. Med avlägsnande av det kemiska, celler återförenas cellcykeln unisont. Behandling av testmedlet följande frisättningfrån cellcykeln blockerande kemisk säkerställer att läkemedlet som framkallades är från en enhetlig, cellcykelsteget-specifik population. Dock eftersom många av de kemiska synkroniseringsdon kända genotoxiska föreningar, retas isär deltagande av olika motåtgärder vägar (till synkroniseringsdon kontra de test medel) är en utmaning.

Här beskriver vi en metabolisk märkning metod för att följa en subpopulation av aktivt delande celler genom sin utveckling från DNA-replikation fasen, fram till uppdelningen och separation av deras dotter celler. Tillsammans med flödescytometri kvantifiering, gör detta protokoll för mätning av kinetisk progression av cellcykeln i frånvaro av antingen mekaniskt eller kemiskt inducerad cellulär betonar vanligen förknippas med andra synkronisering cellcyklens metoder ^10. I de följande avsnitten kommer vi att diskutera metoder, samt några av dess tillämpningar inom biomedicinsk forskning.

Protocol

1. Cellberedning

1. Plattan celler för att uppnå en densitet av ungefär 60% konfluens. Cellerna måste vara log-fas vid tidpunkten för insamlingen. För MCF7-celler åstadkoms detta genom ympning med 5 x 10 ⁵ celler per 10 cm platta i lämpliga medier. HT29-och LS180-celler sås med 6 x 10 ⁵ celler per 6 cm platta. Vi använde DMEM-medium kompletterat med 10% FBS och 1 x penicillin / streptomycin. Var noga med att utsäde plattor för rätt positiva och negativa kontroller iFörutom att dina prover. De omfattar följande:

Jag	positiv kontroll	BrdU endast
ii	positiv kontroll	PI endast
iii	negativ kontroll	BrdU negativt, PI negativt

(Det bör noteras att ett preliminärt experiment med flera tidpunkter som en som beskrivs i detta protokoll kan användas för att begränsa den tid under vilken genomföra framtida samlingar.)

2. Av de strukna cellerna inkuberas vid 37 ° C, _5% CO2 under 24-48 timmar, vilket tillåter celler att återhämta sig och fäster.
3. Att pulsa label-celler med bromodeoxiuridin (BrdU), är DMEM ersättas with färskt medium innehållande 10 M BrdU. Cellerna inkuberas under 1 h vid 37 ° C, _5% CO2 för att möjliggöra för BrdU-inkorporering i DNA. Var noga med att lämna en platta obehandlat att fungera som negativ kontroll.
4. De pulsmärkning medium avlägsnas och cellerna sköljdes kortvarigt med 1 x PBS.
5. Färska odlingsmediet tillsätts (minus BrdU) och cellerna fick fortsätta att inkubera vid 37 ° C, _5% CO2 till dess att lämplig tidpunkt för upptagning uppnås.

2. Skörd och Fixering

1. Obehandlade celler från steg 1,3 anses noll tidpunkt. Detta prov kan skördas tillsammans med 1 h tidpunkt som samlas in direkt efter BrdU behandling.
2. Att skörda cellerna, är mediet avlägsnas och plattorna sköljdes en gång med 1 x PBS.
3. Cellerna trypsiniserades, uppsamlas i odlingsmedier och därefter pelleterades genom centrifugering vid 1500 rpm under 5 minuter Supernatant kastas.
4. Skölj 1-10 x 10 ⁶ celler i 5 ml iskall 1 X PBS. Centrifugera vid 1500 rpm under 5 minuter supernatanten kastas.
5. Cellpelleten återsuspenderades sedan i 100 | il iskall PBS / 1% FBS. Tillsats av 1% FBS i PBS hjälper till att förhindra cell-hopklumpning.
6. Lägga till dessa celler droppe för droppe till 5 ml av -20 ° C, 70% etanol för att fixera cellerna.
7. Inkubera på is under 30 min eller förvara vid 4 ° C över natten. Detta är en idealisk steg där för att stoppa insamling av prover från de olika tidpunkter. Proverna kan lämnas kvar i etanol under flera dagar, så att de kan bearbetas samtidigt genom återstoden av protokollet.

3. BrdU och Pl-färgning

1. Pelletera celler genom centrifugering under 5 min vid 1500 rpm.
2. Ta bort fixativ, men lämna ca 50 pl i för att lossa pelleten genom vortex.
3. Att denaturera DNA: t, tillsätt långsamt 1 ml 2N HCl / Triton X-100droppvis under virvling. Inkubera proverna vid rumstemperatur under 30 minuter.
4. Pelletera celler genom centrifugering prover i 5 min vid 1500 rpm. Aspirera och kassera supernatanten.
5. Resuspendera cellpelleten i 1 ml 0,1 M natriumtetraborat, pH 8,5, för att neutralisera denatureringssteget.
6. Centrifugera cellerna under 5 min vid 1500 varv per minut. Aspirera och kassera supernatanten.
7. Resuspendera cellpelleten i 75 | il av BrdU-färgning blandning (50 | il 0,5% Tween 20/1% BSA / PBS + 20 ^ il FITC-konjugerad anti-BrdU + 5 pl 10 mg / ml RNas).
8. Inkubera vid rumstemperatur under 45 minuter skyddad från ljus.
9. För att pelletera cellerna centrifugeras proverna under 5 min vid 1500 varv per minut. Aspirera och kassera supernatanten.
10. Resuspendera cellpelleten i 1 ml PBS innehållande 5 pg / ml propidiumjodid.

4. Flödescytometri

1. Att analysera cellerna, en flödescytometer utrustad med en 488 nm laser ochlämpliga filter är nödvändig. Analys program som CellQuest är nödvändigt för att skapa tomter som anges nedan.
2. När man kör provet genom flödescytometern, skapar en framåtspridning (SSC-H) vs sidospridning (FSC-H)-kurva för att säkerställa korrekt storlek fördelning av celler (Figur 1A). Båda dessa parametrar är plottade på en linjär skala.
3. Samtidigt visa en plot av FL3-H (PI-färgning) mot FL2-W (figur 1B). Denna kurva används för att skapa en grind (R3) för att isolera den fraktion av celler som är inom det normala fördelningsmönster av cellcykeln. I allmänhet är denna fördelning mönster som kännetecknas av två kluster av celler från 2N och 4N DNA-innehållet i Pl-färgning representerar G1 och G2-faser av cellcykeln, respektive. En sträng av celler belägna mellan dessa 2 grupper är representativ för pågående DNA-replikation som inträffar i S-fasen av cellcykeln.
4. Skapa en kurva displaying de styrbara celler (R3) från steg 4,3, med FL1-H (FITC, log plot) på y-axeln och PI (linjär kurva) på x-axeln (figur 1C). Denna kurva kommer att användas för att ställa in de återstående parametrarna med de olika kontrollerna som beskrivs i 1,1 samt att samla data för analys.
5. Placera PI endast färgade provet på cytometern. Justera förstärkningen att placera G1 vid ~ 200 på x-axeln. Detta kommer att vara lättare att visualisera i ett histogram plot av PI-färgning.
6. En andra kontrollgrupp innefattar att köra en BrdU-bara prov på flödescytometern. Justera förstärkningen så att de 2 populationer av celler (BrdU positiva vs BrdU negativt) visas på tomten. Helst ska BrdU negativa cellerna positionerat för att visas strax under 10 ^-1.
7. Den slutliga kontrollen är BrdU / PI negativt prov. Kör denna negativa kontroll för att säkerställa att cellerna inte visas i någon av de övre eller höger hand kvadranter.
8. När parametrarna för de olika skiften har ställts in,flödescytometer kalibrerad och klar för behandling av BrdU och PI färgade celler. Ett minimum av 10.000 celler som är gated i rätt PI fraktionen (se steg 4,3) ska läsas per samling.
9. För att analysera de insamlade data, program som FlowJo eller FacsDiva utnyttjas. Var och en av de ovan nämnda tomterna kan återskapas i dessa program och kvantitativ och statistisk analys.
10. Slutpunkten för analys involverar flera successiva steg. Skapa en tomt på FITC vs PI med celler gated som PI positivt från PI mot FL2-W plot gör att man kan skilja cykling befolkningen. En andra port skapas från denna kurva genom att isolera BrdU positiva populationen. Som uttrycker denna särskiljande populationen på ett histogram tomt med PI på x-axeln gör att man kan spåra den tid under cellcykelns framskridande. Detta kan vara ytterligare åskådliggöras genom att plotta antalet BrdU-positiva celler med G1 eller G2 innehåll som en funktion av tiden.

5. Representativa resultat

Normalt cyklande celler färgade med propidiumjodid har distinkta toppar vid G1 och G2, motsvarande celler innehållande 2N och 4N DNA-innehåll, respektive (figur 2). Pulsmärkning med BrdU möjliggör selektiv märkning av en sub-population av celler som aktivt syntetiserar DNA (dvs. S-fasen). Kort efter avlägsnande av BrdU-reagens, alla märkta cellerna är i S-fas (figur 3). Genom att begränsa märkning för att en kort puls man kan följa det här nu distinkt undergrupp av celler i hela flera tidpunkter när de passerar genom de efterföljande faser av cellcykeln. Detta kan visualiseras vid 1 h tidpunkt i figur 3 som en tydlig brist på G1 och G2-toppar.

Ytterligare information kan härledas från BrdU märkningen steget. Inte bara kan andelen aktivt delande celler skall mätas, men en estimate av cellcykelsteget fördelning mellan två prover kan bestämmas. Genom att samla cellerna med jämna mellanrum efter det avlägsnande av BrdU reagens kan celler spåras som de fortsätter att cykla, framsteg G2 och slutligen gå fram till celldelning av de ursprungliga cellerna slutligen fram som BrdU-positiva dotterceller med G1 DNA-innehåll (Fig. 4). Ett exempel på cellcykelfas kvantifiering och kinetisk analys tillhandahålls i figur 5.

Figur 1. (A) Forward Scatter kontra Side punktdiagram av en representant MCF7 cellpopulation. (B) PI jämfört Bredd (FL-W) Rita av en företrädare MCF7 cellpopulation. Gating visas att utesluta cell dubbletter i den slutliga analysen (R3). Cell dubletter kommer att ha större pulsbredd än en enda cell, eftersom de tar längre tid att passera genom laserstrålen och therefmalm kan uteslutas från analysen. (C) PI jämfört med FITC (BrdU) Plot av en företrädare MCF7 cellpopulation. Gating visas att endast de FITC (BrdU) positiva celler (R4).

Figur 2. Representant histogram tomt på en sammanlagd befolkning på normalt cyklande celler.

Figur 3. Histogram plot av celler som har samlats 1h efter avlägsnande av BrdU puls efter grindning för FITC (BrdU)-positiva celler. BrdU-positiva celler vid en tidig tidpunkt efter avlägsnande av etiketten PI profiler som motsvarar prover som uppvisar DNA-innehåll överensstämmer med celler som är i S-fasen av cellcykeln, vilket bekräftar den framgångsrika märkning av celler endast under DNA-syntes.

LT = "Figur 4" />
Figur 4. Jämförelse av cellcykelprogressionen kinetik mellan cancercellinjer och kolorektal cancer HT29 (A) och LS180 (B), samt bröstcancer MCF7 (C). Cellerna uppsamlades varje timme under 8 timmar, efter avlägsnande av BrdU puls. I detta experiment observerade vi en tydlig profil av accelererad cellcykelprogression genom G2-fasen av cellcykeln i kolorektal cellinje LS180. Jämföra kinetiken mellan de två profilerna i kolorektal cancer celler, är uppkomsten av en G1 topp tydligt vid T = 4 timmar efter BrdU i LS180 cellerna jämfört med motsvarande tidpunkt för HT-29 cellinje som saknar denna topp. Jämfört med endera av de två kolorektal cellinjer, är MCF7 celler cyklar till en betydligt reducerad skattesats. Klicka här för att visa en större bild .

re 5 "/>
Figur 5. (A) Kvantitativ cellcykelfas analys av BrdU-märkta tumörceller. Dekanus / Jett / Fox algoritmen tillämpades på HT29, LS180 och MCF7 (visas i grönt). De resulterande cellcykelfas fördelningar från varje prov uttrycks som% total BrdU-positiva celler för varje fas. Endast välja tidpunkter för varje cell linje visas, eftersom analyser för några av de tidigare tidpunkter produceras ogiltiga resultat. I dessa tidigare tidpunkter, alla BrdU-positiva celler är i S-fas och därför saknar distinkt G1 och G2-toppar, vilka är nödvändiga för algoritmen tillämpning. (B) Histogram av cancerceller visar kinetiken för progression genom G2 / M faser av cellcykeln. Progression genom G2 / M faser är snabbast för LS180 celler, följt av HT29 och MCF7. Klicka här för att visa en större bild .

jpg "alt =" Bild S1 "/>
Figur S1. Flödescytometrisystem kontroller. MCF7 celler visas som (A) negativ kontroll där celler är varken PI eller BrdU färgade. (B) PI endast färgas. (C) BrdU-FITC-märkt prov.

Figur S2. Schematisk illustration som visar förhållandet mellan fluorescerande emissionsspektrum för PI kontra FITC (BrdU). De spektrala insamling fönster för fluorescerande kanal 1 (FL1 för FITC) och fluorescerande kanal 3 (FL3 för PI) visas i motsvarande rutor. Det finns inga fluoroforenheter spektra överlappning mellan FL1 och FL3 upptäckt. Uppenbarligen är fluorescenskompensering inte nödvändigt när experimentella data från PI och FITC-BrdU co-märkta celler uppsamlas i FL1/FL3 kanaler respektive. Fluorescens spektrum erhölls från BD Biosciences webbplats:target = "_blank"> http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Genom att kombinera flödescytometri med BrdU inkorporering, har vi de nödvändiga verktygen för att studera cellcykelkinetiken. Den utmärkande egenskapen av BrdU att fungera som en tymidinanalog är vad som möjliggör för DNA-innehåll kvantifiering av en cykel cell. Inkorporeringen av BrdU i en växande dotter-DNA-strängen under syntesen fasen av cellcykeln är det som tillåter en att följa en subpopulation av cyklande celler genom replikering av DNA i S-fas, till en period av tillväxt vid G2 och slutligen till celldelning . Dotterceller BrdU-positiva celler kan kontinuerligt följas tills vilken tidpunkt den BrdU märkning späds genom celldelning till den grad där signalen minskas till bakgrundsnivåer.

Använda propidiumjodid att bestämma den totala DNA-innehåll, kan vi följa cellcykelprogressionen från S → G2 / M → G1. Möjligheten att spåra cykla graden av celler är viktig och användbar i många tillämpningar, särskilt for prekliniska studier med cellcykelns specifika DNA-läkemedel skador inducerar eller under utveckling av läkemedel för att avgöra cell-känsligheten cykel skede av nya föreningar ^11. Den mest uppenbara fördelen med att använda en metabolisk märkning teknik är att eliminera kemisk synkronisering av cellerna. Eftersom de flesta kemiska behandlingar som inducerar cellcykelstopp själva genotoxiska kan dissekera cellen effekterna cykel känslighet nya föreningar i närvaro av dessa kemikalier som inte är genomförbart.

Vi visade mångsidigheten hos denna BrdU metabolisk märkningsteknik med PI co-färgning. Användning av detta protokoll har vi visat framgång att ökningen i cellcykelprogression genom G2 / M-fasen av cellcykeln kan observeras i telomeras-negativa humana celler som har transformerats för att ha tvingats enzymuttryck ^10. Även om denna metod är stark i mätning av kinetiken hos cellen eftersom det cykler through flera steg, är en begränsning av förlusten av tidsinformation under övergångarna, såväl som inom G2-och M faser. Som celler fortsätter genom G2 till M, kan vi inte skilja inte bara de två faserna, men även sub-G1, baserad enbart på DNA-innehåll. I tillämpningar där denna differentiering krävs, är det potentiellt möjligt att sam-fläcken BrdU märkta celler med antikroppar mot cykliner eller andra cellulära proteiner vars uttryck är specifika för den önskade fasen av cellcykeln ^12,13. Ytterligare optimering kommer att behövas för att säkerställa att cyklin antikroppar är kompatibla med BrdU märkning och immuno-färgning protokoll. Helst tillräckligt för att skilja de olika faserna i cellcykeln, kan flera cyklin antikroppar som behövs för att sam-label ett enda prov samtidigt. Vårt laboratorium arbetar efter märkning av BrdU-puls märkta celler med cyklin B och fosfor Histon 3-antikroppar att skilja mellan celleri G2 kontra M-fasen av cellcykeln. Co-märkning med cyklin antikroppar, utöver PI och FITC-BrdU färgning ökar väsentligt komplikation av flödescytometri både en hård och dataanalys (fluorescens ersättningsfrågor) perspektiv. Med tillkomsten av den nya generationen av flödescytometrar, bör framsteg inom sin kapacitet och funktionalitet mildra dessa tekniska problem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bromodeoxyuridine	BD Biosciences	55089
propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	1mg/ml stock
FITC anti-BrdU	BD Biosciences	347583
sodium tetraborate	Fisher Scientific	S80172	0.1M, pH 8.5
FACS Caliber	BD Biosciences