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Biology

Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese

doi: 10.3791/4046 Published: June 27, 2012

Summary

Bisulfit-Mutagenese ist der Goldstandard für die Analyse von DNA-Methylierung. Unsere modifizierte Protokoll ermöglicht DNA-Methylierungs-Analyse auf der Ebene einzelner Zellen und wurde speziell für die einzelnen Eizellen entwickelt. Es kann auch für die Spaltung-Embryonen verwendet werden.

Abstract

Epigenetik umfasst alle vererbbar und reversible Modifikationen an Chromatin, die alter-Gen Zugänglichkeit und damit die primären Mechanismen für die Regulierung der Gentranskription 1 sind. DNA-Methylierung ist eine epigenetische Modifikation, die überwiegend fungiert als repressiv-Marke. Durch die kovalente Addition einer Methylgruppe an Cytosin in CpG-Dinukleotide, kann es zu rekrutieren weitere Proteine ​​und repressiven Histon-Modifikationen, um Prozesse in kondensierenden Chromatin und Abschaltung von Genen 2 beteiligt zu initiieren. DNA-Methylierung ist wichtig für die normale Entwicklung, da sie eine entscheidende Rolle in der Entwicklungsbiologie Programmierung, Zelldifferenzierung, Unterdrückung von retroviralen Elementen, X-Chromosom-Inaktivierung und genomische Prägung spielt.

Eine der mächtigsten Methoden zur DNA-Methylierungs-Analyse ist Bisulfit-Mutagenese. Natriumbisulfit ist ein DNA-Mutagen, die Cytosine desaminiert in Uracile. Nach PCR-Amplifikation und seque ncing werden diese Umwandlung Ereignisse wie Thymine erkannt. Methylierte Cytosine werden aus Desaminierung geschützt und damit als Cytosine bleiben, welche die Identifizierung von DNA-Methylierung bei der einzelne Nukleotid-Ebene 3. Die Entwicklung des Bisulfit-Mutagenese-Assay wurde von den ursprünglich gemeldeten 4-6 gegen diejenigen, die mehr sensitive und reproduzierbare 7 sind fortgeschritten. Ein wichtiger Fortschritt wurde Einbetten kleiner DNA-Mengen in einem Agarose-Kügelchen, wodurch Schutz der DNA vor der rauen Bisulfit-Behandlung 8. Damit konnte die Methylierungsanalyse auf Pools von Eizellen und Embryonen im Blastozysten-9 durchgeführt werden. Die anspruchsvollste Bisulfit-Mutagenese-Protokoll auf dem neuesten Stand ist für einzelne Blastozyste-Embryonen 10. Da jedoch Blastozysten im Durchschnitt 64 Zellen (mit einem Gehalt von 120 bis 720 pg genomischer DNA) haben, ist diese Methode nicht wirksam für die Methylierung Studien zu einzelnen Eizellen oder Embryonen-Spaltung.

Zelt "> Aufnehmen von Hinweisen aus Agarose Einbettung von Minuten DNA-Mengen einschließlich Oozyten 11, hier präsentieren wir eine Methode, bei der Eizellen direkt in einem Agarose-Lyse-Lösung und Wulst unmittelbar nach der Abruf und die Entfernung der Zona pellucida von der Eizelle eingebettet sind. Dies ermöglicht uns, Bypass die beiden wichtigsten Herausforderungen der einzigen Eizelle Bisulfit-Mutagenese:. Schutz einer winzigen Menge von DNA vor dem Abbau und anschließende Verlust während der zahlreichen Schritte Protokoll Wichtig ist, wie Daten aus einzelnen Eizellen gewonnen werden, die Frage der PCR-Bias-Pools innerhalb Außerdem entfällt. , unbeabsichtigte Kontamination Cumulus-Zellen nachweisbar ist, durch diese Methode, da jede Probe mit mehr als einem Methylierungsmuster von der Analyse ausgeschlossen werden kann 12. Dieses Protokoll bietet ein verbessertes Verfahren für eine erfolgreiche und reproduzierbare Analyse der DNA-Methylierung in der Ebene einzelner Zellen und ist ideal geeignet, für die einzelnen Eizellen sowie Embryonen-Spaltung.

Protocol

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TAG 1

Stellen Sie folgende Lösungen frisch auf den Tag der Eizellenentnahme mit sterilem, destilliertem Wasser wie GIBCO Wasser. Um die Möglichkeit von DNA-Kontamination zu verringern, die Handschuhe wechseln oft und Filterspitzen. Halten Röhrchen entfernt, wenn sie geöffnet abgewinkelt ist und Erinnerung alle Rohre, wenn nicht in Gebrauch ist. Wir empfehlen, dass Lösungen wie n +1 gemacht werden.

3% LMP-Agarose

30 mg niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarose
bis zu 1 ml H 2 O GIBCO
lösen bei 70 ° C

Lysis Solution

8 ul Lysispuffer
1 ul Proteinase K
1 ul 10% IGEPAL
auf Eis bis zur Verwendung

2.01 Agarose: Lysis Solution (10 ul pro einzelne Eizelle, ist Betrag für 3 Oozyten)

20 ul 3% LMP-Agarose
10 pl Lysis Solution
mischen bei 70 ° C

SDS LySIS-Puffer (501 ul pro einzelnen Eizelle)

1x TE pH 7,5 450 ul
10% SDS 50 pl
Proteinase K 1 ul
501 ul

1. Eizellenentnahme

  1. Legen Sie die Maus seziert Eileiter in M2-Medium, und reißen Sie die Ampullen, die Cumulus-Zell-Komplex zu extrahieren.
  2. Trennen Sie die Eizellen aus dem Cumulus-Zell-Komplex mit 0,3 mg / ml Hyaluronidase-Lösung in einem 30 ul Tropfen M2-Medium. Halten Sie die Oozyten in Lösung nur solange, wie es um die Cumulus-Zellen zu entfernen dauert, wie lange Exposition beschädigen könnten. Waschen Sie die Oozyten 3x in 30 ul Tropfen M2-Medium, das Entfernen Kumuluszellen in regelmäßigen Abständen.
  3. Entfernen Sie das Zona pellucida mittels saurer Tyrode-Lösung. Legen Sie die Eizellen in einem 30 ul Tropfen der Lösung zuerst, und dann auf einen anderen übertragen 30ul Tropfen, wie alle Medien mitgeführt wird die Säure zu verdünnen und seine Effizienz zu reduzieren. Halten der Oozyten in Lösung nur so lange wie es die Zona zu entfernen, wie lange Belichtungszeit beschädigen könnten erfolgt. Hinweis: eine erhöhte Konzentration von sauren Tyrode-Lösung oder Pronase kann für den menschlichen Proben verwendet werden, da das menschliche Zona pellucida ist gegenüber einer Behandlung mit sauren Tyrode-Lösung als die Maus.
  4. Waschen Sie die Eizellen noch einmal in einem 30 ul Tropfen M2-Medium.

2. Agarose Embedding und Lysis

  1. Um Agarose Einbettung durchführen, legen Sie die Lyse-Lösung auf einem 70 ° C Heizblock. Fügen Sie den vorgeheizten LMP-Agarose zur Lyse-Lösung, wodurch ein 2:1 Agarose: Lyse-Lösung.
  2. Legen Sie eine einzelne Eizelle auf einen sauberen Objektträger aus Glas in minimalen M2 Medien. Nehmen Sie bis 10 ul der Agarose: Lyse-Lösung in eine Pipettenspitze, und (unter dem Mikroskop) sanft pressen eine kleine Menge (ca. 1 mu l oder weniger) auf den Objektträger, so dass sie mit dem minim mischenal Medien. Vorsichtig holen die Eizelle in die Pipettenspitze und legen Sie alle 10 pl in ein Eppendorf-Röhrchen mit 300 ul Mineralöl so die Raupe einer Kugel bildet.
    Hinweis: Dieser Prozess muss ziemlich schnell als der Agarose geschehen wird hart, wenn die Temperatur sinkt so wenig wie 5 ° C unter 70 ° C.
  3. Das Röhrchen auf Eis für 10 Minuten. Zur Lyse durchführen, entfernen Sie die 300 ul Mineralöl und fügen Sie 500 ul des SDS Lysepuffer. Inkubieren über Nacht in einem 50 ° C Wasserbad.
    Hinweis: Lyse-Lösung (Tabelle 1) kann auch für diesen Zweck verwendet werden.

TAG 2

Stellen Sie folgende Lösungen frisch am Tag der Bisulfit-Mutagenese. Um die Chance der DNA-Kontamination zu verringern, die Handschuhe wechseln oft und Filterspitzen. Halten Röhrchen entfernt, wenn sie geöffnet abgewinkelt ist und Erinnerung alle Rohre, wenn nicht in Gebrauch ist. Wir empfehlen, dass Lösungen wie n +1 gemacht werden.

<td> 2,4 g NaOH in 20 ml autoklavierten ddH 2 O
3 M NaOH
0,1 M NaOH 0,5 ml 3M in 14,5 ml autoklavierten ddH 2 O
0,3 M NaOH 1,5 ml 3M in 13,5 ml autoklavierten ddH 2 O

2,5 M Bisulfit-Lösung

  1. 3,8 g Natriumbisulfit
    5,5 ml GIBCO destilliertem H 2 O
    1 ml 3 M NaOH
    auflösen @ Raumtemperatur
  2. 110 mg Hydrochinon
    1 ml GIBCO destilliertem H 2 O
    aufzulösen bei 90 ° C (nur so lange wie es zu lösen hat, zu mischen regelmäßig)

Wenn vollständig aufgelöst ist, zu mischen Lösung (a) und (b)
* Fernhalten von Licht *

3. Bisulfit-Mutagenese

  1. Vollständig entfernen Sie die 500 ul SDS Lysepuffer und 300 ul Mineralöl (~ 20 Stunden). Jede Lysepuffer übrigen wird verdünnen the Agarose, wenn es erhitzt wird und der Wulst wird anfälliger für Auflösen in den nachfolgenden Schritten. Fahren Sie mit Bisulfit-Mutagenese sofort, oder bei -20 ° C für bis zu 5 Tage.
  2. Entfernen Sie gegebenenfalls Oozyten aus dem Gefrierschrank und tauen (nur bis Agarosekugel relativ lichtdurchlässig ist). Inkubieren für 2,5 Minuten auf 90 ° C Heizblock, nach dem Inkubieren auf Eis für 10 Minuten.
    Hinweis: Verwenden Sie nicht gleichzeitig oder rühren, verlängern länger als 2,5 Minuten, oder schwanken Temperatur.
  3. Zur Denaturierung durchführen, entfernen Sie die Mineralöl-und 1 ml 0,1 M NaOH in jedes Röhrchen, Flick und invertieren 5-6 mal.
  4. Inkubation: 15 Minuten bei 37 ° C im Wasserbad, Invertieren alle 3-4 Minuten. Der Wulst sollte in der NaOH schweben.
  5. Um Bisulfit-Behandlung durchzuführen, drehen Sie das Rohr vorsichtig, dann entfernen Sie die NaOH und 300 ul Mineralöl und 500 pl Bisulfit-Lösung. Das Röhrchen für 3,5 Stunden in einem 50 ° C im Wasserbad. * Fernhalten von Licht * Hinweis: Die Länge der Inkubation Möglicherweise müssen empirisch für Gen von Interesse bestimmt werden.
  6. Um Desulfonierung durchführen, Inkubation auf Eis für 3 Minuten, entfernen Sie dann die Mineralöl-und die Bisulfit-Lösung, spinnen sanft, und 1 ml 0,3 M NaOH. Flick und invertieren 5-6 mal.
  7. Inkubation: 15 Minuten bei 37 ° C im Wasserbad, Invertieren alle 3-4 Minuten. Der Wulst sollte in der NaOH schweben.
  8. Waschen Sie die Proben, indem Sie zunächst die Spinnerei sanft, dann entfernen Sie die NaOH und 1 ml 1x TE pH 7,5. Schütteln Sie für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur (auf einem Schüttler). Spin sanft wieder, dann entfernen Sie die 1x TE. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal Waschen.
  9. 1 ml autoklavierten ddH 2 O. Schütteln Sie für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur (auf einem Schüttler). Spin sanft, dann entfernen Sie das H 2 O. Wiederholen Sie ddH 2 O Waschen zweimal.
  10. Den pH-Wert des Überstands; sollte pH 5,0 sein. Wenn immer noch zu einfach, nachwaschen mit H 2 O. Entfernen Sie das gesamte Überstand, so dass nur die Agarose seinad.

4. 1. und 2. Runde PCR-Amplifikation

  1. Bereiten 1. Runde PCR-Mix ** beim Waschen **
10 uM Primer vorderen äußeren 0,5 ul
10 uM Primer Reverse-Outer 0,5 ul
240 ng / ml tRNA 1 ul
H 2 O 13 ul

In den Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR Perlen
Schieben Sie die feste Agarose-Kügelchen in die PCR-Röhrchen (~ 10 ul)
Hitze bis 70 ° C und mischen
In 25 ul Mineralöl
Gesamt: 50 pl

  1. Verstärken
    Hinweis: Ein Beispiel-Bedingungen für Maus Snrpn ist Denaturierung 2 min bei 94 ° C, gefolgt von 40 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 ° C, 1 Minute bei 50 ° C und 1Minute bei 68 ° C und eine endgültige 10 Minuten Verlängerungsschritt bei 68 ° C Glühtemperatur für 1. Runde PCR für Maus und Peg3 H19 beträgt 50 ° C.
  2. Bereiten 2. Runde PCR-Mix
10 uM Primer vordere innere 0,5 ul
10 uM Primer Reverse-Innere 0,5 ul
H 2 O 19 ul

In den Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR Perlen
Geben Sie 5 ul 1. Runde Produkt als Vorlage. Erhitzen Sie die 1. Runde Produkt bis 70 ° C für 1 Minute, um die Agarose zu erweichen. Stellen Sie sicher, unter der Schicht aus Mineralöl pipettieren.
In 25 ul Mineralöl
Gesamt: 50 pl

Hinweis: Verschachtelte Primersequenzen für Snrpn, H19 und Peg3 kann in Market-Urteil Velker et al 10 zu finden,12.

  1. Verstärken
    Hinweis: Die Zyklusbedingungen für Maus Snrpn ist Denaturierung 2 min bei 94 ° C, gefolgt von 40 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 ° C, 1 Minute bei 50 ° C und 1 Minute bei 68 ° C und eine endgültige Dehnung 10 Minuten Schritt bei 68 ° C 10. Maus H19 und Peg3 eine 50 ° C Annealing-Temperatur für 2 Runde PCR.
  2. Als eines diagnostischen Tests können zweiten Runde Proben mit einem Restriktionsenzym, das Methylierung oder Stamm-spezifische geschnitten werden.
2. Runde Produkt 4 ul
Restriktionsenzym 1 ul
Puffer 1 ul
H 2 O 4 ul
  1. Elektrophorese die Verdauungsprodukte auf einem 8% igen Acrylamidgel. Etwaige heterogenen Banden repräsentieren mehr als eine sequence.

5. TA Cloning und Kolonie-PCR

  1. Um 2. Runde Produkt zunächst erwärmt auf 70 klonen ° C für 1 Minute, um die Agarose, dann Ligat in den Vektor unter Verwendung des Promega pGEM-T Vektor-System (Fisher Scientific Cat # A1360) zu erweichen.
2. Runde PCR 1 ul
pGEMT-easy-Vektor 1 ul
Ligase 1 ul
H 2 O 2 ul
2x Ligationspuffer 5 ul

Inkubieren über Nacht bei 4 ° C in PCR-Maschine.

  1. Auftauen kompetente E. coli Zellen auf Eis für 15 Minuten (Zymo Research Corp Cat # T3009). In 3 ul Ligationsreaktion zu 8 ul E. coli und inkubieren Ligation auf Eis für 15 Minuten.
  2. Hitzeschock für 40 Sekunden in einem 42 ° C im Wasserbad,und auf Eis für 2 Minuten inkubiert. In 60 ul SOC-Medium und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde (im Shaker).
  3. Legen Sie alle der Reaktionsmischung auf eine LB / Agar / IPTG / X-Gal / Amp-Platte und inkubieren Platte bei 37 ° C über Nacht.
  4. Bereiten Kolonie-PCR-Mix
20 uM M13 Vorwärts-Primer 0,7 ul
20 uM M13 Reverse Primer 0,7 ul
5X Grüne Go Taq-Puffer 7,0 ul
10 mM dNTP 0,7 ul
Taq DNA-Polymerase 0,28 ul
H 2 O 25,62 ul
Insgesamt 35 ul

In 35 ul Colony PCR Master Mix in ein PCR-Tube. Wählen Sie einen weißen Bakterienkolonie von der Platte mit einer Pipettenspitze und wirbeln sie in die PCR-Reaktion.

  1. Verstärken mit Denaturierung für 10 Minuten bei 94 ° C, gefolgt von 30 Zyklen von 45 Sekunden bei 94 ° C, 30 Sekunden bei 57 ° C und 1 Minute bei 72 ° C und eine endgültige Dehnung 10 Minuten bei 72 ° C 4 ul Elektrophorese auf einem 1,5% Agarosegel unterworfen. Senden ~ 30 ul des PCR-Produkts für die Sequenzierung.
    Hinweis: Oozyten, 5 Kolonie-PCR-Produkte sequenziert.
  2. Sobald Sequenzierung erhaltenen Ergebnisse sind, können Methylierungsmuster zu lesen. Jede Original-CG, die als CG blieb wurde methyliert, und jedes Original CG, die heute ein TG wurde nicht methyliert.

6. Repräsentative Ergebnisse

In unserer Arbeit mit dem Aufdruck wir Assay-Methylierung in einzelnen Eizellen und Embryonen (Abbildung 1). Nach verschachtelten PCR-Amplifikation mit Primern konvertierter, ist es möglich, einen erfolgreichen Umwandlung durch Visualisierung einer korrekten Fragments die auf einem Agarosegel (2) zu bestätigen. Eine einzelne Eizellestellt einen elterlichen Allel, und in der Theorie, hat man aufgedruckten Methylierungsmuster. Als solches kann zweiten Runde PCR-Produkte für unbeabsichtigte Verunreinigungen geprüft werden. Ein Restriktionsenzym empfindlich auf DNA-Methylierung (wie HinfI oder DpnII) verwendet werden, um die zweite Runde PCR-Produkt verdauen zu beurteilen, ob ein methyliertes Allel oder unmethylierten (3) enthält. Ein methyliertes C innerhalb des Enzym-Erkennungssequenz gespalten wird, während ein unmethylierten C, die T umgewandelt wird nicht mehr durch das Enzym erkannt und ist nicht geschnitten. Jede Probe, die MII-Eizelle sowohl methylierter und nicht methylierter Allele sollte verworfen werden, da es indikativ für Cumulus Zellkontamination (Abbildung 3) ist. Nach Ligation und Transformation, kann eine erfolgreiche Kolonie PCR-Amplifikation werden auf einem Agarosegel visualisiert werden, um sicherzustellen, Proben mit dem richtigen Produkt zur Sequenzierung Größe gesendet werden (Abbildung 4). Schließlich wird die Sequenz von fünf einzelnen cldiejenigen aus einer MII Eizelle produzieren sollten fünf identische Methylierungsmuster und identisch nonCpG Conversion-Raten (Abbildung 5a). Alle Proben, die mehr als ein Muster enthalten, sollten verworfen werden (Abbildung 5b) werden. Seit ovulierten MII-Oozyten zwei Chromosom-Kopien oder eine angehängte Polkörper haben, gibt es eine Möglichkeit für den Erhalt von zwei ähnlichen Sequenz Muster (Abbildung 5c). Wir empfehlen Verwerfen von Daten aus Eizellen, die höchst unterschiedliche Methylierungsmuster haben seit Cumulus Zellkontamination kann nicht ausgeschlossen werden.

1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Einzel-Oocyte Bisulfit-Mutagenese-Assay.

2
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus 2. Runde Verstärkung für Snrpn aus einer singenle MII Oozyte auf einem 1,5% Agarosegel unterworfen. Spuren 1-4 sind vier Single-MII-Oozyten und Spur 5 ist eine Negativ-Kontrolle (keine Eizelle). Erwartete Fragmentlänge für Snrpn beträgt 420 bp. L, Leiter.

Abbildung 3
3. Repräsentative Ergebnisse von 2 Runde methylierungsspezifische Restriktionsverdau für Snrpn aus einer Eizelle MII auf einem 8% igen Acrylamidgel. HinfI diagnostischen Restriktionsverdau zeigt unmethyliert DNA, die ein T, das die Restriktionsstelle schafft trägt (420bp, Spur 1) oder methylierte DNA, die eine C innerhalb Erkennungsstelle enthält (Schnitt, 262, 103 und 54 bp, Spur 2). Die Verdauung in denen sowohl methylierter und nicht methylierter Restriktionsenzymstellen (Cut & Uncut Bands, Spur 3) sind bezeichnend für Cumulus-Zell-Kontamination. L, Leiter.

Abbildung 4
Abbildung 4. Snrpn aus einer Eizelle MII auf einem 1,5% Agarosegel unterworfen. Voraussichtlich Fragmentlänge nach Ligation Snrpn in den pGEM-T Easy Vektor und unter Verwendung von M13 Vorwärts und Rückwärts-Primer ist 656 bp. Lane 1-8, 1-8 Amplikons aus Klonen. Clone 5 hat eine falsche Fragmentlänge und sollte nicht zum Sequenzieren geschickt werden.

Abbildung 5
Abbildung 5. Vertreter Sequenzierung Ergebnisse für Snrpn aus einer einzigen Eizelle MII. Snrpn wird in Oozyten methyliert. Schwarze Kreise zeigen methylierte CpG. Weiße Kreise zeigen unmethylierte CpGs. CpG Anzahl und die Platzierung ist repräsentativ für eine B6-Stamm weiblichen Maus. a) Erwartete Ergebnisse für die Sequenzierung Snrpn aus einer einzigen Eizelle MII. Nur ein einzelner DNA-Strang ist in allen fünf Klone zu amplifizieren. Oozyten mit einem einzigen Methylierungsmuster und identische nicht-CpG-Konvertierung Geplappern sollten Auswertung einbezogen werden (prozentuale Umwandlung von nicht-CpG angegeben auf der rechten Seite wurde die Anzahl der nicht-CpG Cytosine, die, wie in Prozent der gesamten nicht-CpG Cytosine Thymin berechnet). b) Die Sequenzierung Ergebnisse für Snrpn aus einer einzigen Eizelle MII mit Cumulus-Zell-Kontamination. Beachten Sie die Unähnlichkeit zwischen Methylierung Staaten und Muster, die Umwandlung Mehrfachsteckgliedern Verstärkung. c) Sequenzierung Ergebnisse für Snrpn aus einer einzigen Eizelle MII mit beiden Chromosomen-Kopien oder Polkörper Eingliederung.

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Discussion

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Diese einzelne Eizelle Assay enthält viele Schritte mit einer Zahl, die kritisch sind und bedürfen einer besonderen Pflege. Die erste ist Oozyte Waschen. Es ist besonders wichtig zu waschen Jeder Oocyt mehrmals in frischem Medium fällt nach Hyaluronidase-Behandlung, so viele Kumuluszellen wie möglich zu entfernen. Darüber hinaus bei der Übertragung von Eizellen, um saure Tyrode-Lösung für Zona pellucida Entfernung sicherstellen umgebenden Medium ist klar, von Cumulus-Zellen. Die Eizelle ist sehr klebrig zona nach Entfernung, und alle umgebenden Cumulus-Zellen lassen sich leicht stecken bleiben, um die Eizelle. Es ist sehr schwierig, eine Cumulus Zelle, die einer Zona-freien Oozyte geklebt ist, zu entfernen. Während dieses Protokoll ermöglicht für den Nachweis von Cumulus Zellkontamination zu späteren Zeitpunkten, ist es nicht konstruktiv, noch wirtschaftlich, um die volle Protokoll an Oozyten, die wahrscheinlich werden verworfen unterziehen.

Die zweite kritische Schritt ist Oocyte Einbettung. Wenn die Einbettung der Eizelle in der Agarose und LysLösung ist, ist es wichtig, dass die niedrigen Schmelzpunkt (LMP) Agarose härtet bei Temperaturen von nur 5 ° C unter 70 ° C beachten Als solches empfehlen wir Ihnen das Mischen der Agarose und Lyse-Lösung bei 70 ° C, und dann den einzelnen Eizelle auf dem Objektträger in Minimalmedium. Einmal fertig, Pipette die Agarose / Lyse-Lösung einbinden und die Eizelle in eine vorbereitete Eppendorf-Röhrchen unter Mineralöl, in einer sorgfältigen noch rechtzeitig.

Es ist wichtig, dass die Wärme Inaktivierung der Proteinase K bei 90 ° C für 2,5 Minuten durchgeführt werden. Abweichend hiervon wird nicht empfohlen. Höhere Temperaturen oder längere Zeiten kann zur Beschädigung der DNA, während niedrigere Temperaturen oder kürzere Zeiten nicht inaktivieren kann die Proteinase K.

Zur Erinnerung sind Natriumbisulfit und Hydrochinon lichtempfindlich. Lösungen sollten vorbereitet und dann in Folie gewickelt, gelb, Rohre und / oder platziert in einer dunklen Schublade bis zum Gebrauch. Sobald der Bisulfit-Lösung wurde auf t aufgenommen wordener Rohr, sollte das Rohr mit einer Folie oder einem dunklen abgedeckt Tasche abgedeckt werden, wenn die Probe bei 50 ° C Wir verwenden leeren Folienbeutel von GE Healthcare, die ursprünglich enthielt die Hot-Start PCR-Perlen.

Schließlich, als mit den meisten PCRs, empfehlen wir die Vorbereitung jeder Runde in einer fristgerechten Weise. Übermäßigen Verzögerungen, insbesondere nach dem Mischen bei 70 ° C, verringert Erfolgsrate der Amplifikation.

Zum jetzigen Zeitpunkt ist eine Einschränkung des Protokolls, dass die Erfolgsrate von Bisulfit-konvertierter DNA-Amplifikation von einzelnen Oozyten von 40% auf 65% in Abhängigkeit von der Gen-Fragment amplifiziert reicht. Während zusätzliche Fehlersuche diesen Prozentsatz erhöhen können, gibt es einen Trade-off zwischen der Bisulfit-Konvertierung Behandlung zu lang oder hart und nicht über ausreichende Conversion-Raten (> 85-90%). Eine zweite Einschränkung ist, dass derzeit Bisulfit-Mutagenese kann nicht zwischen repressiven 5-Methylcytosin und der Demethylierung Zwischen-5-hy unterscheidendroxymethylcytosine 13.

Mehrere Modifikationen können auf der Grundlage Gen oder Region von Interesse erforderlich sein. Die Bisulfit-Konvertierung Zeit kann verlangen, Optimierung für die höchste prozentuale Umwandlung mit der niedrigsten DNA-Schäden. Wir empfehlen einen Bereich von 2,5 bis 4 Stunden (halbe Stunde-Schritten) für die Bisulfit-Behandlung. Weitere Optimierungen können PCR-Primer-Design für konvertierte Sequenzen von Interesse (zum Beispiel beinhalten http://www.urogene.org/methprimer/ ), sowie die Optimierung von PCR-Programme auf Fragment-Längen-und CG-Gehalt beruhen (vgl. Patterson et al. für Bisulfit-Mutagenese zusätzliche Optimierungsmöglichkeiten 7). Eine letzte Modifikation ist, dass Gel Extraction der 2. Runde PCR-Produkt erforderlich, wenn es eine Vielzahl an Primer-Dimeren oder nicht-spezifische PCR, die in den Vektor integriert werden, wenn kloniert werden.

Wir haben früher gezeigt, dass dieseProtokoll ist für die einzelnen MII-Oozyten mit Wirkung zum 12.. Wir haben auch seine Effizienz auf wachsenden Oozyten getestet bei einer Reihe von verschiedenen Durchmessern Eizelle, mit den gleichen Raten der erfolgreiche Amplifikation von DNA umgewandelt. Wichtig ist, dass im Vergleich zu anderen Bisulfit Mutageneseverfahren, die nicht wirksam für die Methylierung Studien über eine einzelne Zelle, können dieses Protokoll die Analyse der DNA-Methylierung der einzelnen Oozyten und frühe Embryonen. Dies ist essentiell für die Fortpflanzung und Entwicklung Biologie-Studium, speziell als es um die Manipulation von Keimzellen und Embryonen im Frühstadium bezieht. Zukünftige Anwendungen kann die Analyse der DNA-Methylierungsmuster in einzelnen Zellen jeglicher Herkunft, darunter in vivo gewonnenen und kultivierten Zellen umfassen. Zusätzlich haben wir eine individuelle Blastozyste Assay, DNA und RNA aus dem gleichen Embryos wieder entwickelt, die sowohl für die Expression und Methylierung Daten erhalten werden. Eine zukünftige Anwendung wird die eine Änderung des SINGLe Eizelle Assay zu erholen RNA für die Expression Analysen sowie DNA-Methylierungs-Assays für. Eine weitere Optimierung wäre, Duplex-Assays für den gleichen Eizelle, ähnlich wie bei El Hajj et al 14, die für die Methylierung Detektion bei einer somatisch methylierte, Oozyten-Embryo unmethyated Gens erlauben, würde wodurch Erkennung von Cumulus Zellkontamination durchzuführen.

DNA-Methylierungs-Analysen können aus genomweiten zu Locus-spezifischen reichen. Genom-weite Verfahren, wie methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP) in Verbindung mit Mikroarrays oder Sequenzierung erfordern typischerweise reichliche Mengen an Material. Locus-spezifische Methoden, die kombiniert Bisulfit-Restriktionsanalyse (COBRA) mit Methylierungs-spezifische Restriktionsenzyme, oder die MethylDetector Kit (Active Motif) gehören, sind weniger als optimal für einzelne Blastozyste Analysen, was zu einer unzureichenden Erholung der DNA, PCR-Bias und der Mangel an Reproduzierbarkeit. Ein alternativer Ansatz zur einzigen Eizelle und eArly Embryo-Methylierungs-Analyse verwendet die EZ-DNA-Methylierungs-Kit (Zymo Forschung) mit einer begrenzten Verwässerung Bisulfit-Technik Pyrosequenzierung 14, obwohl die berichteten Erfolgsraten von Bisulfit-konvertierter DNA-Amplifikation war niedriger als die hier beschriebene Methode.

Bisulfit-Mutagenese ist der Goldstandard für die Analyse von DNA-Methylierung, und es ist klar, dass die Analyse von Einzelzellen ist ein wichtiger Schritt nach vorn. Agarose Einbettung ermöglicht kleinere Stichprobengrößen mit Bisulfit-Behandlung untersucht werden, wie Agarose schützt vor DNA-Abbau und verhindert, dass DNA-Verlust während der zahlreichen Schritte Protokoll. Wenn jedoch der Blastozyste im Vergleich ist eine einzige Eizelle etwa 3-6 pg genomischer DNA. Unsere modifizierte Protokoll, das einzelne Oozyten bettet in Agarose mit Lyse-Puffer verhindert, dass DNA-Verlust, beginnend an der ersten Lyseschritt und moderiert den rauen Bisulfit-Behandlung. Zusammenfassend sind die Vorteile des einzelnen Eizelle Analyse, dass es erlaubtDetektion einer unbeabsichtigten Kontamination Cumulus-Zellen sowie entlarven seltene Ereignisse und Ausräumung von Vorurteilen in PCR-Mischproben. Insgesamt bietet das veränderte Protokoll zuverlässige Daten über den Methylierungsstatus einzelner Oozyten und frühen Embryonen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der University of Western Ontario, der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie unterstützt, und einen Zuschuss ER06-02-188 aus dem Ministryof Forschung und Innovation, Early Researcher Award. MMD wurde von einem CIHR-Trainings-Programm in der Reproduktion, frühe Entwicklung und die Auswirkungen auf die Gesundheit (REDIH) Graduate Scholarship unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oocyte Collection
Hyaluronidase Sigma H4272
Acidic Tyrode Sigma T1788
Proteinase K Sigma P5568
10% IGEPAL Bioshop NON999.500
Lysis Solution
Tris pH 7.5 Bioshop TRS001.5
LiCl Sigma L9650
EDTA pH 8.0 Sigma E5134
LiDS Bioshop LDS701.10
DTT Invitrogen P2325
SDS Lysis Buffer
TE pH 7.5 Bioshop(Tris)Sigma (EDTA) TRS001.5 E5134
10% SDS Bioshop SDS001.500
Bisulfite Conversion
Sodium Hydroxide Sigma S8045
Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) Sigma 243973
Hydroquinone Sigma H9003
Low Melting Point (LMP) Agarose Sigma A9414
Mineral Oil Sigma M8410
M2 Medium Sigma M7167
GIBCO Distilled water Invitrogen 15230-196
Autoclaved double distilled (dd) water
PCR
Illustra Hot Start Mix RTG GE Healthcare 28-9006-54
240 ng/ml yeast tRNA Invitrogen 15401-011
Inner and outer nested primers Sigma
Ligation
Promega pGEM-T Easy Vector Fisher Scientific A1360
TA Cloning
Competent E.coli cells Zymo Research Corp. T3009
Equipment
Dissecting Microscope
70 °C and 90 °C Heat Blocks
37 °C and 50 °C Waterbaths (42 °C for transformations)
Rocker
PCR machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
  2. Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
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Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese
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Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. W. Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis. J. Vis. Exp. (64), e4046, doi:10.3791/4046 (2012).More

Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. W. Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis. J. Vis. Exp. (64), e4046, doi:10.3791/4046 (2012).

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