Summary
Bisulfiet mutagenese is de gouden standaard voor het analyseren van DNA-methylatie. Onze gewijzigde protocol zorgt voor een DNA-methylatie analyse op de single-cell niveau en is speciaal ontworpen voor individuele eicellen. Het kan ook worden gebruikt voor splitsing-embryo's.
Abstract
Epigenetica omvat alle erfelijke en reversibele aanpassingen van chromatine, dat alter gen toegankelijkheid, en dus zijn de belangrijkste mechanismen voor het reguleren van gentranscriptie 1. DNA-methylatie is een epigenetische modificatie die voornamelijk fungeert als een repressieve merk. Door de covalente toevoeging van een methylgroep op cytosines in CpG dinucleotiden, kan het werven extra repressieve eiwitten en histon-modificaties aan processen die betrokken zijn in condenserende chromatine en zwijgen genen 2 te starten. DNA-methylatie is essentieel voor normale ontwikkeling, want het speelt een cruciale rol in het ontwikkelings-programma's, celdifferentiatie, onderdrukking van retrovirale elementen, X-chromosoom inactivatie en genomic imprinting.
Een van de meest krachtige methoden voor DNA methylatie analyse is bisulfiet mutagenese. Natriumbisulfiet is een DNA-mutageen dat cytosines deaminates in uracils. Na PCR-amplificatie en Seque ncing, worden deze conversie gebeurtenissen gedetecteerd als thymines. Gemethyleerde cytosines worden beschermd tegen deaminering en dus blijven cytosines, waardoor de identificatie van DNA-methylatie op individueel nucleotide niveau 3. De ontwikkeling van de bisulfiet mutagenese test in een vergevorderd stadium van de oorspronkelijk gemelde 4-6 de richting van degenen die meer gevoelig en reproduceerbaar 7. Een belangrijke verbetering is het inbedden van kleinere hoeveelheden DNA in een agarose kraal, waardoor de bescherming van DNA van de harde bisulfiet behandeling 8. Hierdoor konden methylatie analyse worden uitgevoerd op zwembaden van eicellen en het blastocyst-stadium embryo's 9. De meest geavanceerde bisulfiet mutagenese protocol tot op heden is aan de individuele blastocyst-embryo's 10. Aangezien blastocysten hebben gemiddeld 64 cellen (die 120 tot 720 pg van DNA), deze methode niet doeltreffend voor methylering studies individuele oöcyten of splitsing-embryo's.
tent "> Met aanwijzingen van agarose inbedding van minuut DNA-bedragen inclusief eicellen 11, hier presenteren wij een methode waarbij eicellen direct zijn ingebed in een agarose en lysis oplossing kraal onmiddellijk na het ophalen en verwijderen van de zona pellucida van de eicel. Dit stelt ons in staat omzeilen de twee belangrijkste uitdagingen van een eicel bisulfiet mutagenese:. bescherming van een geringe hoeveelheid DNA van degradatie, en de daarop volgende verlies tijdens de vele stappen protocol is belangrijk, aangezien de gegevens zijn verkregen van enkele eicellen, de kwestie van de PCR-vertekening in zwembaden wordt geëlimineerd Verder. , onopzettelijke cumulus cellen besmetting is detecteerbaar met deze methode, omdat een monster met meer dan een methylatie patroon kan worden uitgesloten van de analyse 12. Dit protocol biedt een verbeterde methode voor een succesvolle en reproduceerbare analyses van DNA-methylatie op de single-cell niveau en is bij uitstek geschikt individuele eicellen en splitsing-embryo's.Protocol
DAG 1
Bereid de volgende oplossingen vers op de dag van de eicel collectie met steriel, gedestilleerd water, zoals GIBCO water. Om de kans op DNA-besmetting te verminderen, veranderen vaak handschoenen en gebruiken filter tips. Houd de buizen weg schuin wanneer het open is, en samen te vatten alle buizen wanneer niet in gebruik. Wij raden aan dat oplossingen zijn als n +1.
3% LMP agarose
30 mg laag smeltpunt (LMP) Agarose
tot 1 ml GIBCO H2O
te ontbinden @ 70 ° C
Lysis Solution
8 pi lysisbuffer
1 pi proteinase K
1 pi 10% IGEPAL
plaats op ijs tot aan gebruik
02:01 Agarose: Lysis Solution (10 ul per individuele eicel, het bedrag is voor 3 eicellen)
20 ul 3% LMP agarose
10 pi Lysis Solution
Meng @ 70 ° C
SDS Lysis Buffer (501 ul per persoon eicel)
| 1 x TE pH 7,5 | 450 ul |
| 10% SDS | 50 ul |
| Proteinase K | 1 pi |
| 501 ul |
1. Eicel Collectie
- Plaats de muis ontleed eileiders in M2 media, en scheur de ampullen aan de cumulus cellen complex te extraheren.
- Scheid de eicellen uit de cumulus cellencomplex gebruik van 0,3 mg / ml hyaluronidase oplossing in een 30 ul druppel M2 media. Houd de eicellen in oplossing slechts zo lang als het duurt om verwijderen van de cumulus cellen, zoals langdurige blootstelling kan beschadigen. Was de oöcyten 3x in 30 pi druppel M2 media verwijderd cumuluscellen periodiek.
- Verwijder de zona pellucida met behulp van zure tyrode-oplossing. Plaats de eicellen in een 30 ul druppel van de oplossing, en dan naar een ander 30pl drop, als het even welke media meegevoerd zal verdunnen het zuur en vermindering van de efficiëntie. Houd de eicellen in oplossing slechts zo lang als het duurt om de zona te verwijderen, zoals langdurige blootstelling kan beschadigen. Opmerking: een verhoogde concentratie van de oplossing zure tyrode of pronase kunnen worden gebruikt voor humane monsters de menselijke zona pellucida beter bestand is tegen de behandeling met zuur oplossing tyrode de van de muis.
- Was de eicellen nog eens in een 30 ul druppel M2 media.
2. Agarose inbedding en Lysis
- Om agarose inbedding uitvoeren, plaatst u de lysis oplossing op een 70 ° C heatblock. Voeg de voorverwarmde LMP agarose de lysis oplossing produceert een 2:1 agarose: lysis oplossing.
- Plaats een eicel op een schoon glasplaatje in een mum van M2 media. Neem een stijging van 10 ul van de agarose: lysis oplossing in een pipet, en (onder de microscoop) voorzichtig verwijdering van een kleine hoeveelheid (~ 1 ui of minder) op het glasplaatje, waardoor het te mengen met de minimAl media. Voorzichtig pak je de eicel in de pipetpunt en zet alle 10 pl in een eppendorfbuisje met 300 ul minerale olie, zodat de kraal vormt een bol.
Opmerking: dit proces moet vrij snel worden uitgevoerd als de agarose hardt als de temperatuur slechts 5 ° C onder 70 ° C. - Incubeer de buis op ijs gedurende 10 minuten. Lysis uitvoeren verwijderen 300 ul minerale olie en voeg 500 pi van de SDS lysisbuffer. Incubeer overnacht in een 50 ° C waterbad.
Opmerking: Lysis oplossing (tabel 1) kunnen ook worden gebruikt voor dit doel.
DAG 2
Bereid de volgende oplossingen vers op de dag van bisulfiet mutagenese. Om kans op DNA-besmetting te verminderen, veranderen vaak handschoenen en gebruiken filter tips. Houd de buizen weg schuin wanneer het open is, en samen te vatten alle buizen wanneer niet in gebruik. Wij raden aan dat oplossingen zijn als n +1.
| 3 M NaOH | <td> 2,4 g NaOH in 20 ml autoclaaf DDH 2 O|
| 0,1 M NaOH | 0,5 ml 3M in 14,5 ml autoclaaf DDH 2 O |
| 0,3 M NaOH | 1,5 ml 3M in 13,5 ml autoclaaf DDH 2 O |
2,5 M oplossing bisulfiet
- 3,8 g natriumbisulfiet
5,5 ml gedestilleerd GIBCO H2O
1 ml 3 M NaOH
te ontbinden @ kamertemperatuur - 110 mg hydrochinon
1 ml gedestilleerd GIBCO H2O
te ontbinden @ 90 ° C (voor zolang het duurt om op te lossen, meng regelmatig)
Bij volledig is opgelost, mengen oplossing (a) en (b)
* Uit de buurt van het licht *
3. Bisulfiet Mutagenese
- Volledig verwijderen 500 ul lysisbuffer SDS en voeg 300 ul minerale olie (~ 20 uur). Elke lysisbuffer resterende zal verdunnen ee agarose bij verhitting en de kraal gevoeliger zijn oplossen in de volgende stappen. Ga direct door met bisulfiet mutagenese, of op te slaan bij -20 ° C gedurende maximaal 5 dagen.
- Indien van toepassing, verwijder eicellen uit de vriezer en laat ontdooien (slechts tot agarose kraal is relatief doorzichtig). Incubeer gedurende 2,5 minuut op een 90 ° C warmte-blok, waarna Incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
Let op: Niet mengen of roeren, het uitbreiden van langer dan 2,5 minuten, of fluctueren temperatuur. - Om denaturatie uit te voeren, verwijder dan de minerale olie en voeg 1 ml 0,1 M NaOH aan elke buis, flick en omkeren 5-6 keer.
- Incubeer gedurende 15 minuten in een 37 ° C waterbad, om te keren om de 3-4 minuten. De kraal moet drijven in de NaOH.
- Om bisulfiet behandeling uit te voeren, de buis voorzichtig draaien, verwijder vervolgens de NaOH en voeg 300 ul minerale olie en 500 ul bisulfiet oplossing. Incubeer de buis gedurende 3,5 uur in een 50 ° C waterbad. * Uit de buurt van het licht * Opmerking: lengte van incubatie kan moet empirisch worden bepaald gen van belang.
- Om desulfonation uit te voeren, incuberen op ijs gedurende 3 minuten en verwijder dan de minerale olie en de bisulfiet oplossing, draaien zachtjes en voeg 1 ml 0,3 M NaOH. Flick en omkeren 5-6 keer.
- Incubeer gedurende 15 minuten in een 37 ° C waterbad, om te keren om de 3-4 minuten. De kraal moet drijven in de NaOH.
- Was de monsters, door eerst voorzichtig draaien, verwijder vervolgens de NaOH en voeg 1 ml 1x TE pH 7,5. Schudden gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur (op een schudapparaat). Weer voorzichtig Spin, verwijder dan de 1x TE. Herhaal dit twee keer wassen.
- Voeg 1 ml autoclaaf DDH 2 O. Schudden gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur (op een schudapparaat). Draai voorzichtig, verwijder vervolgens de H 2 O. Twee keer herhalen DDH 2 O wassen.
- De pH van de bovenstaande vloeistof, het moet pH 5,0. Als nog te basic, weer wassen met H 2 O. Verwijder alle bovenstaande vloeistof, waardoor alleen de agarose zijnadvertentie.
4. 1 e en 2 e ronde PCR-amplificatie
- Bereid 1 e ronde PCR-mix ** tijdens het wassen **
| 10 uM Primer Forward Outer | 0,5 ul |
| 10 uM Primer Reverse Outer | 0,5 ul |
| 240 ng / ml tRNA | 1 pi |
| H2O | 13 pl |
Toevoegen aan Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR kralen
Schuif de vaste agarose kraal in de PCR-buis (~ 10 pi)
Na verwarming tot 70 ° C en meng
Voeg 25 ul minerale olie
Totaal: 50 pi
- Versterken
Opmerking: Een voorbeeld van fietsen voorwaarden muis Snrpn is denaturatie 2 minuten bij 94 ° C, gevolgd door 40 cycli van 30 seconden bij 94 ° C, 1 minuut bij 50 ° C en 1minuten bij 68 ° C en een laatste 10 minuten verlengingsstap bij 68 ° C. Annealing temperatuur voor 1 e ronde PCR voor muis H19 en Peg3 is 50 ° C. - Bereid 2 e ronde PCR-mix
| 10 uM Primer Forward Inner | 0,5 ul |
| 10 uM Primer Reverse Inner | 0,5 ul |
| H2O | 19 pl |
Toevoegen aan Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR kralen
Voeg 5 pl 1 e ronde product als een sjabloon. Verwarm de 1e ronde product tot 70 ° C gedurende 1 minuut op de agarose verzachten. Zorg ervoor dat u pipetteer onder de laag van minerale olie.
Voeg 25 ul minerale olie
Totaal: 50 pi
Let op: Geneste primersequenties voor Snrpn, H19 en Peg3 zijn te vinden in de markt-Velker et al. 10,12.
- Versterken
Opmerking: fietsen voorwaarden muis Snrpn is denaturatie 2 minuten bij 94 ° C, gevolgd door 40 cycli van 30 seconden bij 94 ° C, 1 minuut bij 50 ° C en 1 minuut bij 68 ° C en een laatste 10 minuten rek stap bij 68 ° C 10. Muis H19 en Peg3 vereisen een 50 ° C annealing temperatuur voor de 2 e ronde PCR. - Als een diagnostische test, kan tweede ronde monsters worden gesneden met een restrictie-enzym dat methylatie-of stam-specifieke.
| 2 e Ronde product | 4 pi |
| Restrictie-enzym | 1 pi |
| Buffer | 1 pi |
| H2O | 4 pi |
- Electrophorese de vertering producten 8% acrylamide gel. Een heterogene bands vertegenwoordigen meer dan een SequeNVU.
5. TA Klonering en kolonie-PCR
- Om 2e ronde product eerst warmte 70 klonen ° C gedurende 1 minuut op de agarose dan ligeren in de vector volgens de Promega pGEM-T vectorsysteem (Fisher Scientific Cat # A1360) verzachten.
| 2 e Ronde PCR | 1 pi |
| pGEMT-EASY vector | 1 pi |
| Ligase | 1 pi |
| H2O | 2 pi |
| 2x ligatiebuffer | 5 pi |
Incubeer overnacht @ 4 ° C in PCR-machine.
- Ontdooi bevoegde E.coli-cellen op ijs gedurende 15 minuten (Zymo Research Corp Cat # T3009). Voeg 3 pi ligatiereactie 8 pi E. coli en incubeer ligatie op ijs gedurende 15 minuten.
- Heat shock gedurende 40 seconden in een 42 ° C waterbad,en incubeer op ijs gedurende 2 minuten. Voeg 60 pi SOC medium en incuberen bij 37 ° C gedurende 1 uur (shaker).
- Plaats alle van de reactie mix op een LB / Agar / IPTG / Xgal / Amp plaat en incubeer plaat bij 37 ° C gedurende de nacht.
- Bereid kolonie PCR-mix
| 20 uM M13 voorwaartse primer | 0,7 pl |
| 20 uM M13 reverse primer | 0,7 pl |
| 5x Green Go Taq-Buffer | 7,0 pl |
| 10 mM dNTP | 0,7 pl |
| Taq DNA polymerase | 0,28 ul |
| H2O | 25,62 pl |
| 35 pl Totaal |
Voeg 35 pl kolonie PCR Master Mix in een PCR-buis. Kies een witte bacteriële kolonie van de plaat met een pipet, en zwenk het in de PCR-reactie.
- Versterken met denaturatie gedurende 10 minuten bij 94 ° C, gevolgd door 30 cycli van 45 seconden bij 94 ° C, 30 seconden bij 57 ° C en 1 minuut bij 72 ° C en een laatste 10 minuten rek bij 72 ° C. Electrophorese 4 pi van een 1,5% agarosegel. Stuur ~ 30 pi van het PCR product sequentie.
Opmerking: Voor eicellen, 5 kolonie PCR-producten worden gesequenced. - Zodra sequencing resultaten worden verkregen, kan methyleringspatronen worden gelezen. Elke originele CG dat bleef als een CG is gemethyleerd, en alle originele CG dat het nu een TG werd ongemethyleerd.
6. Representatieve resultaten
In ons werk hebben we test ingeprent methylatie in individuele eicellen en embryo's (figuur 1). Na geneste PCR amplificatie met primers bisulfiet omgezet, is het mogelijk om een conversie bevestigen visualiseren een juiste fragmentgrootte op een agarosegel (figuur 2). Een afzonderlijke oöcytvertegenwoordigt een ouderlijke allel en in principe heeft een bedrukt methylatiepatroon. Als zodanig kan tweede PCR-producten worden getest onbedoelde verontreiniging. Een restrictie-enzym gevoelig DNA methylering (zoals Hinfl of DpnII) kan worden gebruikt om de tweede PCR-product verteerbaar beoordelen of het een gemethyleerd of gemethyleerd allel (figuur 3) bevat. Een gemethyleerde C in het enzym herkenningssequentie gesplitst terwijl een gemethyleerd C wordt omgezet T niet meer herkend door het enzym en afgesneden. Elke MII eicel monster die zowel gemethyleerde en niet-gemethyleerd allelen dient te worden weggegooid, omdat het wijst op cumulus cellen verontreiniging (figuur 3). Na ligatie en transformatie kunnen succesvolle kolonie-PCR amplificatie gevisualiseerd op een agarose gel om monsters met de juiste grootte product worden verzonden voor sequencing (figuur 4). Tenslotte is de volgorde van vijf afzonderlijke cldie van een MII eicel moet produceren vijf identieke methylatie patronen en identieke nonCpG omrekeningskoersen (figuur 5a). Alle monsters meer dan een patroon bevat moet worden verwijderd (figuur 5b). Aangezien geovuleerde MII oöcyten twee exemplaren chromosoom of een aangesloten polaire lichaam, is het mogelijk voor het verkrijgen twee identieke sequentie patronen (figuur 5c). Wij raden gegevens te verwijderen uit eicellen die zeer ongelijke methylatie patronen hebben sinds cumulus cellen besmetting kan niet worden uitgesloten.
Figuur 1. Schematische voorstelling van de interne Eicel bisulfiet Mutagenese test.
Figuur 2. Vertegenwoordiger van de resultaten van 2 e ronde versterking voor Snrpn van een zingenle MII eicel op een 1,5% agarosegel. Lanes 1-4 zijn vier enkele MII eicellen en baan 5 is een negatieve controle (geen eicel). Verwachte amplicongrootte voor Snrpn is 420 bp. L, ladder.
Figuur 3. Representatieve resultaten van 2 t ronde Methylatiespecifieke restrictiedigestie van Snrpn van een MII eicel van een 8% acrylamide gel. Hinfl diagnostische restrictiedigestie toont ongemethyleerd DNA dat een T de restrictieplaats schaft herbergt (420bp, laan 1) of gemethyleerd DNA dat een C in herkenningsplaats bevat (cut, 262, 103 en 54 bp, laan 2). Spijsvertering met zowel gemethyleerde en niet-gemethyleerd restrictie-enzym sites (cut & uncut bands, laan 3) zijn een indicatie van cumulus cellen besmetting. L, ladder.
Figuur 4. Snrpn van een MII eicel op een 1,5% agarosegel. Verwachte amplicongrootte na ligatie van Snrpn in de pGEM-T Easy-vector en het gebruik van M13 forward en reverse primers is 656 bp. Lane 1-8 amplicons van klonen 1-8. Kloon 5 heeft een onjuiste ampliconlengte en mag niet worden verzonden voor het rangschikken.
Figuur 5. Vertegenwoordiger van sequencing resultaten voor Snrpn van een enkele MII eicel. Snrpn wordt gemethyleerd in eicellen. Zwarte cirkels geven gemethyleerde CpGs. Witte cirkels geven aan niet-gemethyleerd CpGs. CpG aantal en plaatsing is vertegenwoordiger voor een B6 stam vrouwelijke muis. a) Verwachte sequencing resultaten voor Snrpn van een enkele MII eicel. Slechts een enkele streng van het DNA te versterken in alle vijf klonen. Eicellen met een methylatie patroon en dezelfde niet-CpG conversie babbeln worden opgenomen in analyses (percentage omzetting van niet-CpGs rechts naast werd berekend als het aantal niet-CpG cytosines omgezet thymine als percentage van de totale niet-CpG cytosines). b) Sequencing resultaten voor Snrpn uit een enkele eicel MII met cumulus cellen besmetting. Let op de ongelijkheid tussen methylatie staten en conversie patronen die aangeven meerdere streng versterking. c) Sequencing resultaten voor Snrpn uit een enkele eicel MII met beide chromosoom-kopieën of polaire lichaam integratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze ene eicel test bevat een groot aantal stappen met een aantal die kritisch zijn en vereisen speciale zorg. De eerste is eicel wassen. Het is bijzonder belangrijk voor elke eicel wassen meerdere malen in vers medium daalt na hyaluronidase behandeling om zoveel cumuluscellen mogelijk. Bovendien, wanneer de overdracht van eicellen om de oplossing te zure tyrode voor zona pellucida verwijderen zorg ervoor dat omringende medium vrij is van cumulus cellen. De eicel is zeer kleverig na zona verwijderen, en alle omringende cumulus cellen kunnen zich gemakkelijk vast aan de eicel. Het is zeer moeilijk te verwijderen cumulus cel die vastzit aan een zona zonder oöcyt. Hoewel dit protocol zorgt voor detectie van cumulus cellen besmetting op latere tijdstippen, het is niet constructief, noch economisch, het volledige protocol ondergaan aan eicellen die waarschijnlijk zal worden weggegooid.
De tweede belangrijke stap is eicel inbedding. Bij het insluiten van de eicel in de agarose en lyswordt oplossing is van belang dat een laag smeltpunt (LMP) agarose verharden bij temperaturen zo weinig als 5 ° C onder 70 ° C. Als zodanig raden mengen agarose en lysis oplossing bij 70 ° C en het plaatsen van de afzonderlijke eicel op het glaasje in minimaal medium. Eenmaal klaar, pipet de agarose / lysis oplossing en verankeren de eicel in een voorbereide Eppendorf buis onder minerale olie, op een zorgvuldige nog tijdig.
Het is essentieel dat inactivatie van het proteinase K worden uitgevoerd bij 90 ° C gedurende 2,5 minuten. Afwijking van dit wordt niet aanbevolen. Hogere temperaturen of langere tijd kan schade aan het DNA, terwijl lagere temperaturen of kortere tijden kunnen inactiveert het proteinase K.
Ter herinnering, natriumbisulfiet en hydrochinon zijn lichtgevoelig. Oplossingen moeten worden bereid en verpakt in folie, oranje buizen en / of geplaatst in een donkere lade tot gebruik. Zodra de bisulfiet oplossing toegevoegd aan thij buis moet de buis bedekt met een folie of een donkere bedekt zak als incuberen bij 50 ° C. We maken gebruik van lege folie zakken van GE Healthcare, dat oorspronkelijk de warme start PCR-kralen.
Tot slot, zoals bij de meeste PCR's, raden wij aan de voorbereiding van elke ronde in een tijdige wijze. Overmatige vertragingen, met name na het mengen bij 70 ° C, verlaagt succes van amplificatie.
In de huidige tijd, een beperking van het protocol is dat het slagingspercentage van bisulfiet omgezet DNA-amplificatie van individuele eicellen varieert van 40% naar 65%, afhankelijk van het versterkte genfragment. Hoewel extra trouble-shooting kan stijging van dit percentage, is er een trade-off tussen de bisulfiet conversie behandeling een te lang of hard en niet over voldoende omrekeningskoersen (> 85-90%). Een tweede beperking is dat op dit moment bisulfiet mutagenese geen onderscheid kunnen maken tussen de repressieve 5-methylcytosine en de demethylering tussenproduct 5-hydroxymethylcytosine 13.
Diverse wijzigingen nodig zijn gebaseerd op gen of het gebied van belang. De bisulfiet conversie tijd kan het nodig optimalisatie voor de hoogste conversie percentage met de laagste DNA-schade. Wij stellen voor een bereik van 2,5 tot 4 uur (half uur stappen) voor bisulfiet behandeling. Verdere optimalisatie kan gaan PCR primer ontwerp omgezet sequenties van interesse (bijvoorbeeld http://www.urogene.org/methprimer/ ) en de optimalisering van PCR's op basis fragment lengte CG inhoud (zie Patterson et al.. voor extra bisulfiet mutagenese optimalisatiemogelijkheden 7). Een laatste wijziging is dat gel extractie van de 2 e ronde PCR-product kan nodig zijn als er een overvloedige primer-dimeren of niet-specifieke amplicons die zal integreren in de vector bij gekloond.
We hebben eerder aangetoond datprotocol is van toepassing op de individuele MII eicellen 12. We hebben ook getest zijn doeltreffendheid op de groei van eicellen bij een reeks van verschillende diameters eicel, met dezelfde percentages van succesvolle amplificatie van DNA omgezet. Belangrijk in vergelijking met andere bisulfiet mutagenèse procedures die niet werkzaam zijn voor methylering studies op een afzonderlijke cel dit protocol kan de analyse van DNA methylatie van individuele oöcyten en vroege embryo's. Dit is essentieel voor de voortplanting en ontwikkeling biologisch onderzoek, in het bijzonder als het gaat om de manipulaties van geslachtscellen en vroege embryo's. Toekomstige toepassingen kan de analyse van DNA methyleringspatronen in enkele cellen uit elke bron, waaronder in vivo afgeleide en gekweekte cellen. Daarnaast hebben wij een afzonderlijke blastocyst assay dat DNA en RNA uit dezelfde embryo herstelt, waardoor zowel expressie en methylering gegevens worden verkregen. Een toekomstige toepassing zal betrekken het wijzigen van de singlecoile eicel test voor het RNA voor expressie analyses en DNA-methylatie assays voor terug te krijgen. Een andere optimalisatie zou zijn om duplex-assays voor dezelfde eicel, vergelijkbaar met El Hadj et al. 14, dat zou voor de methylatie detectie mogelijk te maken op een somatisch gemethyleerde, eicel-embryo unmethyated gen om zodoende de detectie van cumulus cellen besmetting uit te voeren.
DNA-methylatie analyses kunnen variëren van genoom-breed tot locus-specifieke. Genoom-brede methoden, zoals gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP) in combinatie met micro-arrays of de volgorde vergen doorgaans overvloedige hoeveelheden materiaal. Locusspecifieke methoden gecombineerd bisulfiet restrictieanalyse (COBRA) met Methylatiespecifieke restrictie-enzymen, of MethylDetector kit (Active Motif) omvatten minder dan optimaal voor een blastocyst analyses waardoor onvoldoende herstel van DNA, PCR vertekening en gebrek reproduceerbaarheid. Een alternatieve benadering van een eicel en eArly embryo methylatie analyse gebruik gemaakt van de EZ-DNA-methylatie kit (Zymo Research) met een beperkte verwatering bisulfiet pyrosequencing techniek 14, hoewel de gerapporteerde succespercentages van bisulfiet omgezet DNA-amplificatie was lager dan de methode die hier beschreven.
Bisulfiet mutagenèse de gouden standaard voor DNA-analyse methylering, en het is duidelijk dat de analyse van afzonderlijke cellen een belangrijke stap voorwaarts. Agarose inbedding maakt kleinere steekproefomvang te analyseren met bisulfiet behandeling, zoals agarose beschermt tegen DNA-degradatie en voorkomt DNA-verlies tijdens talrijke protocol stappen. Echter, in vergelijking met de blastocyst, een oöcyt is ongeveer 3-6 pg van DNA. Onze gewijzigde protocol, dat enkele eicellen nestelt in agarose met lysis buffer, voorkomt DNA-verlies vanaf de eerste lysis stap en gematigden de harde bisulfiet behandeling. Samenvattend is het voordeel van een eicel analyse is dat het mogelijkdetectie van onbedoelde cumulus cellen besmetting en ontmaskeren van zeldzame gebeurtenissen en het wegnemen van vooroordelen PCR in gepoolde monsters. In totaal wordt in dit gewijzigde protocol voorziet in hoogwaardige gegevens over de methylatie status van de individuele eicellen en het begin van embryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Western Ontario, de afdeling Obstetrie en Gynaecologie, en een subsidie ER06-02-188 uit de Ministryof onderzoek en innovatie, Early Onderzoeker Award. MMD werd ondersteund door een CIHR Training Program in de voortplanting, de vroege ontwikkeling en de impact op gezondheid (REDIH) Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 | Bioshop(Tris)Sigma (EDTA) | TRS001.5 E5134 | |
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70 °C and 90 °C Heat Blocks | |||
| 37 °C and 50 °C Waterbaths (42 °C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine |
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
